專利名稱：編碼黃酮合酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過基因工程技術(shù)控制和利用黃酮的生物合成，黃酮對植物中花的顏色，防紫外線的保護作用，與微生物的共生等有影響。更具體地，本發(fā)明涉及編碼蛋白質(zhì)的基因及其應(yīng)用，所述蛋白質(zhì)具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
“類黃酮”是具有C6-C3-C6碳骨架的一組化合物的通稱，它們廣泛分布于植物細胞中。已知類黃酮具有吸引昆蟲和其它傳粉者的功能，可保護植物免受紫外線的侵襲，并參與與土壤微生物的相互作用(BioEssays，16(1994)，Koes等，p123；Trends in Plant Science，1(1997)，Shirley，B.W.，p.377)。
在類黃酮中，黃酮在植物與微生物的相互作用中起著重要作用，尤其是在豆科植物中更是如此，其中它們參與了與豆科細菌共生的起始步驟(植物細胞，7(1995)，Dixon和Paiva，p.1085；植物病理學(xué)年評，33(1995)，Spaink，p.345)?；ò曛械狞S酮在被昆蟲識別方面起作用并可用作輔色素而與花青苷形成復(fù)合物(Gendai Kagaku，(May，1998)，Honda和Saito，p.25；Prog.Chem.Org.Natl.Prod.，52(1987)，Goto，T.，p.114)。已知當(dāng)黃酮與花青苷形成復(fù)合物時，花青苷的吸光度最大值往較長的波長偏移，即往藍色方向偏移。
已廣泛研究了類黃酮的生物合成途徑(植物細胞，7(1995)，Holton和Cornish，p.1071)，已分離出參與花青素3-葡糖苷和黃酮醇生物合成的所有酶的基因。然而，尚未分離出參與黃酮生物合成的基因。合成黃酮的酶包括依賴于2-氧化戊二酸的屬于雙加氧酶家族的酶(黃酮合酶I)和屬于細胞色素P450家族的單加氧酶(黃酮合酶II)。這些酶是沒有結(jié)構(gòu)同源性的完全不同的酶。
據(jù)報道，在歐芹中，依賴于2-氧化戊二酸的雙加氧酶催化由柚苷配基(一種黃烷酮)生產(chǎn)芹菜苷配基(一種黃酮)的反應(yīng)(Z.Naturforsch.，36C(1981)，Britsch等，p.742；Arch.Biochem.Biophys.，282(1990)，Britsch，p.152)。已知其它類型的黃酮合酶II存在于金魚草(Z.Naturforsch.，36C(1981)，Stotz和Forkmann，p.737)和大豆(Z.Naturforsch.，42C(1987)，Kochs和Grisebach，p.343；Planta，171(1987)，Kochs等，p.519)中。最近，有人報道了大丁草花瓣中的基因座和黃酮合酶II活性之間的相關(guān)性(植物化學(xué)，49(1998)，Martens和Forkmann，p.1953)。然而，無人報道已分離出黃酮合酶I和II的基因或已高度純化了黃酮合酶II。
研究了細胞色素P450蛋白的特性，該蛋白質(zhì)具有甘草二酮-合成活性，當(dāng)用誘發(fā)劑處理經(jīng)培養(yǎng)的甘草(Glycyrrhiza echinata)細胞時可誘導(dǎo)該活性。據(jù)信該蛋白質(zhì)可催化甘草根亭配基(其為5-脫氧黃烷酮)第2位的羥化，接著非酶促打開半縮醛環(huán)，產(chǎn)生甘草二酮(植物生理學(xué)，105(1994)，Otani等，p.1427)。為了克隆甘草二酮合酶，由經(jīng)誘導(dǎo)劑處理的甘草培養(yǎng)細胞制備cDNA文庫，克隆出8個編碼細胞色素P450的基因片斷(植物科學(xué)，126(1997)，Akashi等，p.39)。
由這些片斷得到2個不同的全長cDNA序列，各編碼細胞色素P450，直至那時它們?nèi)允俏粗?。具體地說，它們是CYPGe-3(細胞色素P450 No.CYP81E1)和CYPGe-5(細胞色素P450 No.CYP93B1，下文稱之為CYP93B1)(植物生理學(xué)，115(1997)，Akashi等，p.1288)。通過在使用培養(yǎng)的昆蟲細胞的系統(tǒng)中進一步表達CYP93B1 cDNA，證實該基因編碼的蛋白質(zhì)可催化由甘草根亭配基(一種黃烷酮)合成甘草二酮的反應(yīng)，和由柚苷配基(一種黃烷酮)生產(chǎn)2-羥基柚苷配基的反應(yīng)。
通過用10％鹽酸進行酸處理(室溫，2小時)使2-羥基柚苷配基轉(zhuǎn)變?yōu)榍鄄塑张浠?一種黃酮)。通過使圣草酚與表達CYP93B1的酵母的微粒體反應(yīng)，接著進行酸處理可將圣草酚轉(zhuǎn)變?yōu)樘冱S菌素(一種黃酮)。由此闡明細胞色素P450基因編碼黃烷酮2-羥化酶活性的功能(FEBS Lett.，431(1998)，Akashi等.，p.287)。這里，由柚苷配基生產(chǎn)芹菜苷配基需要CYP93B1以及另一個未知的酶，由此得出的結(jié)論是總共需要兩種酶。
然而，目前尚未鑒定出具有不經(jīng)酸處理直接由黃烷酮(如柚苷配基)合成黃酮(如芹菜苷配基)之活性的酶。因此，盡管黃酮在植物中具有多種功能，但控制植物中的黃酮生物合成和改善黃酮參與的生物功能，如花的顏色的技術(shù)尚未見報道。與將參與由黃烷酮合成黃酮的兩種酶的基因?qū)胫参锛毎啾?，本身可催化由黃烷酮合成黃酮的酶的發(fā)現(xiàn)，該酶基因的獲得，以及將該基因?qū)胫参镏芯哂懈鼜姷目刹僮餍院凸I(yè)實用性。
