專利名稱：一種新型的doublecortin樣激酶基因mRNA剪接異構(gòu)體及其在神經(jīng)外胚層起源癌癥的診斷 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的微管相關(guān)蛋白(doublecortin)樣蛋白(DCL)和一 種新型的編碼DCL的mRNA剪接異構(gòu)體。所提供的是編碼新型DCL蛋 白的小鼠和人的核酸序列(RNA和DNA)以及小鼠和人本身的蛋白質(zhì)和 變異的核酸片段和適合于治療和診斷應(yīng)用的異構(gòu)體。發(fā)明進(jìn)一步涉及在腫 瘤治療中調(diào)節(jié)DCL蛋白水平的方法，尤其是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療以及診斷 方法和診斷試劑盒。背景資料作為在兒童中最常見的實(shí)體瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤占所有兒童癌癥中的8-10% (見Leeetal., 2003， Urol. Clin. N.Am.30, 881-890)。根據(jù)在加拿大、德國(guó) 和日本進(jìn)行的人口篩查，每年的發(fā)病率范圍從IO到15例/100，000嬰兒。 神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種異質(zhì)性疾病， 一歲以下的兒童診治后40。/^有一個(gè)非常 好的預(yù)后，其余的年齡較大的兒童和年輕成人盡管給予先進(jìn)的醫(yī)療和手術(shù) 的處理也預(yù)后不佳。對(duì)于中度風(fēng)險(xiǎn)和高度風(fēng)險(xiǎn)的病人，共同的治療是手術(shù) 后化療。然而，徹底消除神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞是很難達(dá)到的。因此，大多數(shù) 病人常常對(duì)常規(guī)和快速治療有耐藥性而復(fù)發(fā)。因此，通過首要治療誘導(dǎo)得 到明顯緩解后，就需要新的治療策略徹底根除少數(shù)尚存的細(xì)胞，以防止復(fù) 發(fā)(Lee et al.， 2003， supra)。腦發(fā)育需要神經(jīng)母細(xì)胞互相配合以及它們分裂，遷移和分化的精確的模 式(Noctor ef a/" 2001， Nature 409, 714-720', Noctor ef a/" 2004, Nat, Neuroscience 7, 136-144)。在這些過程中一個(gè)關(guān)鍵的事件是細(xì)胞骨架的(重 新)組織和(失去)穩(wěn)定，其中包括微管和微管相關(guān)蛋白 (microtubule-associated proteins ， MAPs)。在神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生遷移之前需 要微管和許多MAPs間精確的編排調(diào)控(見Feng and Walsh, 2001, Nat. Rev. Neurosci. 2， 408-416)。雖然涉及神經(jīng)元遷移的因素已經(jīng)明了，但是對(duì)于控 制象有絲分裂和神經(jīng)母細(xì)胞增殖這樣的早期過程的基因卻知之甚少。這些因素也極有可能涉及微管和細(xì)胞骨架元素的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。(Haydar e^/.， 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 2890-2895; Kaltschmidt d 2000, Nat. Cell Biol. 2, 7-12; Knoblich, 2001， Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 11-20)。最近，參與了細(xì)胞骨架重組的幾個(gè)基因已經(jīng)被確定，它們?nèi)绻黄茐幕?突變，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元移行異常(見Feng and Walsh， 2001, supra)。這些基因 其中之一是doublecortin (DCX)基因，其編碼的一個(gè)含有365個(gè)氨基酸的 對(duì)新生jL大腦皮質(zhì)神經(jīng)元遷移起關(guān)鍵作用的蛋白(WO99/27089)。在人類和嚙齒動(dòng)物基因組中， 一個(gè)相關(guān)的基因，稱作doublecortin樣激 酶(doublecortin-like kinase ， DCLK)，表現(xiàn)出有大量的序列與DCX基因 一致。人類DCLK基因跨度超過250kb并且可以被廣泛的選擇性剪接，產(chǎn) 生多種不同的轉(zhuǎn)錄本編碼不同的蛋白(Matsumoto et al., 1999， Genomics 56, 179-183)。其中一個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄本，DCLK-長(zhǎng)鏈，編碼一個(gè)融合到激酶樣 結(jié)構(gòu)域的DCX域，其含有的氨基酸序列與(^++/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶 (CaMK)家族的成員具有同源性。另一轉(zhuǎn)錄本，DCLK-短鏈，主要在成 人腦中表達(dá)，其缺乏DCX域并且編碼CaMK樣屬性的激酶(Engels et al., 1999, Brain Res. 835, 365-368; Engels et al.， 2004, Brain Res. 120, 103-114; Omori et al.， 1998， J. Hum. Genet. 43， 169-177; Vreugdenhil et al., 2001, Brain Res. Mol. Brain Res. 94, 67-74)。最近的研究表明DCLK基因在鈣依賴神經(jīng)元可塑性和神經(jīng)退行性病變中 的重要作用(Burgess and Reiner, 2001, J. Biol. Chem. 276, 36397-36403; Kruidering et al., 2001， J. Biol. Chem. 276, 38417-38425 )。DCLK-長(zhǎng)鏈在早期 的發(fā)展階段表達(dá)(Omori etal, 1998, supra)并且象DCX—樣，有能力與微 管聚合(Linetal., 2000， J. Neurosci. 20, 9152-9161)。不過，DCLK基因在 神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展中的確切作用還是未知數(shù)。DCLK的各種替代的剪接-變異體已經(jīng)都被描述并且其中2種都被發(fā)現(xiàn)是 差異表達(dá)并有不同的激酶活性(Burgess and Reiner 2002， J Biol. Chem. 277, 17696-17705)。本發(fā)明的發(fā)明人克隆了并功能性的表征了一種DCLK基因 的新型剪接變異體，在這里稱為doublecortin-like (DCL)，并表明DCL是 細(xì)胞骨架基因，與分裂的神經(jīng)母細(xì)胞的有絲分裂紡錘體密切相關(guān)。此外， 本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計(jì)了新穎的癌癥的治療與診斷的方法，尤其是對(duì)神經(jīng)母 細(xì)胞瘤的治療與診斷。最近，新的治療祌經(jīng)母細(xì)胞瘤的方法已經(jīng)公布，涉及針對(duì)兩個(gè)不同的癌基因使用反義寡核苷酸(Pagnan et al., 2000, J. Natl. Cancer Inst. Vol 92， 253-261; Brignole et al. 2003, Cancer Lett. 197， 231-235; Burkhart et al., 2003, J. Natl. Cancer Inst. 95， 1394-1403)。第一種辦法是針對(duì)c-Myb致癌基因 (Pagnan et al.， 2000, supra)。有報(bào)道在幾種不同胚胎起源的實(shí)體腫瘤中有 c-Myb基因表達(dá)，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤，它是和細(xì)胞增殖和分化聯(lián)系在一起 的。結(jié)果表明互補(bǔ)于人的c-Myb基因mRNA的2 -9密碼子的硫代磷酸寡 聚脫氧核苷酸在體外抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)它被包被著神經(jīng)外 胚層抗原雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯GD2單克隆抗體(mAb)的立體穩(wěn)定的脂質(zhì) 體運(yùn)送到細(xì)胞時(shí)，其抑制效應(yīng)是最大的(Pagnan etal.， 2000， supra)。雖然 在靜脈注射抗GD2定位的脂質(zhì)體后，藥物動(dòng)力學(xué)及生物分布研究已經(jīng)被完 成(Brignole etal.， 2003， supra),但是在體內(nèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型的效果至今 并沒有被證明。c-Myb反義寡核苷酸潛在的毒副作用也應(yīng)被考慮，因?yàn)樵?正常細(xì)胞的增殖中c-Myb蛋白發(fā)揮著根本性的作用并且在體外已經(jīng)表明 c-Myb反義寡核苷酸抑制正常的人體造血作用(Gewirtz and Calabretta, 1988， Science 242， 1303-1306)。另一個(gè)反義技術(shù)是針對(duì)MYCN (N-myc)致癌基因(Burkhart et al., 2003, supra)。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中MYCN基因的擴(kuò)增只有25至30%的發(fā)生率， 但與老年疾病，快速的腫瘤進(jìn)展和小于15%的存活率是相關(guān)的?；パa(bǔ)于人 MYCN的mRNA的第一個(gè)五密碼子的硫代磷酸寡脫氧核苷酸序列的作用 在小鼠的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的體內(nèi)模型實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行了。結(jié)果表明，進(jìn)行為期 6周的經(jīng)皮下植入的微型滲透泵連續(xù)引入寡核苷酸可降低腫瘤發(fā)病率并減 小植入泵旁邊的腫塊(Burkhart et al., 2003, supra)。雖然這種方法是非常具 有局限性，但是寡核苷酸對(duì)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端器官的癌癥的系統(tǒng)性的影響仍然保 持成立，不包括在系統(tǒng)性引入后對(duì)正常細(xì)胞潛在的毒副作用。此外，這種 寡核苷酸對(duì)已經(jīng)確定的腫瘤的作用并沒有被證明。目標(biāo)基因的選擇對(duì)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤有效的的治療與診斷的發(fā)展是非常關(guān) 鍵的。如上所述，本發(fā)明的發(fā)明人已克隆了DCLK基因的一種新型mRNA 剪接變異體，編碼新型的DCL蛋白，并已在功能上對(duì)這個(gè)剪接變異體作出 表征。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是這種剪接變異體專門在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)，而 不會(huì)在健康組織和細(xì)胞系中被檢測(cè)到。這一發(fā)現(xiàn)被用來設(shè)計(jì)新的治療和診 斷方法。