另外，在天然含有大量黃酮的花瓣中，預(yù)期通過反義方法或共抑制法控制黃酮合酶基因的表達也能改變花的顏色。另外，根據(jù)黃酮的抗細菌活性及其與土壤微生物的相互作用而在適當(dāng)器官中表達黃酮合酶基因可增加植物抗細菌活性并因促進了與根際微生物的共生關(guān)系而改善豆科植物的固氮能力，并能獲得防紫外線和光照的保護作用。
因此，本發(fā)明提供了編碼可直接由黃烷酮合成黃酮的蛋白質(zhì)的基因，該基因具體為編碼黃酮合酶II的基因，黃酮合酶II可通過單個酶反應(yīng)催化由黃烷酮合成黃酮的反應(yīng)(下文稱之為“黃酮合酶II”)。
更具體地，本發(fā)明提供了編碼P450蛋白的基因，所述蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID NO2，4或8所示的氨基酸序列，并具有由黃烷酮合成黃酮的活性，還提供了編碼具有經(jīng)修飾的氨基酸序列但仍具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)的基因，其中所述修飾是通過在上述氨基酸序列中添加或缺失一個或多個氨基酸和/或用不同氨基酸取代完成的。
本發(fā)明還提供了編碼具有與序列表中SEQ ID NO2，4或8所示氨基酸序列至少有55％同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
本發(fā)明還提供了編碼具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)的基因，該基因在5×SSC，50℃的條件下可與序列表中SEQ ID NO1，3或7所示核苷酸序列的全部或部分雜交。
本發(fā)明還提供了載體，尤其是表達載體，其含有上述任一種基因。
本發(fā)明還提供了被上述載體轉(zhuǎn)化的宿主。
本發(fā)明還提供了由上述任一種基因編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)上述蛋白質(zhì)的方法，所述方法的特征在于培養(yǎng)上述宿主并從宿主中收集具有黃酮合成活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了其中導(dǎo)入了上述任一種基因的植物，或表現(xiàn)出相同特性的植物后代或其組織，如切花。
本發(fā)明還提供了使用上述基因改變類黃酮的量和組成的方法；使用上述基因改變黃酮量的方法；使用上述基因改變花的顏色的方法；使用上述基因使花的顏色變藍的方法；使用上述基因使花的顏色更紅的方法；使用上述基因修飾植物的光敏性的方法；使用上述基因控制植物和微生物之間的相互作用的方法。
A和B加入表達CYP93B1之酵母的粗酶級分得到的結(jié)果。
C和D加入表達TFNS5之酵母的粗酶級分得到的結(jié)果。
A和C加入酶級分得到的直接產(chǎn)物。
BA反應(yīng)之后通過酸處理得到的產(chǎn)物。
DC反應(yīng)之后通過酸處理得到的產(chǎn)物。
實施本發(fā)明的具體方案由甘草CYP93B1基因編碼的黃烷酮2-羥化酶由底物黃烷酮產(chǎn)生了2-羥基黃烷酮，通過酸處理將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酮。本發(fā)明人認為通過使用得自甘草的cDNA CYP93B1篩選例如含有大量黃酮的花的cDNA文庫，從而得到編碼具有直接由底物黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)的cDNA，即可得到編碼黃酮合酶II的基因(這是本發(fā)明的目的之一)。
根據(jù)本發(fā)明，使用得自甘草的cDNA CYP93B1為探針篩選含有大量黃酮的金魚草的cDNA文庫，可得到編碼新細胞色素P450的cDNA(見實施例1)。以此方法得到的金魚草cDNA ANFNS2和甘草CYP93B1 cDNA被用作混合探針以從蝴蝶草花瓣的cDNA文庫中得到編碼新型細胞色素P450的cDNA TFNS5(見實施例2)。
在酵母中表達得自蝴蝶草的cDNA并與底物柚苷配基(一種黃烷酮)反應(yīng)，結(jié)果無需經(jīng)酸處理即可產(chǎn)生黃酮芹菜苷配基而不是2-羥基柚苷配基(見實施例3)。換句話說，該酶可直接由黃烷酮產(chǎn)生黃酮，而無需經(jīng)酸處理，經(jīng)證實，其基因為以前從未克隆過的黃酮合酶II基因。由實施例1中得自金魚草的ANFNS2編碼的氨基酸序列與TFNS5編碼的黃酮合酶II具有77％的高同一性，并且表現(xiàn)出黃酮合酶II的酶活性(實施例4)。另外，由于得自紫蘇的cDNA所編碼的氨基酸序列與TFNS5和ANFNS2所編碼的氨基酸序列的同一性分別高達76％和75％(實施例8)，推測由此cDNA編碼的蛋白質(zhì)也具有與TFNS5和ANFNS2所編碼的黃酮合酶相同的酶活性。
本發(fā)明的基因可以是例如編碼序列表中SEQ ID NO2，4或8所示氨基酸序列的基因。然而，已知其氨基酸序列經(jīng)添加或缺失多個氨基酸和/或被不同氨基酸取代而被修飾的蛋白質(zhì)可保持與原始蛋白質(zhì)相同的酶活性。因此，具有序列表中SEQ ID NO2，4或8所示氨基酸序列，但其中的氨基酸序列經(jīng)添加或缺失一個或多個氨基酸和/或被不同氨基酸取代而被修飾的蛋白質(zhì)，以及編碼所述蛋白質(zhì)的基因也包含在本發(fā)明中，只要它們保持直接由黃烷酮生產(chǎn)黃酮之活性即可。