定義"基因沉默"在此是指在細(xì)胞中靶蛋白產(chǎn)物減少(下調(diào))或完全停止?；?因沉默可能是由于耙基因減少了轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。該"耙基因"保持沉默狀 態(tài)。靶基因通常是一種內(nèi)源性基因，但在某些情況下可能是轉(zhuǎn)基因。當(dāng)可 以用方法來沉默某一個(gè)基因家族的所有或幾個(gè)成員時(shí)，術(shù)語"耙基因"就 可以指一個(gè)被沉默的基因家族。術(shù)語"基因"是指可以轉(zhuǎn)錄成mRNA分子("轉(zhuǎn)錄區(qū)")的核酸序列， 它可操作地將各種轉(zhuǎn)錄必要的序列因素聯(lián)系在一起，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列， 增強(qiáng)子，5'前導(dǎo)序列，編碼區(qū)和3'非轉(zhuǎn)錄序列。內(nèi)源性基因是細(xì)胞內(nèi)部發(fā) 現(xiàn)的自然基因。"有義鏈"是指核酸分子的編碼鏈，如雙鏈DNA分子的編碼鏈或mRNA 的轉(zhuǎn)錄分子。"反義鏈"是指與有義鏈具有互補(bǔ)序列的鏈。反義分子可能 是反義DNA或反義RNA，即作為反義DNA與反義RNA具有相同的核酸 序列，差異在于T (胸腺嘧啶)被U (尿嘧啶)所取代。術(shù)語"包含"被解釋為指定的規(guī)定部分、步驟或元件的存在，但不排除 一個(gè)或多個(gè)額外部分、步驟或元件的存在。核酸序列包含X區(qū)域，可能包 含了額外的區(qū)域，即X區(qū)域可能嵌入在一個(gè)更大的核酸區(qū)域。術(shù)語"充分相同"，"實(shí)質(zhì)相同"或"基本相似"或"本性相似性"是 指兩個(gè)多肽或兩個(gè)核苷酸序列，當(dāng)例如用程序GAP或BESTFIT使用默認(rèn) 參數(shù)進(jìn)行最佳排列，至少約有75%，較好至少約80%的序列相同，更好至 少約85或90%的序列相同，最好至少95%， 97%， 98%的或更多的序列 相同(例如99%序列相同)。GAP使用Needleman-Wunsch全球比對(duì)算法 排列兩個(gè)序列的整個(gè)長(zhǎng)度，最大限度計(jì)算匹配數(shù)和最小化間隙(gap)的 數(shù)目。 一般來說，程序GAP是使用的默認(rèn)參數(shù)，間隙產(chǎn)生扣分=50 (核 苷酸)/ 8 (蛋白質(zhì))和間隙延伸扣分- 3 (核苷酸)/2 (蛋白質(zhì))。對(duì)于 核苷酸使用的默認(rèn)得分矩陣是nwsgapdna并且對(duì)于蛋白質(zhì)默認(rèn)得分的矩陣 是blosum62 (Henikoff & Henikoff， 1992, Proc. Natl. Acad. Science 89, 915-919)。很明顯當(dāng)RNA序列被說成與DNA序列是基本上類似或有一定 程度的序列相同，在DNA序列上的胸腺嘧啶(T)被認(rèn)為是等同于在RNA 序列上的尿嘧啶(U)。當(dāng)進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，"相同"序列上100%的核酸 或氨基酸序列相同。此外如果序列之間唯一的差別就是RNA序列在同一位置包含U而不是T，在這種情況下RNA序列與DNA序列100%相同。 序列比對(duì)和序列相同白'分比的得分可以通過使用電腦程序確定，如GCG Wisconsin Package 10.3版，可從accelrys公司購(gòu)得，9685斯克蘭頓道，圣 地牙哥，加州92121-3752美國(guó)。另外百分比相似性或相同度取決于搜索數(shù) 據(jù)庫，如FASTA， BLAST等等。在這里涉及的"序列"或"序列片段"應(yīng)被理解為具有一定核苷酸的序 列(DNA或RNA)或氨基酸分子。"嚴(yán)格的雜交條件"也可以被用來鑒定核苷酸序列充分相同于某一特定 核苷酸序列。嚴(yán)格的條件是由序列來決定的并會(huì)隨著不同的情況而不同。 一般來說對(duì)于特定的序列，嚴(yán)格的條件是在一個(gè)確定的離子強(qiáng)度和pH值 的情況下選擇約低于熱熔點(diǎn)(Tm) 5'C的溫度。該Tm值是指其中50X的 目標(biāo)序列雜交到一個(gè)完全匹配的探針上的溫度(在確定的的離子強(qiáng)度和pH 值下)。典型嚴(yán)格的條件將選擇為在pH值為7時(shí)鹽的濃度大約是0.02摩爾 并且溫度至少60°C。降低鹽的濃度和/或增加溫度可以增強(qiáng)匹配的嚴(yán)格性。 例如RNA-DNA雜交的嚴(yán)格條件(Northern blots使用雜交探針例如100nt) 至少包括在63'C用0.2X SSC溶液或同等條件進(jìn)行一次20分鐘的洗滌。例 如DNA-DNA雜交的嚴(yán)格條件為(Southern blots使用的雜交探針例如 100nt)至少包含在溫度至少有5(TC，通常大約為55。C時(shí)，用0.2X SSC溶 液或同等條件進(jìn)行一次20分鐘的洗滌(通常是2次)。在此"主體"是指哺乳動(dòng)物主體，尤其是到人或動(dòng)物主體。此處的"靶細(xì)胞"是指其中DCL蛋白水平改變(特別是減少)的細(xì)胞并 包括正常地產(chǎn)生DCL蛋白的任何癌細(xì)胞，特別是神經(jīng)外胚層來源的腫瘤細(xì) 胞，尤其是神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。在靶細(xì)胞中DCL的存在可以通過本文其他 的描述來測(cè)定。下面只涉及到神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療和診斷，但可理解神經(jīng) 母細(xì)胞瘤細(xì)胞任何涉及的參考都可類似的應(yīng)用于其他類型的癌癥靶細(xì)胞， 尤其是神經(jīng)外胚層起源的癌癥靶細(xì)胞，并且在此處包括這樣的方法，用途 和試劑盒。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療和診斷方法中新型的核酸和蛋白質(zhì)序 列的應(yīng)用的方法。到目前為止DCL蛋白被發(fā)現(xiàn)在所有神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 中能檢測(cè)到細(xì)胞特異的表達(dá)(人類和老鼠細(xì)胞系)。DCL被發(fā)現(xiàn)可以聚合和穩(wěn)定微管并且內(nèi)源性DCL共定位于正在分裂的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞有絲 分裂紡錘體，這表明了 DCL在分裂細(xì)胞正確形成有絲分裂紡錘體中的作 用。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中DCL基因沉默造成有絲分裂紡錘體的顯著變 形或甚至缺失以及微管解體。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞是神經(jīng)外胚層起源的。在脊椎動(dòng)物中胚胎神經(jīng)管(神 經(jīng)外胚層)的多能干細(xì)胞產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS) 的主要細(xì)胞類型。這些細(xì)胞類型是指細(xì)胞來自神經(jīng)外胚層或換句話神經(jīng)外 胚層起源。祌經(jīng)外胚層起源的腫瘤包括所有CNSandPNS腫瘤，如神經(jīng)母 細(xì)胞瘤，髓母細(xì)胞瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，膠質(zhì)瘤，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，星形細(xì) 胞瘤，纖維神經(jīng)瘤，室鼓膜瘤，MPNST (惡性周圍神經(jīng)鞘瘤)，神經(jīng)節(jié)細(xì) 胞瘤或神經(jīng)鞘瘤。也有神經(jīng)外胚層起源腫瘤，如橫紋肌肉瘤，視網(wǎng)膜母細(xì) 胞瘤，小細(xì)胞肺癌，腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，原始的PNET (周邊神經(jīng)外胚層 腫瘤)，尤文氏肉瘤和黑色素瘤。由于這些腫瘤與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞都有著 共同的胚胎起源，DCL將是一個(gè)在這些情況下診斷和治療的目標(biāo)。根據(jù)發(fā)明所述的核酸和氨基酸序列本發(fā)明提供了新型的核酸序列，SEQIDNO:l (鼠dc/mRNA和cDNA) 及SEQ ID NO: 2 (人dc/ mRNA和cDNA)，它們分別編碼SEQ ID NO: 3 (鼠DCL)和SEQ ID NO: 4 (人DCL)蛋白質(zhì)。SEQ ID NO: 1禾卩2 的 mRNA序列是小鼠和人DCLK基因的新型剪接變異體。該剪接變異體 包括1至8號(hào)外顯子(部分地，直到終止密碼子)，其中1號(hào)外顯子是非編 碼的。在兩條序列中，DCLK基因的第6號(hào)外顯子是缺失的。在鼠mRNA 的序列中，翻譯的起始密碼子被發(fā)現(xiàn)位于189-191核苷酸，而翻譯終止密 碼子被發(fā)現(xiàn)位于1275-1277核苷酸。第2號(hào)外顯子起始于169 nt， 3號(hào)外顯 子起始于565 nt，第4外顯子起始于912 nt，第5號(hào)外顯子起始于1012 nt， 第7外顯子起始于1129 nt和第8號(hào)外顯子起始于1224 nt。在人類的mRNA 序列中，翻譯起始密碼子被發(fā)現(xiàn)位于核苷酸213-215 ，而翻譯終止密碼子 被發(fā)現(xiàn)位于核苷酸1302-1304。第2號(hào)外顯子起始于194 nt ， 3號(hào)外顯子 起始于589 nt，第4號(hào)外顯子起始于936 nt ，第5號(hào)外顯子起始于1036 nt， 第7號(hào)外顯子起始于1153 nt和第8號(hào)外顯子起始于1248 nt。鼠和人類的 DCL蛋白質(zhì)在其氨基酸序列上非常類似并且雙方分子量都約為40kDa。鼠 DCL蛋白包含362個(gè)氨基酸，而人DCL蛋白包含363個(gè)氨基酸。由于只表現(xiàn)出4個(gè)氨基酸的差異，所以它們氨基酸序列的相似度約為98%。差異是在172位氨基酸，鼠的序列中是G而人類的序列中是S，在290位氨基 酸(鼠序列中是A而人類序列中是S)，在294位氨基酸(鼠的序列中是G 而人的序列是S)并且人的序列中359位的氨基酸V在鼠的序列中缺失。 此外由于cDNA/mRNA序列的高度相似性(約90%為編碼區(qū))，無論是核 酸序列(SEQIDNO: 1或2)，或片段或其變種都可用于耙細(xì)胞基因沉默 的方法，尤其是人類神經(jīng)外胚層起源的癌癥細(xì)胞。此處提及RNA或mRNA 分子，然而序列描述的是DNA序列，應(yīng)理解為RNA分子與DNA序列是 完全相同的，差異只是T (胸腺嘧啶)被U (尿嘧啶)所取代。除了 &/(SEQ ID NO: 1和2)完整的核酸序列，也提供了 SEQ ID NO: 1 和2有義/或反義的片段，它們適用于以A/作為靶基因的沉默方法。因此 在以下說明的任何一個(gè)基因沉默的方法中應(yīng)用的片段必須是功能性的，特 別是在神經(jīng)外胚層來源的癌癥細(xì)胞中它們能夠?qū)е耂EQIDNO:3和4的 DCL蛋白產(chǎn)物顯著降低。"SEQIDNO: 3和4的產(chǎn)物顯著降低"是指與 神經(jīng)外胚層來源的癌癥細(xì)胞(其中未導(dǎo)入SEQIDNO: 1和/或2的有義和 域反義片段)中發(fā)現(xiàn)的DCL蛋白水平相比較，在含有SEQ ID NO: 1和/ 或2的有義和/或反義片段的神經(jīng)外胚層起源的癌癥細(xì)胞中至少有50。Z ， 60% ， 70% ，優(yōu)選至少80%， 90%或100X的DCL蛋白減少。此外，通 過顯著減少或終止細(xì)胞中DCL蛋白的產(chǎn)生，SEQIDNO: 1和/或2的有義 和/或反義片段的導(dǎo)入能導(dǎo)致細(xì)胞表型改變。