本發(fā)明還涉及具有SEQ ID NO1，3或7所示核苷酸序列和編碼本文所述氨基酸序列之核苷酸序列，或在例如5×SSC，50℃的條件下可與所述核苷酸序列的部分雜交的基因，條件是它們能編碼具有由黃烷酮生產(chǎn)黃酮之活性的蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)碾s交溫度隨核苷酸序列和核苷酸序列長度的不同而不同，例如，當(dāng)所用探針是含有編碼6個氨基酸的18個堿基長的DNA片斷時，優(yōu)選溫度不超過50℃。
所述雜交選擇的基因可以是天然的，例如得自如金魚草，蝴蝶草或紫蘇的植物基因；也可以是另一種植物的基因，如龍膽，馬鞭草，菊，鳶尾草等的基因。雜交所選擇的基因可以是cDNA或基因組DNA。
本發(fā)明還涉及編碼具有與序列表中SEQ ID NO2，4或8所示氨基酸序列至少有55％，優(yōu)選至少70％，如80％或以上甚至90％或以上同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
通過如實施例所述篩選cDNA文庫可得到具有天然核苷酸序列的基因?？墒褂镁哂刑烊缓塑账嵝蛄械腄NA作為起始物質(zhì)，通過常規(guī)的定點誘變或PCR法合成編碼具有經(jīng)修飾的氨基酸序列的酶的DNA。例如，通過用限制性酶處理天然cDNA或基因組DNA，然后用作定點誘變或PCR(使用的引物中導(dǎo)入了所需的突變)的模板，即可得到其中導(dǎo)入所需修飾的DNA片斷。然后可將已導(dǎo)入突變的DNA片斷與編碼靶酶另一部分的DNA片斷連接。
或者，為了得到編碼由縮短的氨基酸序列組成的酶的DNA，例如，可用所需的限制性核酸內(nèi)切酶切割編碼長于目的氨基酸序列的氨基酸序列(如全長氨基酸序列)的DNA，如果所得DNA片斷不編碼完整的靶氨基酸序列，可將該片斷與含有其余序列的合成DNA連接。
可在使用大腸桿菌或酵母的表達系統(tǒng)中表達所得的基因，檢測其酶活性以證實所得基因編碼黃酮合酶。通過表達基因，也可得到黃酮合酶蛋白作為基因產(chǎn)物?；蛘?，甚至可以使用SEQ ID NO2，4或8所示的全部或部分氨基酸序列的抗體來得到黃酮合酶蛋白，可使用這種抗體克隆另一種生物中的黃酮合酶基因。
因此，本發(fā)明還涉及含有上述基因的重組載體，尤其是表達載體，并涉及被這些載體轉(zhuǎn)化的宿主。所用宿主可以是原核或真核生物。常用作宿主的原核生物的例子包括埃希氏菌屬的細菌，如大腸桿菌，和芽胞桿菌屬的微生物，如枯草芽孢桿菌。
可以使用的真核宿主的例子包括低等真核生物，如真核微生物(如真菌門中的酵母和絲狀真菌)。至于酵母，可提及的是屬于糖酵母屬的微生物，如釀酒酵母，至于絲狀真菌，可提及的是屬于曲霉屬的微生物，如米曲霉和黑曲霉和青霉屬的微生物。也可使用動物細胞和植物細胞，動物細胞可以是小鼠，倉鼠，猴或人的細胞系。也可使用昆蟲細胞，如家蠶細胞或成年家蠶本身。
本發(fā)明的表達載體可包括表達調(diào)節(jié)區(qū)，如啟動子和終止子，復(fù)制起點等，這取決于它們欲導(dǎo)入的宿主類型?？梢允褂玫募毦磉_載體啟動子的例子包括常規(guī)的啟動子，如trc啟動子，tac啟動子，lac啟動子等?？梢允褂玫慕湍竼幼拥睦影ǜ视腿?3-磷酸脫氫酶啟動子，PH05啟動子等。可以使用的絲狀真菌啟動子的例子包括淀粉酶啟動子，trpC等?？梢允褂玫膭游锛毎拗鲉幼拥睦影ú《締幼?，如SV40早期啟動子，SV40晚期啟動子等。
根據(jù)常規(guī)方法，使用限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶等可以制備表達載體。用表達載體轉(zhuǎn)化宿主也可根據(jù)常規(guī)方法進行。
可以培養(yǎng)，栽培或發(fā)酵被表達載體轉(zhuǎn)化的宿主，可根據(jù)常規(guī)方法，如過濾，離心分離，細胞破碎，凝膠過濾層析，離子交換層析等從培養(yǎng)產(chǎn)物中回收和純化靶蛋白質(zhì)。
本說明書全文討論了得自金魚草，蝴蝶草和紫蘇的黃酮合酶II，該酶能直接由黃烷酮合成黃酮，已知細胞色素P450基因構(gòu)成了超家族(DNA和細胞生物學(xué)，12(1993)，Nelson等，p.1)，相同家族中的細胞色素P450蛋白的氨基酸序列具有40％或更高的同一性，而亞家族中的細胞色素P450蛋白的氨基酸序列具有55％或更高的同一性，它們的基因能互相雜交(Pharmacogenetics，6(1996)，Nelson等，p.1)。
例如，首次從矮牽牛屬植物中分離出類黃酮3’，5’-羥化酶的基因，所述酶是細胞色素P450的一種并參與類黃酮合成途徑(自然，366(1993)，Holton等，p.276)，使用矮牽牛類黃酮3’，5’-羥化酶基因作為探針易于從龍膽(植物細胞生理學(xué)，37(1996)，Tanaka等，p.711)，草原龍膽，風(fēng)鈴草(WO 93/18155(1993)，Kikuchi等)，薰衣草，蝴蝶草和馬鞭草(Shokubutsu no Kagaku Chosetsu，33(1998)，Tanaka等，p.55)中分離出類黃酮3’，5’-羥化酶基因。
因此，本發(fā)明的得自金魚草，蝴蝶草或紫蘇的能直接由黃烷酮合成黃酮的黃酮合酶II基因的全部或部分可用作探針以從不同種植物中得到能直接由黃烷酮合成黃酮的黃酮合酶II基因。另外，通過純化本說明書中所述的得自金魚草，蝴蝶草或紫蘇的能直接由黃烷酮合成黃酮的黃酮合酶II，通過常規(guī)方法得到抗該酶的抗體，即可得到與抗體反應(yīng)的不同黃酮合酶II蛋白，并得到編碼這些蛋白質(zhì)的基因。
因此，本發(fā)明并不僅限于得自金魚草，蝴蝶草或紫蘇的能直接由黃烷酮合成黃酮的黃酮合酶II基因，還涉及得自多種其它植物的能直接由黃烷酮合成黃酮的黃酮合酶II。除了本文所述的金魚草，蝴蝶草和紫蘇外，所述黃酮合酶II基因的來源還可以是龍膽，馬鞭草，菊，鳶尾草，鴨跖草，矢車菊，鼠尾草，喜林草等，但本發(fā)明的范圍不限于這些植物。
本發(fā)明還涉及通過導(dǎo)入一個或多個能直接由黃烷酮合成黃酮的黃酮合酶II基因使顏色被修飾的植物，以及植物的后代或其組織，所述組織也可以是切花的形式。通過使用本發(fā)明的黃酮合酶II或其已被克隆的基因，可以在只產(chǎn)生很少黃酮或根本不產(chǎn)生黃酮的植物種或變種中產(chǎn)生黃酮。通過在花瓣中表達一個或多個黃酮合酶II基因，可以增加花瓣中黃酮的量，從而使花的顏色往例如，藍色方向轉(zhuǎn)變。
相反，通過抑制黃酮在花瓣中合成，可以使花的顏色往例如，紅色方向轉(zhuǎn)變。然而，黃酮對花色的作用很大，因此花色的改變并不局限于上述類型。就目前的技術(shù)水平而言，可以將基因?qū)胫参锊⒁越M成型或組織特異性的方式表達基因，但是，也可以通過反義法或共抑制法抑制靶基因的表達。
可轉(zhuǎn)化的植物的例子包括玫瑰，菊，麝香石竹，金魚草，仙客來，紅門蘭，草原龍膽，香雪蘭，扶郎花，唐菖蒲，滿天星，伽藍菜，百合，天竺葵，老鶴草，碧冬茄，蝴蝶草，郁金香，水稻，大麥，小麥，油菜子，馬鈴薯，番茄，白楊，香蕉，桉樹，甜馬鈴薯，大豆，苜蓿，羽扇豆，玉米等，但并不限于這些植物。
由于黃酮具有如上所述的多種生理學(xué)活性，它們可賦予植物新的生理學(xué)活性或經(jīng)濟價值。例如，通過在根中表達產(chǎn)生黃酮的基因，可以促進對該植物有利的微生物的生長，從而促進植物生長。也可以合成在人，動物或昆蟲中表現(xiàn)出生理學(xué)活性的黃酮。
實施例1.克隆金魚草黃酮合酶II基因從約5g黃色蝴蝶金魚草的幼芽(商品名為Sakata-no-Tane，KK)中提取RNA，通過Oligotex得到polyA+RNA。根據(jù)Stratagene(Stratagene操作手冊，Revision # 065001)推薦的方法，將polyA+RNA用作模板，使用λZAPII cDNA文庫合成試劑盒(Stratagene)制備cDNA文庫。使用全長cDNA CYP93B1為探針篩選cDNA文庫。根據(jù)廠商推薦的方法，在低嚴緊條件下使用DIG-DNA-標(biāo)記和檢測試劑盒(Boehringer)進行陽性克隆的篩選和檢測。
具體地說，42℃下，使用雜交緩沖液(5×SSC，30％甲酰胺，50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，1％SDS，2％阻斷試劑(Boehringer)，0.1％月桂?；“彼?，80微克/ml鮭精DNA)預(yù)雜交2小時，然后加入DIG標(biāo)記的探針，將混合物放置過夜。65℃下，用含有1％SDS的5×SSC洗滌溶液將膜浸洗1.5小時。得到一個陽性克隆，將其稱為ANFNS1。通過測定ANFNS1之5’末端的核苷酸序列，預(yù)期ANFNS1編碼與甘草CYP93B1編碼的黃烷酮2-羥化酶具有高同一性的序列，推測其編碼功能類似于黃烷酮2-羥化酶的P450。
然而，與CYP93B1編碼的黃烷酮2-羥化酶的氨基酸序列比較的結(jié)果表明ANFNS1的cDNA不是全長的cDNA，缺乏與由起始的甲硫氨酸起的約65個氨基酸殘基相對應(yīng)的部分。因此，將ANFNS1 cDNA用作探針以再次篩選金魚草cDNA文庫，得到據(jù)信包括全長氨基酸序列的cDNA(ANFNS2)。由所得的ANFNS2編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸水平上與金魚草CYP93B1編碼的黃烷酮2-羥化酶具有53％同一性。ANFNS2的核苷酸序列示于SEQ ID NO.1，由其推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO.2。
實施例2.克隆蝴蝶草黃酮合酶II基因從約2g蝴蝶草品種(品種名Sunrenive，根據(jù)種苗法的品種登記申請?zhí)枮?433，Suntory有限公司)的幼芽中提取RNA，通過Oligotex得到polyA+RNA。如實施例1所述，根據(jù)Stratagene推薦的方法，將polyA+RNA用作模板，使用λZAPII cDNA文庫合成試劑盒(Stratagene)制備cDNA文庫。使用上述CYP93B1 cDNA和ANFNS1 cDNA的混合物為探針篩選cDNA文庫。按實施例1所述，在低嚴緊條件下進行陽性克隆的篩選和檢測。
得到一個陽性克隆，將其稱為TFNS5。通過測定TFNS5 cDNA完整的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)TFNS5 cDNA編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸水平上與金魚草CYP93B1編碼的黃烷酮2-羥化酶具有52％同一性。TFNS5 cDNA也與實施例1所得的金魚草cDNA ANFNS2編碼的蛋白質(zhì)具有高達77％的同一性。測定的核苷酸序列示于SEQ ID NO.3，由其推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO.4。