尤其是導(dǎo)致微管解體和有絲分 裂紡錘體的變形，神經(jīng)外胚層來源的癌癥細(xì)胞(如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)的 增殖被顯著的減少。"神經(jīng)外胚層來源的癌癥細(xì)胞(如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞) 的增殖的顯著減少"是指生長(zhǎng)(細(xì)胞分裂)的減少或完全被抑制，例如含 有SEQIDNO:l和/或2的有義和/或反義片段的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。熟練 的技術(shù)人員使用本文描述的方法可以輕松方便地檢驗(yàn)，是否SEQIDNO: 1 和/或2的有義和/或反義片段有能力造成預(yù)期的效果。檢測(cè)的最容易的方 法是在體外培養(yǎng)的例如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中導(dǎo)入有義和/或反義片段并 分析在這些細(xì)胞中相比于對(duì)照細(xì)胞，mRNA和/或DCL的蛋白水平和/ 或表型的變化和/或神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖。在體外的效果反映了有義和 /或反義片段適宜于被用來制備用于治療例如神經(jīng)母細(xì)胞瘤的組合物。原則上，SEQIDNO: 1禾卩/或2的(有義和/或反義)片段可以是SEQID NO: 1或2的任何一部分，其包括SEQIDNO: 1或2中至少10， 12 ，14 ， 16 ， 18 ， 20 ， 22 , 25 ， 30 ， 50 ， 100 ， 200 ， 500 ， 1000個(gè) 或更多的連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)或反向互補(bǔ)的序列。有義和/或反義片段可 能是RNA片段或DNA片段。此外，該片段可以是單鏈或雙鏈(雙向)。 核酸片段也可能是與SEQIDNO: 1或2的部分非編碼區(qū)(例如，SEQ ID NO: 1的1-188的核苷酸或SEQ ID NO: 2的1-212核苷酸區(qū)域)，或部分 的編碼區(qū)(SEQIDNO: 1的189-1274核苷酸或SEQ ID NO: 2的213-1301 核苷酸)，或一個(gè)部分為非編碼部分為編碼的區(qū)域(如內(nèi)含子-外顯子的邊 界或外顯子l) 100%相同。核酸片段可以利用例如寡核苷酸合成器來從頭 進(jìn)行化學(xué)合成，如Applied Biosystems公司(Fosters, CA, USA)，或可以利 用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行克隆，如Sambrooketal.(1989)和Sambrook and Russell (2001)描述的。根據(jù)本發(fā)明的核酸片段可用于各種用途，例如 作為PCR引物，作為核酸雜交的探針，作為DNA或RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)化 到靶細(xì)胞或作為siRNA (小的干擾RNA)轉(zhuǎn)化到或表達(dá)在靶細(xì)胞上。因 為不同的基因沉默方法利用不同的有義和/或反義核酸片段，這些將不局限 于本發(fā)明在下面做的詳細(xì)說明的范圍。此外，SEQIDNO: 1和2的變異體，如上文所述他們的互補(bǔ)或反向互 補(bǔ)序列被提供。"變異體"的核酸序列不是與SEQ ID NO: 1或2片段(或 它們的互補(bǔ)或反向互補(bǔ))100°/。相同，但是在其核酸序列上"基本相似"。 "SEQIDNO: 1或2的變異體"包括核酸序列，其中由于遺傳代碼的簡(jiǎn)并， 也編碼SEQIDNO:3或4的氨基酸或其片段。通過替換，刪除和/或更換 一個(gè)或多個(gè)核苷酸，SEQIDNO: 1或2的變異體，它們的互補(bǔ)序列，反 向補(bǔ)充序列也包含了不同于SEQ ID NO: 1或2的序列。"SEQ ID NO: 1 和2的變異體"還包括含有或由核苷酸的模擬物組成的序列，如PNA's(肽 核酸)，LNA's(鎖核酸)及其類似物或包含的嗎啉，2'-0-甲基RNA或2'-0-烯丙基RNA。核酸序列的變異體可以通過例如化學(xué)合成的方法從頭合成，可以通過突 變或基因改組的方法或從自然界分離來產(chǎn)生，例如使用PCR技術(shù)或核酸雜 交。SEQIDNO: 1或2的一個(gè)變異體也可以被界定為與SEQ ID NO: 1或 2、它們的互補(bǔ)或反向互補(bǔ)序列"基本相似"(如上所界定)的核酸序列。 特別是其中有至少75%， 80%， 85%， 90%， 95 X或以上的序列與在SEQ ID NO: 1或2整個(gè)長(zhǎng)度的序列上相同的變異體被包含在此。在發(fā)明的一 個(gè)例子中，基本相似于SEQIDNO: 1或2的有義和/或反義片段的核酸序列被提供。當(dāng)導(dǎo)入合適的數(shù)量到神經(jīng)外胚層來源的癌細(xì)胞(如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)時(shí)，所述的SEQIDNO: 1或2片段，SEQIDNO: 1或2的變 異體片段可以顯著地降低DCL-蛋白的細(xì)胞水平。因此在功能上，這些變 異片段必須相當(dāng)于以上描述的有義和/或反義片段，并且熟練的技術(shù)人員可 以用描述的同樣的方式檢測(cè)這些片段的功能。還提供了 SEQIDNO:3和SEQ ID NO: 4的分離蛋白以及它們的片段 和變異體。例如根據(jù)本發(fā)明該DCL的蛋白質(zhì)(或片段或它們的變異體)可 以被用來產(chǎn)生抗體，如多克隆或單克隆抗體，這可以被應(yīng)用在各種DCL 檢測(cè)的方法，診斷或治療的方法或試劑盒。另外，引起免疫反應(yīng)的表位可 以在蛋白質(zhì)范圍內(nèi)鑒定。DCL蛋白質(zhì)、片段或其變異體可以被合成，可以 從自然界純化或可以在重組細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)。DCL蛋白片段可以 是SEQIDNO:3或SEQ IDNO: 4中的任何一段片段，其中包含20， 50， 100，200個(gè)或更多的相同于或基本相似于SEQIDNO:3或4相應(yīng)部分的 連續(xù)氨基酸。DCL蛋白質(zhì)變異體包含與SEQ ID NO: 3或4基本相似的 氨基酸序列，例如其通過有l(wèi)， 2， 3， 4， 5或更多氨基酸的置換，缺失或 插入，使得氨基酸序列不同于SEQIDNO: 3和4。變異體還包括含有肽 骨架修飾或氨基酸模擬物的蛋白質(zhì)，例如非蛋白質(zhì)氨基酸(如e-， Y-， 5 -氨基酸，P -， Y -， 5 -亞氨基酸)或L- a -氨基酸的衍生物。本領(lǐng)域技 術(shù)人員熟知大量合適的氨基酸模擬物，他們包括環(huán)己烷丙氨酸，3-環(huán)己垸 丙酸，L型金剛基丙氨酸，金剛基乙酸及其類似物等。適合于本發(fā)明多肽 的多肽模擬物在Morgan and Gainor, (1989) Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-252.中有所討論。發(fā)明方法在一個(gè)例子中，本發(fā)明提供了在靶細(xì)胞或組織中沉默A/基因的方法，特 別是在神經(jīng)外胚層來源的癌癥細(xì)胞中，尤其是神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。這些方 法共同的都是將一個(gè)或多個(gè)SEQIDNO: 1或2的有義和/或反義的核酸片 段或SEQIDNO:l或2的變異體(如上文所述)片段傳遞到靶細(xì)胞(神 經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)并且導(dǎo)入到靶細(xì)胞，即導(dǎo)入到靶細(xì)胞中導(dǎo)致內(nèi)源性基因 DCL(靶基因)的沉默，尤其是導(dǎo)致DCL蛋白和神經(jīng)外胚層來源的癌細(xì)胞 增殖的顯著減少，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。各種基因沉默的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是眾所周知的。 一般來說，與內(nèi)源性靶基因有序列同源性的RNA或DNA被導(dǎo)入細(xì)胞，目的是干擾內(nèi)源性靶 基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。從而目標(biāo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)顯著減少或最好完全停止。 已知的基因沉默的方法包括反義RNA表達(dá)(見如EP140308B1)，協(xié)同抑 制(有義RNA的表達(dá)，見如EP0465572B1)，傳遞或在細(xì)胞中表達(dá)小干擾 RNA (siRNA)(見WO03簡(jiǎn)969， Fire et al. 1998, Nature 391， 806-811, WO03/099298, EP1068311, Zamore et al. 2000， Cell 101: 25-33， Elbashir et al. 2001, Genes and Development 15:188-200; Sioud 2004, Trends Pharmacol. Sci. 25:22-28)和反義寡核苷酸傳遞到細(xì)胞(見如WO03/008543, Pagnan et al. 2000 supra, Burkhard et al. 2003， supra)。也見基因沉默方法的綜述Yen and Gerwitz (2000， Stem Cells 18:307-319)。另外，各種向靶細(xì)胞傳遞核酸分子的方法存在并可以在此處被使用，如 (陽離子)脂質(zhì)體傳遞(Pagnan et al. 2000， supra),陽離子卟啉，膜融合 多肽(Gait, 2003, Cell. Mol. Life Sci. 60: 844-853)或人工病毒顆粒(見Lysik and Wu曙Pong， 2003,.Pharm. Sci. 92:1559-1573; Seksek and Bolard, 2004, Methods Mol. Biol. 252: 545-568)。鼠和人類DCL剪接異構(gòu)體的克隆及表征使己知的任何基因沉默方法可 應(yīng)用來顯著降低體內(nèi)或體外(在細(xì)胞及組織培養(yǎng)的)的鼠或人類的神經(jīng)外 胚層來源的癌癥細(xì)胞的DCL蛋白水平(或完全停止DCL蛋白產(chǎn)生)。特別 是DCL沉默的表型影響是被視為一種在分裂中的神經(jīng)外胚層來源的癌細(xì) 胞(如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)中有絲分裂紡錘體的變形，和/或神經(jīng)外胚層來 源的癌癥細(xì)胞(如在體內(nèi)或體外培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)的增殖的顯著減 少或完全抑制，。在一個(gè)例子中，提供了一個(gè)或多個(gè)SEQIDNO: 1或2的有義和/或反義 核酸片段或SEQIDNO: 1或2變異體的片段的應(yīng)用，應(yīng)用于為顯著減少 神經(jīng)外胚層來源的癌癥細(xì)胞中DCL蛋白的水平的組合物的制備，以及應(yīng)用 于治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤，髓母細(xì)胞瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，膠質(zhì)瘤，少突膠質(zhì)細(xì) 胞瘤，星形細(xì)胞瘤，神經(jīng)纖維瘤，室鼓膜瘤，MPNST(惡性周圍神經(jīng)鞘瘤)， 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤，神經(jīng)鞘瘤，橫紋肌肉瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，小細(xì)胞肺癌， 腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，早期PNET (周邊神經(jīng)外胚層腫瘤)，尤文氏肉瘤和黑 色素瘤。