實施例3.在酵母中表達蝴蝶草黃酮合酶II基因進行下列實驗以檢測實施例2所得蝴蝶草cDNA TFNS5編碼的蛋白質(zhì)的酶活性。修飾基因翻譯區(qū)域以外的部分以導(dǎo)入限制性酶位點，制備有義引物(5’-AAATAGGATCCA AGCatgGACACAGTCTTAA-3’；下劃線＝BamHI位點；小寫字母起始密碼子)(SEQ ID NO5)和反義引物(5’-CCCTTCTAGAtcaAGCACCCGATATTGTGGCCGGG-3’；下劃線＝XbaI位點；小寫字母終止密碼子)(SEQ ID NO6)。聯(lián)合使用上述引物和KOD聚合酶(Toyobo)進行PCR反應(yīng)。PCR條件是98℃1分鐘；98℃15秒，55℃10秒，74℃30秒共20個循環(huán)；接著74℃10分鐘。
將所得PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pBluescript KS(-)(Stratagene)的EcoRV位點。用限制性酶BamHI和XbaI消化后導(dǎo)入酵母表達載體pYES2(Invitrogen)的BamHI-XbaI位點，然后將所得質(zhì)粒導(dǎo)入BJ2168酵母(Nihon Gene)。通過Akashi等(FEBS Lett.，431(1998)，Akashi等，p.287)所述的方法測定酶活性。30℃，在20ml選擇培養(yǎng)基(6.7mg/ml無氨基酸的酵母含氮堿基(Difco)，20mg/ml葡萄糖，30微克/ml亮氨酸，20微克/ml色氨酸和5mg/ml酪蛋白氨基酸)中將轉(zhuǎn)化的酵母細胞培養(yǎng)24小時。
離心收集酵母細胞之后，30℃，在表達培養(yǎng)基(10mg/ml酵母提取物，10mg/ml蛋白胨，2微克/ml氯高鐵血紅素，20mg/ml半乳糖)中將收集的酵母細胞培養(yǎng)48小時。收集酵母細胞之后，通過懸浮在水中并收集細胞以進行洗滌。用玻璃珠破碎細胞10分鐘，然后以8000g的轉(zhuǎn)速離心細胞10分鐘，以15,000g的轉(zhuǎn)速進一步離心上清液10分鐘以得到粗酶級分。
30℃下，將15微克(R，S)-柚苷配基(溶解于30微升2-甲氧乙醇中)，1ml粗酶溶液和1mM NADPH的混合物(總反應(yīng)混合物體積1.05ml)反應(yīng)2小時。通過加入30微升醋酸終止反應(yīng)之后，加入1ml乙酸乙酯并混合。離心后，用蒸發(fā)器干燥乙酸乙酯層，將殘留物質(zhì)溶解于100微升甲醇中并用HPLC進行分析。根據(jù)Akashi等所述的方法進行分析。酸處理包括將蒸發(fā)器干燥的樣品溶解于150微升含有10％鹽酸的乙醇中，攪拌30分鐘。用1.3ml水稀釋，加入800微升乙酸乙酯，混合，離心，回收乙酸乙酯層，然后干燥，溶解于200微升甲醇中并用HPLC進行分析。
表達甘草CYP93B1的酵母由柚苷配基產(chǎn)生了2-羥基柚苷配基，而未產(chǎn)生芹菜苷配基(


圖1A)，只有通過用酸處理反應(yīng)混合物才可由2-羥基柚苷配基產(chǎn)生芹菜苷配基(
圖1B)。相反，表達蝴蝶草TFNS5的酵母由柚苷配基產(chǎn)生了芹菜苷配基，而無需用酸處理反應(yīng)混合物(
圖1C)，這表明TFNS5編碼黃酮合酶II。
實施例4.在酵母中表達金魚草黃酮合酶II基因?qū)⑼ㄟ^用BamHI和SphI消化ANFNS2 cDNA得到的約1400bp DNA片斷，通過用SphI和BamHI消化ANFNS2 cDNA得到的約350bp DNA片斷以及用BamHI和XhoI消化的pYES2連接得到質(zhì)粒，通過如實施例3所述的方法將得到的質(zhì)粒導(dǎo)入酵母。通過如實施例3所述的方法，使用所得的重組酵母細胞測定黃酮合成活性。表達金魚草ANFNS2的酵母未經(jīng)酸處理即可產(chǎn)生芹菜苷配基，這表明ANFNS2編碼黃酮合酶II。
實施例5.構(gòu)建植物表達載體構(gòu)建植物表達載體以將實施例2所得的蝴蝶草cDNA TFNS5導(dǎo)入植物。用SacI消化pBE2113-Gus(植物細胞生理學(xué)，37(1996)，Mitsuhara等，p.49)之后，使用平端化試劑盒(Takara)使其末端成為平端，然后插入XhoI接頭(Toyobo)。用HindIII和EcoRI消化所得質(zhì)粒，回收約3kb DNA片斷，將DNA片斷連接至二元載體pBINPLUS的HindIII/EcoRI位點以制備pBE2113’。按van Engelen等(轉(zhuǎn)基因研究，4(1995)，van Engelen等，p.288)報道的方法修飾二元載體Bin19(核酸研究，12(1984)，Bevan，p.8711)可得到上述載體pBINPLUS，使用農(nóng)桿菌細胞將基因?qū)胫参锏姆椒ㄖ袕V泛使用了載體Bin19。
通過用BamHI/XhoI裂解從SK(-)載體上切下TFNS5 cDNA，將所得的約1.7kb的片斷連接至上述二元載體pBE2113’的BamHI/XhoI位點。所得構(gòu)建體pSPB441在35S花椰菜花葉病毒啟動子的控制之下，在有義方向上表達TFNS5 cDNA，所述啟動子具有兩個重復(fù)的增強子序列(植物細胞生理學(xué)，37(1996)，Mitsuhara等，p.49)。
實施例6.改變蝴蝶草花的顏色根據(jù)Aida等(繁殖科學(xué)，45(1995)，Aida等，p.71)的方法，用實施例5構(gòu)建的pSPB441轉(zhuǎn)化蝴蝶草品種(品種名Sunrenive，根據(jù)種苗法的品種登記申請?zhí)枮?433，Suntory有限公司)。95％以上所得轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出花色的改變，由親本植株的深紫色變?yōu)闇\紫色。測定4個花瓣中左和右花瓣的顏色。根據(jù)皇家園藝會的顏色圖，親本植株花瓣的顏色為89A號，但轉(zhuǎn)化體普遍的花瓣顏色為82C，87D，87C，88D，91A等。這些結(jié)果表明將TFNS5導(dǎo)入植物會改變花色。