特別是在合適的時(shí)間間隔給予合適的數(shù)量的組合物會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)外 胚層來源的癌癥細(xì)胞減少或完全抑制其增殖。在另一例子中在體外治療神經(jīng)外胚層來源的癌癥細(xì)胞的方法被提供。這種方法可以被用來測(cè)試核酸片段以及包含這些核酸片段的組合物的功能。 該方法包括a)建立神經(jīng)外胚層來源的癌癥細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)，b)用根據(jù) 本發(fā)明的核酸片段或包含這些核酸片段的組合物處理細(xì)胞并且C)相比于對(duì)照細(xì)胞分析神經(jīng)外胚層來源的癌癥細(xì)胞的表型變化(使用Visual評(píng)估， 顯微鏡等方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，微管解體等)和/或細(xì)胞分子分析(使用例如 PCR技術(shù)，雜交，化學(xué)發(fā)光等檢測(cè)方法分析^/轉(zhuǎn)錄的水平，DCL蛋白水 平等)。以下為適合于^/基因沉默的并與SEQIDNO: 1禾P/或2序列相同或基 本類似的有義和/或反義DNA或RNA分子的非限制性的例子1.小干擾RNAs (siRNA) 小干擾RNAs由SEQIDNO: 1或2的具有18， 19， 20， 21， 22， 23， 24，25， 30個(gè)或更多連續(xù)核苷酸的雙鏈RNA (dsRNA)組成。通過合成短的 單鏈RNA寡核苷酸目的序列并對(duì)它們進(jìn)行退火，這種雙鏈RNA分子可以 很容易地合成(見例子)。優(yōu)選有額外的一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)核苷酸作為3' 突出，更優(yōu)有兩個(gè)胸腺嘧啶核苷酸或脫氧胸腺嘧啶核苷酸(3'-末端TT)。 這些dsRNA包括有義和反義RNA。以下的例子都是非限制性的。(siDCL畫2)5,隱 CAAGAAGACGGCUCACUCCTT -3， (SEQ ID NO: 5)3，陽TTGUUCUUCUGCCGAGUGAGG -5， (SEQ ID NO: 6)(hu-siDCL-2)5，- CAAGAAAACGGCUCAUUCCTT -3， (SEQ ID NO: 7)3,- TTGUUCUUUUGCCGAGUAAGG -5' (SEQ ID NO: 8)(siDCL-3)5,陽 GAAAGCCAAGAAGGUUCGATT -3， (SEQ ID NO: 9) 3,- TTCUUUCGGUUCUUCCAAGCT -5， (SEQ ID NO: 10)(hu-siDCL-3)5，- GAAGGCCAAGAAAGUUCGUTT -3, (SEQ ID NO: 11) 3,- TTCUUCCGGUUCUUUCAAGCA -5' (SEQ ID NO: 12)如上所述，SEQIDNO:l或2的其他任何的片段,，或SEQIDNO:l或 2的變異體，都適合于被用來構(gòu)建siRNA 。 siRNA分子可能還包括用于監(jiān) 測(cè)和檢測(cè)的標(biāo)記物，如熒光或放射性標(biāo)記物。方便地，siRNA也可以從DNA載體上表達(dá)。這種DNA的載體可以含有 在有義和反義片段之間的額外的核苷酸，其導(dǎo)致莖環(huán)結(jié)構(gòu)，隨后是折疊的 RNA轉(zhuǎn)錄子。除了向神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞傳遞和導(dǎo)入的siRNA，這種DNA 載體可瞬時(shí)或穩(wěn)定地被導(dǎo)入到靶細(xì)胞，使siRNA在耙細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)錄。舉例 來說，用于基因轉(zhuǎn)移的載體，譬如那些發(fā)展起來的用于基因治療載體，可 被用來將DNA導(dǎo)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，從這些載體上SEQIDNO: 1或2 或SEQIDNO:l或2變異體的有義和/或反義片段被轉(zhuǎn)錄。例子是重組腺 相關(guān)病毒載體(AAV)，在Hirata et al.， 2000 (J. of Virology 74:4612-4620)， Pan et al. (J. of Virology 1999， Vol 73， 4: 3410-3417)， Ghivizanni et al. (2000, Drug Discov. Today 6:259-267)或WO99/61601中有所描述.無論siRNA是否適合并能有效于dc/基因沉默，熟練的技術(shù)人員可以輕 松方便地檢驗(yàn)，通過例如向神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株傳遞分子，隨后使用已知 的方法，如RT-PCR檢測(cè)，Northern Blotting,核酸保護(hù)試驗(yàn)，免疫印跡， ELISA分析及其類似方法檢測(cè)評(píng)估包含siRNA分子的細(xì)胞所產(chǎn)生 mRNA和/或DCL蛋白的水平。合適的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系是如人 SHSY5，鼠N1E-115，鼠NS20Y或鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤/大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤雜交 NG108細(xì)胞系或其他。另外，^"/基因沉默對(duì)表型的影響，像對(duì)有絲分裂 紡錘體變形可以被評(píng)估，正像實(shí)施例中所描述，使用例如免疫細(xì)胞化學(xué)染 色或免疫熒光?？?DCL-抗體可以被熟練的技術(shù)人員進(jìn)行生產(chǎn)，例如像實(shí) 施例中所描述的，或現(xiàn)有的抗體(Kruideringetal. 2001, supra)，在這里被 發(fā)現(xiàn)對(duì)DCL有高特異性，也可使用。隨著siRNA分子被導(dǎo)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，DCL蛋白水平相比于沒有 siRNA分子導(dǎo)入的細(xì)胞或相比于包含陰性對(duì)照siRNA分子的細(xì)胞，如本例 子中描述的siDCL-l，最好是至少減少約50%， 60%， 70%, 80%， 90% 或100%。2)反義RNA寡核苷酸 反義RNA寡核苷酸由SEQIDNO: 1或2的約12， 14， 16， 18， 20， 22，25， 30個(gè)或更多連續(xù)核苷酸的反向互補(bǔ)序列構(gòu)成的。這種RNA的寡核苷 酸可以很容易地被合成或從DNA載體轉(zhuǎn)錄。骨架修飾，如硫代磷酸寡脫氧核苷酸可用于增加寡核苷酸的穩(wěn)定。其他 修飾，如2'糖配基，例如與O-甲基，氟，O-型丙基，O-烯丙基或其他基團(tuán) 也可提高穩(wěn)定。合適的反義RNA寡核苷酸非限制性的例子是(DCLex2C) (2'0-甲基RNA硫代磷酸)5，- GCUGGGCAGGCCAUUCACAC -3, (SEQ ID NO: 13)(hu-DCLex2C)(2'0-甲基RNA硫代磷酸)5，- GCUCGGCAGGCCGUUCACCC -3， (SEQ ID NO: 14)(DCLex2D)(2，0-甲基RNA硫代磷酸)5，畫CUUCUCGGAGCUGAGUGUCU -3, (SEQ ID NO: 15)(hu-DCLex2D)(2，0-甲基RNA硫代磷酸)5，- CUUCUCGGAGCUGAGCGUCU -3， (SEQ ID NO: 16)對(duì)于siRNA分子，如上文所述熟練的技術(shù)人員可以很容易合成其他合適 的反義RNA寡核苷酸并測(cè)試其&/-基因沉默的效率。除了利用與SEQ ID NO:l或2反向互補(bǔ)相匹配度達(dá)到100X的連續(xù)序列，與SEQIDNO: 1或 2反向互補(bǔ)基本相似的序列被應(yīng)用，例如通過插入，替代或缺失l， 2或3 個(gè)核苷酸。所涵蓋的也包括DNA分子，尤其是能產(chǎn)生反義RNA寡核苷酸作為RNA 的轉(zhuǎn)錄子或轉(zhuǎn)錄的組成部分的DNA載體。當(dāng)載體在合適的細(xì)胞系中存在 時(shí)，這種載體可用于生產(chǎn)反義RNA寡核苷酸。為了使內(nèi)源性^/基因表達(dá) 沉默，DNA的載體(如AAV載體，見上文)在體內(nèi)也可以被傳遞到神經(jīng) 母細(xì)胞瘤細(xì)胞。因此除了傳遞反義RNA寡核苷酸，DNA載體可以被運(yùn)送 到神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中并抑制或減少神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。隨著反義RNA寡核苷酸被導(dǎo)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，DCL蛋白水平相比 于沒有反義RNA寡核苷酸的細(xì)胞或相比于包含陰性對(duì)照反義RNA寡核苷酸(即對(duì)DCL蛋白水平無影響)的細(xì)胞，最好是至少減少約50%， 60%, 70%, 80%, 90%或100%。 3)反義DNA寡核苷酸反義DNA寡核苷酸由SEQIDNO: 1或2的反向互補(bǔ)的約12， 14， 16， 18， 20， 22， 25， 30個(gè)或更多的連續(xù)核苷酸構(gòu)成。這種DNA的寡核苷酸 可以很容易被合成。骨架修飾，如硫代磷酸寡脫氧核苷酸的應(yīng)用可用于增加寡核苷酸的穩(wěn)定。 其他修飾，如2'糖配基，例如與O-甲基，氟，O-型丙基，O-烯丙基或其他 基團(tuán)也可提高穩(wěn)定。合適的反義DNA寡核苷酸的非限制性的例子是 (DCLex2A) (DNA硫代磷酸)5，- GCTGGGCAGGCCATTCACAC -3， (SEQ ID NO: 17) (hu-DCLex2A) (DNA硫代磷酸)5，- GCTCGGCAGGCCGTTCACCC -3， (SEQ ID NO: 18) (DCLex2B) (DNA硫代磷酸)5，- CTTCTCGGAGCTGAGTGTCT -3， (SEQ ID NO: 19) (hu-DCLex2B) (DNA硫代磷酸)5，- CTTCTCGGAGCTGAGCGTCT -3， (SEQ ID NO: 20)對(duì)于siRNA分子和反義RNA寡核苷酸，如上文所述熟練的技術(shù)人員可以 很容易合成其他合適的反義DNA寡核苷酸并測(cè)試其&/-基因沉默的效率。 除了利用連續(xù)的與SEQ ID NO: 1或2反向互補(bǔ)序列相匹配度達(dá)到100% 的序列，那些基本類似于SEQIDNO: 1或2反向互補(bǔ)的序列也可被應(yīng)用， 例如通過插入，替代或缺失l， 2或3個(gè)或更多的核苷酸。隨著反義DNA寡核苷酸被導(dǎo)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，DCL蛋白水平相比 于沒有反義DNA寡核苷酸的細(xì)胞或相比于包含陰性對(duì)照反義DNA寡核苷 酸(即對(duì)DCL蛋白水平無影響)的細(xì)胞，最好是至少減少約50%， 60%，70%， 80%， 90%或100%。可以理解的是，siRNA分子、反義RNA寡核苷酸和/或反義DNA寡核 苷酸混合物的傳遞亦可用于del的特效沉默。因此根據(jù)本發(fā)明的組合物包含適量的SEQIDNO: 1或2的有義和/或反 義片段或適量的與SEQIDNO: 1或2基本相似的序列和一個(gè)生理上可接 受的載體。