在轉(zhuǎn)化的個體中，黃酮的量為宿主的1/5至1/10，而花青苷的量降低至宿主的約1/3。還檢測到在宿主中未檢測到的黃烷酮(柚苷配基，圣草酚和五羥黃烷酮)，它是黃酮生物合成的前體。
實施例7.在矮牽牛中表達黃酮合酶根據(jù)Napoli等的方法(植物細胞，2，(1990)，Napoli等，p.279)，將質(zhì)粒pSPB441導(dǎo)入矮牽牛品種(品種名Revolution Violet Mini，根據(jù)種苗法的品種登記申請?zhí)枮?217，Suntory有限公司)。所得轉(zhuǎn)化體中有2株表現(xiàn)出花色變化，花色較親本植株淺。根據(jù)皇家園藝會的顏色圖，親本植株花色為88A，而轉(zhuǎn)化體的花色為87A。在親本植株中未檢測到黃酮，但在轉(zhuǎn)化植株中檢測到黃酮藤黃菌素。
實施例8.克隆紫蘇黃酮合酶II基因使用實施例1所述的方法，篩選根據(jù)Gong等(植物分子生物學(xué)，35(1997)，Gong等，p.915)的方法，使用λgt10(Stratagene)為載體由紅紫蘇(Perilla frutescens)葉制備的cDNA文庫。根據(jù)Gong等(植物分子生物學(xué)，35(1997)，Gong等，p.915)的方法進行培養(yǎng)，DNA制備和所得噬菌體克隆#3的亞克隆，測定核苷酸序列并示于SEQ IDNO7。由該核苷酸序列編碼的推定氨基酸序列示于SEQ ID NO8。該氨基酸序列與TFNS5和ANFNS2的同一性分別為76％和75％。與CYP93B1的同一性為52％。
實施例9.在酵母中表達紫蘇黃酮合酶II基因通過實施例3所述的方法，將實施例8所得的噬菌體克隆#3用作PCR(使用λArm引物(Stratagene))模板。將擴增的DNA片斷亞克隆至pBluescript KS(-)的EcoRV位點。選擇在pBluescript KS(-)的SalI位點具有紫蘇黃酮合酶II cDNA起始密碼子的克隆，將其稱為pFS3。測定pFS3 cDNA插入物的核苷酸序列，進行PCR以證實不存在錯誤。
將通過用SalI和XbaI消化pFS3得到的約1.8kb的DNA片斷與已用XhoI和XbaI消化的pYES2(實施例3)連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pYFS3。然后通過實施例3所述的方法將所得質(zhì)粒導(dǎo)入BJ2168酵母。當(dāng)通過實施例3所述的方法測定該重組酵母的黃酮合酶活性時，證實了由柚苷配基產(chǎn)生了芹菜苷配基，表明紫蘇噬菌體克隆#3 cDNA編碼具有黃酮合酶II活性的蛋白質(zhì)。
工業(yè)實用性通過將本發(fā)明的cDNA與適當(dāng)植物表達載體連接，并將其導(dǎo)入植物中以表達或抑制黃酮合酶的表達，即可改變花的顏色。另外，通過不僅在花瓣中還在整個植物或其適當(dāng)器官中表達黃酮合酶基因，可以增加抗植物微生物的抗性，或者通過促進與根際微生物的關(guān)系而改善豆科植物的固氮能力，以及改善植物防紫外線和光照的保護性作用。
序列表<110>SUNTORY LIMITED<120>編碼黃酮合成酶的基因<130>993009<160>8<210>1<211>1724<212>DNA<213>金魚草<220><223>編碼具有直接將黃烷酮轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酮之活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列<400>1gctttacaca cacacacaca cacacacaca caaacaaaa atg tct aca ctt gtc 54Met Ser Thr Leu Val1 5tac agc aca ctc ttc atc ctc tca acc ctc ctc ctc acc ctc cta acc102Tyr Ser Thr Leu Phe Ile Leu Ser Thr Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr10 15 20cgc acc cgc cgc aag acc cgc ccg ccc ggc cca tta gcc ctc ccc tta150Arg Thr Arg Arg Lys Thr Arg Pro Pro Gly Pro Leu Ala Leu Pro Leu25 30 35ata ggc cac tta cac ctc ctc ggc cca aag ctc cac cac acc ttc cac198Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Lys Leu His His Thr Phe His40 45 50caa ttc tcc caa cgc tac ggc ccg ctc atc cag ctc tac ctc ggc tcc246Gln Phe Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Ile Gln Leu Tyr Leu Gly Ser55 60 65gtc cca tgc gtc gtc gct tcc acg ccc gaa ctc gcc cgc gaa ttc ctc 