當(dāng)組合物被用于向在體外培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞導(dǎo)入時(shí)，組 合物也可以包括一個(gè)靶向化合物，雖然這個(gè)靶向化合物的存在不是必需的， 作為分子可以通過轉(zhuǎn)染被簡(jiǎn)單地導(dǎo)入，使用例如轉(zhuǎn)染試劑盒(如Superfect， Qiagen，Vdancia,CA)，電穿孔，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等。"靶向化合物"是 指一種化合物或分子它能夠在體內(nèi)向目標(biāo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞運(yùn)輸核酸片 段，即它具有細(xì)胞定位的能力。"適當(dāng)?shù)挠昧?或"治療有效的用量"是指對(duì)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，這 個(gè)用量能導(dǎo)致DCL蛋白質(zhì)水平顯著減少或完全停止并造成神經(jīng)母細(xì)胞瘤 細(xì)胞的增殖顯著減少或完全抑制。根據(jù)描述，由一個(gè)熟練技術(shù)人員不需要 過度實(shí)驗(yàn)就可以很容易地確定適當(dāng)?shù)挠昧?。有義和/或反義分子(siRNA， 反義RNA或DNA寡核苷酸)的適當(dāng)?shù)挠昧糠秶抢鐝?,05taic)1到 5 Pmol/毫升并且是以1至100毫升/公斤體重的用量被注射。對(duì)于一個(gè)被給予主體而非神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的組合物，包含一個(gè) 本發(fā)明的核酸分子的有效的治療用量和另外一個(gè)或多個(gè)靶向化合物。這種 靶向化合物可以是例如免疫脂質(zhì)體，如Pagnan et al. (2000, supra)所描述的 或Patorino et al. (Clin Cancer Res. 2003， 9(12):4595-605)所描述的。在免疫 脂質(zhì)體的外表包含細(xì)胞表面導(dǎo)向的抗體。如對(duì)抗神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞抗原(例 如雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯GD2抗原)的突起的單克隆抗體，可用于將脂質(zhì)體 定位于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。顯然其他神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞抗原可以被用來形 成細(xì)胞特異性抗體。核酸分子用已知的方法被包裹在免疫脂質(zhì)體中并且單 克隆抗體被共價(jià)耦合到脂質(zhì)體的外部(見如p254 of Pagnan et al. 2000, supra)。脂質(zhì)體對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的結(jié)合以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)核酸 分子的吸收可以在體外用已知的方法評(píng)估，這在Pagnan et al. (2000)中有所 描述。同樣地，表型的影響和/或細(xì)胞內(nèi)駐留核酸分子的影響也可以被評(píng)估。其他靶向化合物也可以是類似的抗體，例如結(jié)合了核酸分子的對(duì)抗神經(jīng) 母細(xì)胞瘤細(xì)胞表面抗原的突出的單克隆抗體。例如抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體可 以被應(yīng)用，如嵌合大鼠/小鼠單克隆抗體ch17217，這種抗體已被證明在小鼠中，可以將細(xì)胞因子定位于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞(Dreieretal., 1998， Bioconj.Chem. 9:482-489)。這種方法已經(jīng)在技術(shù)方面為人們所共知，參見 例如 Guillemard and Saragovi (Oncogene, Advanced-online publication, published 22 March 2004， Prodrug chemotherapeutics bypass p-glycoprotein resistance and kill tumors in vivo with high efficacy and target-dependent selectivity)。同樣，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以結(jié)合到天然或合成的配體或配體模擬 物，其可結(jié)合到目標(biāo)細(xì)胞表面的受體(如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞表面受體)并 且可以導(dǎo)致核酸分子的內(nèi)吞。這樣配體的一個(gè)例子是轉(zhuǎn)鐵蛋白。己經(jīng)表明 在小鼠中靜脈注射轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚乙二醇-聚醚酰亞胺/DNA復(fù)合物能導(dǎo)致基 因轉(zhuǎn)移到皮下Neuro2a神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤(Ogris et al., 2003, J. Controlled Release 91: 173-181)。治療的組合物可以進(jìn)一步包含其他各種成分，例如但不限于水，鹽，甘 油或乙醇。另外配藥學(xué)上接受的輔助物質(zhì)也可存在，如乳化劑，潤(rùn)濕劑， 緩沖劑，緊張度調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑等，例如醋酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化 鉀，氯化鈣，失水山梨醇單月桂酸酯和三乙醇胺油酸。其他有效的生物分 子也可以存在，例如沉默其他基因目標(biāo)的核苷酸分子(如c-Myb基因)， 標(biāo)記物或標(biāo)記基因(如熒光素酶)，配體，抗體，藥物等。治療組合物可進(jìn)行局部給予，如注射，優(yōu)選是注射到靶組織，或全身注 射，例如通過流動(dòng)的注射用藥點(diǎn)滴輸注或皮下緩慢釋放裝置來進(jìn)行注射。 注射給藥系統(tǒng)包括溶液，懸浮物，凝膠，微球和可注射的聚合物，并且可 以包括賦形劑，如溶解度-改變?cè)噭?如乙醇，丙二醇和蔗糖)和聚合物(如 polycapiylactones和PLGA's)。進(jìn)一步關(guān)于適合于不同類型給予的描述指導(dǎo) 在 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)可見。一個(gè)例子中，根據(jù)本發(fā)明的組合物是用來補(bǔ)充神經(jīng)母細(xì)胞瘤的其他治療， 如化療，放射治療，外科手術(shù)和/或骨髓移植。因此無論是在一個(gè)或多個(gè)常 規(guī)治療的之前，同一時(shí)間和/或之后不久，組合物以有效的數(shù)量被給予主體， 優(yōu)選每周，更優(yōu)選每月。從而通過其他治療方法不能有效地消除或根除的 任何神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞可以由A/沉默阻止增殖。這種治療降低了神經(jīng)母 細(xì)胞瘤細(xì)胞向身體其他部位蔓延的風(fēng)險(xiǎn)(形成轉(zhuǎn)移)并且阻止或至少拖延 復(fù)發(fā)，即(原發(fā)的)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)。DCL沉默的優(yōu)勢(shì)超過化療或手術(shù)以至于它對(duì)正常組織只有低毒性和對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞有較高特異性。 因此似乎它最沒有不良的或只有微乎其微的副作用。在另一例子中的一種治療主體的方法被提供，即其他神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治 療(如化療，手術(shù)等)并未進(jìn)行。該方法包括a)建立一個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤 診斷，和b)給予適量的根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)組合物，和C)在不同時(shí)間間隔 進(jìn)行監(jiān)測(cè)(跟進(jìn)治療)。步驟a)例如，可以通過如下說明中使用的診斷方法和試劑盒來建立診 斷。另外，神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷可以使用常規(guī)方法建立，如CT或CAT掃 描，磁振造影掃描，mIBG掃描(間碘芐胍)，X光檢査，活檢或兒茶酚胺 或它在尿液或血漿樣品中的代謝物分析(如多巴胺，高香草酸，r香草基 扁桃酸)。步驟b)在本文的其他地方有所描述。步驟c)可能涉及各種后 續(xù)的檢測(cè)，如下面所述的診斷檢測(cè)，血液或尿液檢測(cè)，CT掃描，MRI掃 描等，后續(xù)的監(jiān)測(cè)目的是以確保該腫瘤細(xì)胞被徹底消滅并不會(huì)再次發(fā)生。 如果情況并非如此，則必須開始新的治療方法。在進(jìn)一步的例子中，診斷方法和診斷試劑盒被提供，它們對(duì)發(fā)生在主體 中的早期階段的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的選擇性篩選是有用。主體可能已經(jīng)在一個(gè) 或多個(gè)其他神經(jīng)母細(xì)胞瘤的測(cè)試中呈陽性反應(yīng)，在這種情況下，本檢測(cè)可 確認(rèn)更早期診斷?；蛘咚麄兛赡軟]有被診斷出患有神經(jīng)母細(xì)胞瘤，但他們 可能會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤引起的的癥狀。依據(jù)腫瘤部位不同，癥狀可能差 別很大，如食欲不振，疲倦，呼吸或吞咽困難，腹部腫脹，便秘，虛弱/ 腿部搖擺等。另外還未顯示任何癥狀的高風(fēng)險(xiǎn)主體可以使用本發(fā)明的診斷 方法進(jìn)行定期預(yù)防性測(cè)試，以確保早期診斷，這大大增加了根除神經(jīng)母細(xì) 胞瘤細(xì)胞的機(jī)會(huì)。離體診斷方法包括從主體內(nèi)采取血液樣本并檢測(cè)在血清 中游離神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的存在或缺失。另外離體診斷的方法可通過對(duì)(假 設(shè)的)腫瘤組織樣本進(jìn)行活檢。由于DCL蛋白和A/mRNA的表達(dá)在神經(jīng) 母細(xì)胞瘤細(xì)胞中是特異的，因此通過分析樣本中A/mRNA禾n/或DCL蛋 白的存在就可以檢測(cè)這些細(xì)胞的存在并選擇性進(jìn)行定量。這是可以用在技 術(shù)方面眾所周知的方法做到的，如使用特定或簡(jiǎn)并引物的(定量) RT-PCR檢測(cè)，其他PCR方法，例如特異性擴(kuò)增dc/基因的區(qū)域，DNA陣 列，雜交DNA探針，或檢測(cè)DCL蛋白質(zhì)方法，如使用A/4寺異性抗體(如多克隆或單克隆抗體)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA )或免疫印跡。 在一個(gè)例子中，根據(jù)本發(fā)明的診斷方法和試劑盒包括抗-DCLK單克隆抗體(在Kruidering et al. 2001, supra中提到也作為抗-CaMLK)，其可以識(shí)別并 結(jié)合到人和/或鼠的DCL蛋白(檢測(cè)的分子量為40 kDa)。雖然抗-DCLK 也識(shí)別其他剪接變異體，如DCLK-短鏈(即cpgl6 )禾BCARP，從cpgl6 和CARP的表達(dá)到DCL的時(shí)空分離，以及不同的分子量，可以用來輕松 地減少/避免假陽性。