294Val Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Glu Phe Leu70 75 80 85aag acg cac gaa ctc gac ttc tcg tcc cgc aag cac tcc acc gcc atc 342Lys Thr 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Phe Leu Leu Ser1 5 10gcc gcc gtg gtc cgc tcc gtt ctg gat cga aaa cgc ggg cgg ccg ccc 101Ala Ala Val Val Arg Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro15 20 25tac cct ccc ggg ccg ttc cct ctt ccc atc atc ggc cac tta cac ctc 149Tyr Pro Pro Gly Pro Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu30 35 40ctc ggg ccg aga ctc cac caa acc ttc cac gat ctg tcc caa cgg tac 197Leu Gly Pro Arg Leu His Gln Thr Phe His Asp Leu Ser Gln Arg Tyr45 50 55ggg ccc tta atg cag ctc cgc ctc ggg tcc atc cgc tgc gtc att gct 245Gly Pro Leu Met Gln Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala60 65 70 75gcc tcg ccg gag ctc gcc aag gaa tgc ctc aag aca cac gag ctc gtc 293Ala Ser Pro Glu Leu Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val80 85 90ttc tcc tcc cgc aaa cac tcc acc gcc att gat atc gtc acc tac gat 341Phe Ser Ser Arg Lys His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp95 100 105tca tcc ttc gct ttc tct ccc tac ggg cct tac tgg aaa ttc atc aag 389Ser Ser Phe Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys110 115 120aaa 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70 75 80Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val Phe Ser Ser Arg Lys85 90 95His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala Phe100 105 110Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr115 120 125Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ala His Phe Gln Pro Ile Arg Thr130 135 140Leu Glu Val Lys Ser Phe Leu Gln Ile Leu Met Arg Lys Gly Glu Ser145 150 155 160Gly Glu Ser Phe Asn Val Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser Asn165 170 175Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys Ser Glu Thr Glu Ser180 185 190Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln Ile Phe195 200 205Gly Glu Phe Asp Val Ser Asp Ile Ile Trp Leu Cys Lys Asn Phe Asp210 215 220Phe Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile Gln Arg Arg Tyr Asp225 230 235 240Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Thr Asp Arg Glu Lys Gln Arg Arg Thr245 250 255His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Lys Asp Phe Leu Asp Met260 265 270Phe Leu Asp Ile Met Glu Ser Gly Lys Ala Glu Val Lys Phe Thr Arg275 280 285Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe Thr Ala