顯然其他DCL特異的單克隆抗體可以被生產(chǎn)和使用。此外，特異針對(duì)8號(hào)外顯子RNA (在DCL RNA存在，但在DCLK-短鏈 的RNA中缺失)的引物或探針，可用于RNA的檢測(cè)方法。作為對(duì)照，例 如結(jié)合于(雜交)DCLK-短鏈(即cpgl6)和CARP的6號(hào)外顯子RNA的 引物或探針，或結(jié)合到9至20號(hào)DCLK外顯子的引物或探針可被采用， 它們?cè)贒CLRNA中缺失。可特異地檢測(cè)(例如，通過序列特異性擴(kuò)增，由序列特異性雜交或由特 異的結(jié)合)SEQIDNO:2的RNA或DNA的或SEQ ID NO: 4的蛋白的引 物對(duì)，探針和抗體，可以被熟練的技術(shù)人員使用下面標(biāo)準(zhǔn)教科書的參考文 獻(xiàn)中可見的標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行合成。引物對(duì)和探針可以在SEQID NO: 2.的基礎(chǔ)上被合成。特異于DCL蛋白的單克隆或多克隆抗體可以用 在技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法被生產(chǎn)。診斷方法包括步驟a)分析主體的血液樣本中SEQ ID NO: 2的RNA或 DNA存在與否和/或SEQ ID NO: 4的DCL蛋白存在與否和b)隨意地量化 存在的SEQ ID NO: 2和/或SEQ ID NO: 4的數(shù)量。量化允許與神經(jīng)母細(xì) 胞瘤細(xì)胞的數(shù)目直接相關(guān)，這反過來又可以顯示神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)展和蔓 延的嚴(yán)重程度。為實(shí)施上述方法還提供了離體診斷試劑盒。因此診斷試劑盒可能包括引 物，探針和/或抗體和其他試劑(緩沖液，標(biāo)記等)，適合^/基因，A/mRNA 和/或DCL蛋白檢測(cè)并選擇性地量化。此外，試劑盒包含說明書和如何使 用試劑(如免疫檢測(cè)試劑)的說明和對(duì)照樣本，例如分離DCL蛋白或^/ DNA 。以下非限制性的例子說明了新型DCL剪接變異體的鑒定，分離和表征除 非另有說明，本發(fā)明的操作中將使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)，病毒學(xué)，微生物 學(xué)或生物化學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在Sambrook and Russell (2001) Afo/ecw/a;- C7ow'"g: j丄aZ orato/^ Ma聽a/, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY， in Volumes 1 and 2 of Ausubel a/. (1994) Cw簡(jiǎn)"f 尸ratoco/sM /ecw/a/- 5z'o/ogy， Cw;rew/ PratocoAs， USA and in Volumes I andII of Brown (1998) iVfo/ecw/ar Sw/o^丄a6Fox, Second Edition, Academic Press (UK), (9/一"wc/eo/7'(ie 1S戸f/7es7j (N. Gait editor), 7Vwc/e/c jc/t/ 場(chǎng)6n'(iiza^o" (Hames and Higgins, eds.義"五"2ywe /w附Mw0/7/W0c/7e附&^3/' in Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P. Tijssen (Elsevier 1985)中有 描述。PCR標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在Dieffenbach and Dveksler (1995)尸O /V/柳e廣 J Z^60rato7^ Afo"wa/， Cold Spring Harbor Labroatory Press, and in McPherson et al (2000)戶CT 5osz.c>sv From Sac^groww/ to 5e"c/z， first edition, Springer Verlag Germany中有所描述.。制造多克隆或單克隆抗體方法在例 如Harlow and Lane, t/s/"g ^4 /a6orato^ Mawwa/， New York: ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1998， and in Leddell and Cryer "」尸rac"'ca/ GW<ie to Mwoc/owa/JwWoii/ay 〃 ， Wiley and Sons 1991中有描述。上述所有 的引述都可以作為參考。在整個(gè)說明書和實(shí)施例中所提及的序列如下SEQ ID NO 1:小鼠A/的cDNA序列SEQ ID NO 2:人A/的cDNA序列SEQ ID NO 3:小鼠DCL的氨基酸序列SEQ ID NO 4:人DCL的氨基酸序列SEQIDN0 5:siDCL-2有義RNA寡核苷酸(siRNA鏈)SEQ ID NO 6: siDCL-2反義RNA寡核苷酸(siRNA鏈)SEQ ID NO 7: hu-siDCL-2有義RNA寡核苷酸(siRNA鏈)SEQ ID NO 8: hu-siDCL-2反義RNA寡核苷酸(siRNA鏈)SEQ ID NO 9: siDCL-3有義RNA寡核苷酸(siRNA鏈)SEQ ID NO 10: siDCL-3反義RNA寡核苷酸(siRNA鏈)SEQ ID NO ll:hu-siDCL-3有義RNA寡核苷酸(siRNA鏈)SEQ ID NO 12: hu-siDCL-3 v脂Av(siRNA鏈)SEQ ID NO 13: DCLex2C反義RNA寡核苷酸SEQ ID NO 14: hu-DCLex2C反義RNA寡核苷酸SEQ ID NO 15: DCLex2D反義RNA寡核苷酸SEQ ID NO 16: hu-DCLex2D反義RNA寡核苷酸SEQ ID NO 17: DCLex2A反義DNA寡核苷酸i蹈I￡) NO 18: hu-DCLex2A反義DNA寡核苷酸SEQ ID NO 19: DCLex2B反義DNA寡核苷酸SEQ ID NO 20: hu-DCLex2B反義DNA oligonuclotide


圖1-DCL的基因組結(jié)構(gòu)及與DCX的比對(duì)(A) : DCLK基因的基因組結(jié)構(gòu)和DCL的cDNA的克隆策略。僅標(biāo)出了 DCL 局部的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，包括最近識(shí)別的編碼CARP和DCL的共同3' 端的8號(hào)外顯子(Vreugdenhil et al., 2001,上文)。外顯子為矩形所代表并由 阿拉伯?dāng)?shù)字表示；內(nèi)含子是由實(shí)線表示。DCL轉(zhuǎn)錄體在(DCL)基因結(jié)構(gòu) 的下面所示。ORF被一個(gè)矩形所代表，非翻譯序列由直線所表示。用來克 隆DCL的引物的位置是由箭頭表示。(B) :DCL蛋白與DCX比對(duì)。相同的殘基是深灰色與保守替代序列是淺灰 色。兩個(gè)DCX域和SP豐富的域由箭頭表示。圖2- DCL是一個(gè)M.A.P.并且可以穩(wěn)定微管 第I小組(A-C) DCL在COS-1細(xì)胞中的過度表達(dá)。 (D-F) DCL在用秋水仙素處理的COS-1細(xì)胞中的過度表達(dá)。 綠色代表DCL;紅色代表a-微管蛋白并且黃色顯示DCL在d-微管蛋白 上的定位。藍(lán)色代表DNA (細(xì)胞核)。箭頭表示DCL關(guān)聯(lián)的連接微管束， 它們可以抵抗秋水仙素的處理。還標(biāo)記了在A和B中與細(xì)胞中心體清晰的 連接。標(biāo)尺是10 Mm。第II小組在體外由DCL聚合微管。不同濃度的重組DCL蛋白與純化的 微管蛋白進(jìn)行孵育并且在340 nm處對(duì)DCL/微管蛋白混合物的濁度監(jiān)測(cè)30 分鐘。紫杉醇用來作為陽性對(duì)照和水作為陰性對(duì)照。圖表顯示從多次實(shí)驗(yàn) (N二4例)中得到類似結(jié)果的典型例子。 圖3- DCL表達(dá)受發(fā)育調(diào)控(A) :DCX和DCLK識(shí)別抗體的交叉反應(yīng)。過度表達(dá)DCL(條帶4-6 )的COS-1 細(xì)胞的裂解物或兩個(gè)不同的DCX變異體(條帶2和條帶3)與抗-DCX(上 面組)或抗-DCLK (下面組)的Western blot分析?？?DCLK可以強(qiáng)烈識(shí) 別DCL (條帶4-6)。(B) :在細(xì)胞胚胎形成時(shí)期，DCL和DCX蛋白的發(fā)生。用抗-DCLK和抗 -DCX染色從年齡ED8到ED18的胚胎腦組織組分和成人腦組織的免疫跡。作為CARP/DCL抗體的陽性對(duì)照，過度表達(dá)DCL的COS-l細(xì)胞提取 物被使用。(C):在各成人腦區(qū)中的DCL和DCX的免疫印跡分析。1:ED12頭(陽性 對(duì)照)，M:分子量標(biāo)記，2:小腦，3:腦干，4:下丘腦，5:大腦皮質(zhì)，6: 海馬，7:嗅球。圖4-DCL在胚胎腦組織中的表達(dá)的定位和發(fā)生I.:在胚胎期(ED)第8天橫向腦切片原位雜交(組A);和在EDIO和ED12(分別是組B和C )徑向斷面。對(duì)于ED8和EDIO，所得到的信號(hào)偏低， 但在ED12中大大增強(qiáng)?？s寫di-間腦，lv-側(cè)腦室，me-中腦；mo-延髓，mt -后腦,mv-mesenchephalic vesicle, nc - neopallial cortex, ne -神經(jīng)上皮,rh -菱腦，te _端腦，tv-端腦囊，IVv-第四腦室。標(biāo)準(zhǔn)尺lmm;曝光時(shí)間14 days。II:在早期鼠的神經(jīng)上皮中DCL蛋白的分布A:在ED 11 (徑向切面)的DCL蛋白的分布。染色是限于增殖地區(qū)(分別 在左腦和右腦上的端腦和間腦)并在外層接近軟腦膜以及在內(nèi)心室區(qū)(箭 頭；以下見較高放大倍數(shù))被發(fā)現(xiàn)，而像第一鰓弓(M)的下頜骨組成部 分的非神經(jīng)元組織(nonneuronal tissue)則缺乏任何信號(hào)。IV;第四腦室。 標(biāo)尺代表150jim。B + C:從ED 9的早期神經(jīng)上皮鄰近的橫向(冠狀)截面為DCX (B)及DCL(C) 進(jìn)行免疫組化染色。沒有觀察到DCX染色(在B中的箭頭指向)，而DCL 無論是在內(nèi)室管膜(上面2箭頭)還是在外層空間邊緣區(qū)域(下面箭頭) 已經(jīng)表達(dá)。標(biāo)尺代表25tai。D: ED11的神經(jīng)管的神經(jīng)上皮徑向截面，顯示在管腔邊界(箭頭)有豐富 的表達(dá)，而在發(fā)展中的神經(jīng)元組織中分離的分裂細(xì)胞也呈免疫陽性(箭頭)。 L顯示了神經(jīng)管腔的神經(jīng)管。標(biāo)尺代表70tai.E:在神經(jīng)上皮有絲分裂細(xì)胞中DCL免疫陽性反應(yīng)的細(xì)節(jié)。指向卵裂面中間 線的染色體(箭頭)是顯而易見的。標(biāo)尺代表3toi。F : ED10中端腦神經(jīng)上皮的總體觀察顯示在心室(室管膜)層(在左邊 的箭頭)以及在邊際/皮質(zhì)板區(qū)(在右邊的箭頭)DCL的表達(dá)。2在中間帶 分裂細(xì)胞的免疫陽性反應(yīng)雙重帶也可以看見(箭頭)。標(biāo)尺代表15Pm。G + H:神經(jīng)上皮皮質(zhì)的橫截面表明DCX和DCL分布的差異，但部分重疊。 DCX并未表達(dá)，直到EDll (G)，并主要集中皮質(zhì)板的最上面部分和皮質(zhì) 神經(jīng)上皮的邊緣/皮質(zhì)板區(qū)域(箭頭)。相反DCL在ED9(H)就已經(jīng)表達(dá)， 并且在心室(室管膜)層(箭頭指向左)中以特別高的水平表達(dá)，而在中 間和邊緣區(qū)(箭頭指向右)以較低的水平表達(dá)。請(qǐng)注意心室層(G中 asteriks )缺乏DCX信號(hào)。標(biāo)尺代表5 tai。I:ED9心室區(qū)的室管膜層的細(xì)節(jié)顯示DCL在從神經(jīng)上皮延伸到中間帶(箭 頭)的纖維中表達(dá)。標(biāo)尺代表12Pm。J:室管膜層的細(xì)節(jié)顯示清晰的在毗鄰管腔的分裂的神經(jīng)上皮細(xì)胞的免疫反 應(yīng)，即在細(xì)胞有絲分裂的末期(左)，后期(中)，當(dāng)從管腔(右)遷移時(shí)， 在中前期DCL陽性細(xì)胞也是可見的并呈現(xiàn)垂直分裂(箭頭)。標(biāo)尺代表8 Mm。K:EDll室管膜層中的DCL免疫反應(yīng)，在細(xì)胞分裂的前期和末期(箭頭) 的細(xì)胞中，以及在中期/后期(箭頭)的胚細(xì)胞樣細(xì)胞中。標(biāo)尺代表10Pm。 L:在中心體樣結(jié)構(gòu)(下面的箭頭)2個(gè)在室管膜層的DCL免疫陽性有絲 分裂的細(xì)胞也顯示了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。標(biāo)尺代表1.5Pm。 M + N: 2個(gè)DCL免疫陽性反應(yīng)的例子，在細(xì)胞分裂后期II /末期II(M)和在 中期/后期I的分裂細(xì)胞，染色體清晰可見(箭頭)，同時(shí)也有一些微管染 色也可被觀察(箭頭)。標(biāo)尺代表ltai。圖5-在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中DCL的表達(dá) 組I:A:在一些神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中DCL是內(nèi)源性表達(dá)的。通過Western blot 分析篩選DCL陽性細(xì)胞株。條帶l: COS-l細(xì)胞，條帶2: HeLa細(xì)胞， 條帶3: NG108-15細(xì)胞，條帶4: NS20Y細(xì)胞，條帶5: N1E-115細(xì)胞， 條帶6:分子量標(biāo)記，條帶7: SHSY5細(xì)胞。請(qǐng)注意，DCL在神經(jīng)母細(xì)胞 瘤細(xì)胞系(條帶3,4,5和7)而不在由非神經(jīng)元來源的細(xì)胞系中表達(dá)(條帶 1和2)。B組DCL是一個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。NG108-15裂解物用抗-DCL染色。條帶 1:未經(jīng)處理的裂解物，條帶2:在37t:無磷酸酶孵育的裂解液，條帶3: 在37'C有磷酸酶孵育的裂解液。條帶4-6與1-3類似但DCL過度表達(dá)。 請(qǐng)注意，在條帶4-6中內(nèi)源性DCL遷移并過度表達(dá)。組II:在用(1至3)和不用(4)在杜蒲(duplo)中進(jìn)行的siRNA處理的N1E-115 細(xì)胞中DCL的表達(dá)的Western blot分析。三種不同的針對(duì)DCL的siRNA 分子被使用siDCL-1 (條帶1)， siDCL-2 (條帶2)禾B siDCL-3 (條帶3)。 siDCL-2和3導(dǎo)致一個(gè)有效的基因沉默而siDCL-1并沒有。作為參考，同 樣的膜被a-微管蛋白重新染色。 組III.DCL基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞間期的微管骨架的松散?？?DCLK (綠色)染色產(chǎn) 生spickled模式，在非處理細(xì)胞(A-C)中這是最接近細(xì)胞核(A)。這種模式 是不會(huì)受siDCL-1 (D)的影響，但抗-DCLK染色由于siDCL-3(G)導(dǎo)致的 有效DCL沉默而幾乎缺失。細(xì)胞骨架由cc-微管蛋白染色(B, E和H) 所表明的那樣，在非治療細(xì)胞(B)和在用Si-DCL-l (E)處理的細(xì)胞中具 有良好的迷宮結(jié)構(gòu)，但由于siDCL-3的處理而變得很松散。DCL合并后的 插圖及a-微管蛋白染色顯示非處理細(xì)胞(C)，轉(zhuǎn)染si-DCL-1 (F)的細(xì)胞和轉(zhuǎn) 染siDCL-3 (I)的細(xì)胞。綠色=DCL，紅色=a -微管蛋白，黃色=DCL及 a-微管蛋白的定位。標(biāo)尺是10toi。 組IV:DCL基因的沉默不影響中心體結(jié)構(gòu)。通過抗Y-微管蛋白染色(B，EandH) 顯示Spickled抗DCLK染色(A, D, G)在中心體周圍是高度濃縮的(A， D) 并且有效的DCL (G)基因沉默不導(dǎo)致中心體結(jié)構(gòu)或形狀明顯的變化(I)， DCL和a-微管蛋白染色合并后的插圖顯示非處理的細(xì)胞(C)，轉(zhuǎn)染 siDCL-1 (F)和和轉(zhuǎn)染了 siDCL-3(I)的細(xì)胞。綠色DCL，紅=￥-微管蛋白， 黃色二DCL和Y-微管蛋白的定位。標(biāo)尺刻度是10toi。圖6 - DCL的基因沉默導(dǎo)致有絲分裂紡錘體變形。在非處理的細(xì)胞(A-C) 中DCL (A)主要與a-微管蛋白(B)結(jié)合。合并后的圖像(C)顯示DCL在著 絲粒(箭頭)中存在。通過a-微管蛋白染色(E)顯示轉(zhuǎn)染siDCL-l (D-F)并 沒有導(dǎo)致DCL沉默(D)和也沒有改變有絲分裂紡錘體變形。通過a -微管蛋 白染色(E)顯示由siDCL-2 (G-I)或siDCL-3 (J-L)導(dǎo)致DCL(Q J)的缺失和有 絲分裂紡錘體缺失(H和)變形(K)是有效的DCL沉默。綠色二DCL，紅=a-微管蛋白，黃色二DCL及a-微管蛋白的定位。標(biāo)尺刻度是10Pm。圖7 -在分裂的COS-1細(xì)胞中DCL的過度表達(dá)。 A-C:DCL過度表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)分析。顯示了用cx-微管蛋白染色的正常分裂的COS-l細(xì)胞作為參考。通過與a-微管蛋白的共染色(B)顯示DCL 的過度表達(dá)(綠色，A)導(dǎo)致有絲分裂紡錘體的延長(zhǎng)，注意轉(zhuǎn)染的和非 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的有絲分裂紡錘體長(zhǎng)度的差別，通過箭頭顯示的。DNA是用 DAPI (藍(lán)色)進(jìn)行染色的。D-I:在COS-l細(xì)胞中DCL在細(xì)胞分裂時(shí)的過度表達(dá)的共聚焦顯微鏡的觀 察?？雌饋眍愃?D-F)于野生COS-l細(xì)胞的一個(gè)表型，其中DCL(D)主要與 a-微管蛋白(E)結(jié)合。類似的在分裂的NlE-115細(xì)胞中DCL的內(nèi)源性定位， DCL也定位于著絲粒。DCL的定位以綠色表明，與通過a-微管蛋白染色 (紅色)顯示的有絲分裂紡錘體重疊。觀察的其他表型導(dǎo)致有絲分裂紡錘 體(G-I)伸長(zhǎng)和方向的改變。綠色=DCL (A, D， G)，紅色="微管蛋白 (B,E,H)，黃色DCL及a-微管蛋白的定位(C,F,I)。標(biāo)尺刻度是10 tai。實(shí)施例實(shí)施例-1小鼠和人的DCL的克隆從小鼠克隆的DCL的cDNA (SEQ ID NO: 1)的DNA序列分析顯示含362 個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為40 kDa的開放閱讀框(SEQ ID NO: 3 X圖IB ) 及對(duì)于兩條蛋白質(zhì)整個(gè)長(zhǎng)度有73%氨基酸相同于小鼠DCX (81%的相似 性)。對(duì)于DCX域I兩個(gè)預(yù)測(cè)的DCX重復(fù)序列(Taylor etal., 2000,同上) 與小鼠DCX的對(duì)比顯示甚至更高的81X氨基酸相同(89%的相似性)和 對(duì)于DCX域II有90X的氨基酸相同(99%的相似性)，強(qiáng)烈顯示后邊的 域在兩個(gè)蛋白質(zhì)中有類似的功能。絲氨酸/脯氨酸(SP)豐富的的C端在 很大程度上與CARP相一致(Vreugdenhil et al., 1999, Neurobiology 39, 41-50)，顯示了較低的63%氨基酸的相同性，(78%的相似性)。該SP豐 富的域在DCX和DCL中都存在。這種SP豐富的域是潛在的MAP激酶基 序(Sturgill et al.， 1988， Nature 334， 715-718)，這表明C端是一個(gè)MAP激 酶基板。有趣的是，在DCX這一區(qū)域的YLPL的基序已經(jīng)表明AP-1和 AP-2相互作用并被牽連在蛋白質(zhì)排序和囊泡運(yùn)輸中(Friocourt et al., 2001， Mol. Cell Neurosc. 18， 307-319)。不過在DCL中相應(yīng)的基序是YRPL，其 中的疏水性亮氨酸被堿性的精氮酸殘基取代，表明DCL不太可能與AP-1 和AP-2相互作用。人類基因t/c/ cDNA/mRNA (SEQ ID NO: 2 )和蛋白質(zhì)(SEQ ID NO: 4) 序列已經(jīng)利用鼠的序列從人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SHSY5)中獲得并被發(fā)現(xiàn)非常相似于小鼠序列，在這里其他地方所述的一樣。例2—DCL是一個(gè)MAP (微管相關(guān)蛋白)并穩(wěn)定細(xì)胞骨架DCX和DCLK-長(zhǎng)鏈的兩個(gè)DCX域都顯示互相作用并且可以穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu) (Francis et al., 1999, supra; Gleeson et al., 1999 supra; Kim et al.， 2003, Struct. Biol. 10， 324-333; Lin et al., 2000, supra)。因?yàn)镈CL含有于DCLK國(guó) 長(zhǎng)鏈相同的DCX域，DCL被期望有對(duì)微管有類似的穩(wěn)定和聚合效應(yīng)。為 確認(rèn)這一點(diǎn)，進(jìn)行了三種類型的實(shí)驗(yàn)第一，在COS-1細(xì)胞中DCL的過 度表達(dá)產(chǎn)生了一個(gè)在重疊的微管分布的人體細(xì)胞中纖維染色的模式(圖2.1 A)，通過與a-微管蛋白抗體(圖2.IBandC)共定位所呈現(xiàn)。第二，為 了測(cè)試含DCL的微管束是否與DCX以及其它MAPs所了解的一樣顯示對(duì) 解聚作用類似的抗性，DCL轉(zhuǎn)染細(xì)胞暴露于10Pg秋水仙素，這個(gè)化合物 解聚并打亂了微管蛋白。非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的顯示了明顯的解聚微管骨架的作用， 而所有DCL轉(zhuǎn)染細(xì)胞的微管骨架能抵抗1小時(shí)秋水仙素的處理，特別是濃 縮的微管/ DCL束(圖2.1 D-F)。這表明類似于DCLK-長(zhǎng)鏈和DCX的DCL 能穩(wěn)定微管。第三，在體外聚合實(shí)驗(yàn)中通過孵育不同濃度的重組非標(biāo)記的 DCL與純化的微管蛋白，DCL微管聚合反應(yīng)特性被進(jìn)行了檢測(cè)。紫杉醇被 用來作為陽性對(duì)照，這是一個(gè)著名的微管聚合化合物。微管聚合的分光光 度法監(jiān)測(cè)表明DCL聚合微管的作用呈劑量依賴性(圖2.n)?？傊?，這些 數(shù)據(jù)表明DCL，類似DCLK-長(zhǎng)鏈和DCX，可以直接聚合和穩(wěn)定微管。 例3-表征DCL識(shí)別抗體。最近抗CARP抗體的產(chǎn)生，叫做抗-CaMKLK，已被描述(Kruidering et al.， 2001, supra)，其也被認(rèn)為是其他DCLK基因剪接-變異體包括DCLK-短鏈(也稱為cpgl6 (Silverman et al.， 1999, J. Biol. Chem. 274， 2631-2636)或 CaMKLK)。 CARP是一個(gè)具有55個(gè)氨基酸的小蛋白，其中43位氨基酸與 DCL的C端是一致的，即占70%的氨基酸序列與人類DCX有同源性(Vreugdenhil et al., 1999)。