Gly Thr Asp290 295 300Thr Thr Ala Ile Val Cys Glu Trp Ala Ile Ala Glu Val Ile Asn Asn305 310 315 320Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Ala Asn Ile Val Gly325 330 335Phe Asp Arg Ile Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Leu340 345 350Gln Ala Leu Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ile Pro Met355 360 365Leu Ala Arg Lys Ser Ile Ser Asp Cys Val Ile Asp Gly Tyr Met Ile370 375 380Pro Ala Asn Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp Ser Met Gly Arg Asn385 390 395 400Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Pro Thr Ala Phe Gln Pro Glu Arg Phe Leu405 410 415Glu Lys Glu Lys Ala Ala Ile Asp Val Lys Gly Gln His Phe Glu Leu420 425 430Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Leu Leu Ala435 440 445Ile Gln Glu Val Val Ile Ile Ile Gly Thr Met Ile Gln Cys Phe Asp450 455 460Trp Lys Leu Pro Asp Gly Ser Gly His Val Asp Met Ala Glu Arg Pro465 470 475 480Gly Leu Thr Ala Pro Arg Glu Thr Asp Leu Phe Cys Arg Val Val Pro485 490 495Arg Val Asp Pro Leu Val Val Ser Thr Gln500 50權(quán)利要求
1.基因，其編碼具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的基因，其中所述基因是編碼黃酮合酶II的基因。
3.權(quán)利要求1或2的基因，其編碼具有序列表之SEQ ID NO2，4或8所示氨基酸序列并顯示出由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)，或編碼具有下述氨基酸序列之一種并具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列已通過添加或缺失一個或多個氨基酸和/或用不同氨基酸進行一個或多個取代而被修飾。
4.權(quán)利要求1至3之任一項的基因，其與序列表之SEQ ID NO2，4或8所示氨基酸序列至少具有55％的同一性，并具有由黃烷酮合成黃酮的活性。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的基因，其在5×SSC，50℃下，能與序列表之SEQ ID NO1，3和7任一個所示堿基序列的全部或部分雜交，并且編碼具有由黃烷酮合成黃酮之活性的蛋白質(zhì)。
6.載體，其含有權(quán)利要求1至5中任一項所述的基因。
7.被權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)化的宿主。
8.由權(quán)利要求1至5中任一項所述的基因編碼的蛋白質(zhì)。
9.生產(chǎn)具有黃酮合成活性之蛋白質(zhì)的方法，其特征在于培養(yǎng)或栽培權(quán)利要求7的宿主并從所述宿主中回收所述蛋白質(zhì)。
10.其中已導(dǎo)入權(quán)利要求1至5中任一項所述基因的植物，或表現(xiàn)出相同特性的所述植物的后代或其組織。
11.得自權(quán)利要求10之植物或其具有相同特性的后代的切花。
12.使用權(quán)利要求1至5中任一項所述的基因改變類黃酮組成和/或其量的方法。
13.使用權(quán)利要求1至5中任一項所述的基因改變黃酮的量的方法。
14.使用權(quán)利要求1至5中任一項所述的基因改變花的顏色的方法。
15.使用權(quán)利要求1至5中任一項所述的基因使花的顏色變藍的方法。
16.使用權(quán)利要求1至5中任一項所述的基因使花的顏色變紅的方法。
17.使用權(quán)利要求1至5中任一項所述的基因改變植物光敏性的方法。
18.使用權(quán)利要求1至5中任一項所述的基因控制植物和微生物的相互作用的方法。
全文摘要
從例如金魚草或蝴蝶草中得到的編碼可直接將黃烷酮轉(zhuǎn)變?yōu)辄S酮的酶的DNA及其用途;DNA和所編碼酶的氨基酸序列示于例如SEQ ID NO:1＆2和3＆4。將該基因?qū)胫参镏锌衫绺淖冎参锏幕ㄉ?br> 文檔編號C12N5/10GK1355848SQ00800103
公開日2002年6月26日 申請日期2000年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月29日
發(fā)明者水谷正子, 田中良和, 久住高章, 綾部真一, 明石智義 申請人:三得利株式會社