針對(duì)抗-CaMKLK的特異性，DCX和DCL在 COS-1細(xì)胞中被過度表達(dá)并通過免疫印跡分析可能的交叉反應(yīng)?？?-CaMKLK強(qiáng)烈識(shí)別DCL (圖3A條帶4-6)，而與DCX只有一些交叉反 應(yīng)(圖3A條帶2和3)。在另一方面，DCX抗體用于此處對(duì)抗DCXC端 的17個(gè)氨基酸，可以強(qiáng)烈識(shí)別DCX的(圖3A條帶2和P 3)而不識(shí)別 DCL (圖3A條帶4-6)。因此，抗-CaMKLK強(qiáng)烈識(shí)別眾多DCLK基因的剪接變異體包括DCLK-短鏈和DCL，因此在此稱為"抗-DCLK"。此外， 抗-DCLK與DCX的一些交叉反應(yīng)可能會(huì)發(fā)生，而DCX抗體是特異于DCX 而不針對(duì)于DCL。例4 - DCL在腦發(fā)育的早期階段高效表達(dá)Western blot分析胚胎腦組織勻漿發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)40 kDa免疫陽性蛋白抗 -DCLK。這種蛋白質(zhì)的大小與在COS-l細(xì)胞(圖3B)中過度表達(dá)的重組 DCL蛋白一致。由于沒有觀察到其他免疫反應(yīng)帶(圖3B)，所以抗-DCLK 只識(shí)別在發(fā)展中的鼠腦中的DCL。雖然信號(hào)已經(jīng)ED10出現(xiàn)，但是DCL 蛋白最高水平的免疫反應(yīng)在ED12和ED14中被發(fā)現(xiàn)。在ED14后DCL蛋 白水平下降并且一個(gè)較弱的但清晰的40kDa的條帶仍在成人腦組織中出 現(xiàn)。這里一個(gè)另外的53kDa的條帶非常突出(圖3B)。與其分子量53kDa 一致，這個(gè)條帶最有可能代表DCLK-短鏈，它僅在成人而不在發(fā)育中的腦 組織中做豐富的表達(dá)。(Vreugdenhiletal, 2001; Omorietal., 1998)。在成人 腦組織中，DCL蛋白的最高水平在嗅球中被發(fā)現(xiàn)，較低水平在海馬和大腦 皮質(zhì)中并且非常低的水平在小腦，腦干和下丘腦中被發(fā)現(xiàn)(圖3C)。DCX已經(jīng)被報(bào)告能在發(fā)育過程中特異地表達(dá)但在成人腦組織中下降到 能夠檢測(cè)的水平以下(Francis et al., 1999 supra; Gleeson et al., 1999 supra)， 雖然DCX在選定的區(qū)域仍然以非常低的數(shù)量表達(dá)(Nacher et al., 2001, Eur J Neurosci 14, 629-644)。為了比較DCL的發(fā)現(xiàn)物，蛋白裂解物與識(shí)別C 端的DCX-特異性抗體被進(jìn)一步的分析。與其他研究結(jié)果一致(Francis et al., 1999; Gleeson et al., 1999)， DCX的最高濃度在ED12中被發(fā)現(xiàn)并且發(fā)現(xiàn)之 后呈下降表達(dá)(圖3B)。與DCL比較，沒有DCX蛋白的表達(dá)，也經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的曝光后，在ED8 和ED10胚胎頭部或在成人腦組織中可以發(fā)現(xiàn)。但是與DCX在神經(jīng)元遷 移中的作用一致，DCX免疫反應(yīng)在成人嗅球(圖3C條帶7)中而不是在 其他腦結(jié)構(gòu)被觀察到(圖3C條帶2-6)，顯示在整個(gè)大腦裂解物中低于檢 測(cè)水平的DCX的稀釋度。為分析DCX和DCL表達(dá)的更詳細(xì)的區(qū)域差異，在早期胚胎發(fā)育期間 DCL的時(shí)空表達(dá)被采用原位雜交的方法進(jìn)行研究。DCL mRNA的低水平 表達(dá)在ED8中被沿著神經(jīng)上皮的長(zhǎng)度觀察(在后來的發(fā)育階段注定要產(chǎn)生 中樞神經(jīng)系統(tǒng)和大腦皮質(zhì)層)(圖4.IA)。在ED10中當(dāng)大量的分裂開始進(jìn) 行時(shí)，大量的表達(dá)在間腦，端腦和中腦中被發(fā)現(xiàn)(圖4.1 B)。與RT-PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)一致，在ED12中DCL表達(dá)的強(qiáng)度與ED 8禾B IO相比時(shí) 有強(qiáng)烈地增加(圖4.IC)，在增殖心室區(qū)具有高水平表達(dá)。為研究DCL蛋白的時(shí)空分布，使用DCLK抗體(抗-DCLK)將從小鼠 在8， 9， 10和11日齡的胚胎的截面被進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，該抗體專門識(shí) 別在這些階段的DCL (見上文和圖3B)。在ED8中沒有觀察到DCL染色 (數(shù)據(jù)未顯示)。然而在ED9中沒有DCX蛋白表達(dá)的階段尚未發(fā)現(xiàn)(圖 4.1IB)， DCL信號(hào)在心室壁和主要神經(jīng)上皮細(xì)胞中非常突出，大量有絲分 裂和神經(jīng)形成的區(qū)域界限清晰。(圖4.H C和J)。在EDIO和11中， 一般利用原位雜交模式DCL蛋白質(zhì)在中央和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的增殖地區(qū)具 有高水平表達(dá)，包括端腦，中腦，神經(jīng)節(jié)的橫向隆起，神經(jīng)管的神經(jīng)上皮 細(xì)胞以及例如背根和交感神經(jīng)節(jié)，然而像例如骨或腸非神經(jīng)組織則缺乏任 何信號(hào)(圖4.IIA和D)。早期大腦皮層更高倍顯示DCL不僅在上層皮質(zhì) 板而且在內(nèi)心室區(qū)中間帶以較低水平的表達(dá)(圖4.IIF禾PI H)。特別引人注目的觀察是DCL在有絲分裂的細(xì)胞中的免疫反應(yīng)，如在心室 區(qū)和上皮壁(例如在圖4.IIC-F,H，J-N)同時(shí)在神經(jīng)管的神經(jīng)上皮(圖4.H D)和神經(jīng)上皮皮質(zhì)的中間帶(圖4.II F)有絲分裂細(xì)胞中也被發(fā)現(xiàn)DCL呈陽 性， 一般以更單獨(dú)的和較低地頻率發(fā)生。此外上皮細(xì)胞在同一截面的DCL 染色模式，清楚的免疫陽性雙重帶被觀察到(圖4.H D和F)。在細(xì)胞周 期的特定階段的有絲分裂的細(xì)胞也可以被識(shí)別(圖4.IIJ-N)，染色體之間 的強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，甚至在中心體樣結(jié)構(gòu)的免疫反應(yīng)都清晰可見(圖4.II L)。總之，數(shù)據(jù)清楚地表明存在DCL mRNA表達(dá)的先導(dǎo)序列即從ED8啟動(dòng) 的DCX和從ED9起始的DCL蛋白。DCL mRNA和蛋白的最高表達(dá)被在 ED12和ED14中發(fā)現(xiàn)，分別與DCX相反，DCL的轉(zhuǎn)錄體及蛋白表達(dá)也 被用Western blots在成人腦組織中發(fā)現(xiàn)。在發(fā)育早期階段蛋白質(zhì)分布不僅 在時(shí)間而且在位置上也不同于DCX，即DCL被發(fā)現(xiàn)在心室區(qū)和皮質(zhì)板而 非單獨(dú)在皮質(zhì)板(圖4.H C， F-H)。最引人注目的是DCL免疫反應(yīng)在神經(jīng) 上皮有絲分裂的細(xì)胞中，有時(shí)在中間帶被有規(guī)律發(fā)現(xiàn)。 例5- DCL在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中內(nèi)源性的表達(dá)。為了調(diào)査DCL在神經(jīng)元中增殖可能發(fā)揮的作用，DCL在幾種神經(jīng)元細(xì)胞 系的內(nèi)源性表達(dá)被進(jìn)行了分析。在4種不同神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中觀察到 約40 kDa的DCL陽性帶，這是在所研究的任何非神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中缺失的(圖5.IA)顯示了 DCL在成神經(jīng)細(xì)胞樣表型的細(xì)胞的特異性表達(dá)。 篩選其他非神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系包括PC12細(xì)胞，未能找出任何DCL陽性 細(xì)胞系(數(shù)據(jù)未顯示)。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株N1E-115中，40kDa的免 疫反應(yīng)雙重帶與雙重帶共遷移是由DCL的過度表達(dá)造成(圖5.IB)。這個(gè) 40 kDa的條帶不能夠由在N115細(xì)胞中出現(xiàn)的DCX解釋，因?yàn)槭褂肈CX-特異性引物和抗體，通過RT-PCR試驗(yàn)和免疫印跡分析都未能檢測(cè)到DCX 信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。因此上面的40kDa的DCL雙重帶最有可能代表了磷 酸化的DCL，當(dāng)細(xì)胞裂解物與磷酸酶進(jìn)行孵育時(shí)，這一想法被上面的DCL 內(nèi)源性以及過度表達(dá)的條帶的缺失所證實(shí)。這進(jìn)一步表明DCL類似于 DCX ，至少在神經(jīng)元細(xì)胞系中是一種磷酸化蛋白。 例六-DCL影響微結(jié)構(gòu)和組織在N1E-115細(xì)胞。為了研究DCL功能和亞細(xì)胞定位，在N1E-115神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞間期時(shí) DCL的操縱子表達(dá)后，利用共聚焦顯微鏡及小的干擾(si)RNA技術(shù)進(jìn)行的 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)。為建立siRNA被Nl 15細(xì)胞攝取，抗-DCL合成的siRNA 分子被Cy-5所標(biāo)記并且它們?cè)贜115細(xì)胞中的存在或缺失可以通過熒光顯 微鏡來監(jiān)測(cè)的。這些研究結(jié)果表明在大約95X的N115細(xì)胞中存在抗-DCL 的siRNA(數(shù)據(jù)未顯示)。三種不同的抗DCL siRNA的分子被構(gòu)建siDCL-l, 2和3. Western blot分析表明siDCL-l未能使DCL蛋白沉默(圖5.II條帶 1 )，這一發(fā)現(xiàn)可能可以通過在反義鏈在3'端中因缺乏TT雙核苷酸來解釋。 其后siDCL-l被作為一種siRNA程序的作用的陰性對(duì)照。從Western blot 分析確定，與非處理的細(xì)胞相比，siDCL-l，轉(zhuǎn)染siDCL-2和Si-DCL-3分 子分別導(dǎo)致80%和90%的基因沉默(圖5.11條帶2 and 3)。隨后使用抗 -DCLK和ct-微管蛋白或y-微管蛋白抗體對(duì)siRNA處理的N115細(xì)胞的 免疫細(xì)胞化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞間期微管骨架的結(jié)構(gòu)深刻的影響。在非處 理的細(xì)胞中抗DCL染色通常是點(diǎn)狀的并且在整個(gè)殘余的胞體中存在(見圖 5.IIIA)。和DCX形成對(duì)比，DCL似乎有選擇性地存在于胞體的周邊甚至 在神經(jīng)元進(jìn)程的末端(Friocourt et al.， 2003; Schaar et al., 2004)， DCL的免 疫反應(yīng)在胞體的周邊不是很強(qiáng)烈(圖5.III A和C)而且往往顯示在細(xì)胞 核的一側(cè)或兩側(cè)的附近強(qiáng)度增加，(圖5.niA,C,D和F)，表明DCL在中 心體周圍沿著細(xì)胞骨架顯著地濃縮。亞細(xì)胞定位被與中心體標(biāo)記y-微管 蛋白共染色所證實(shí)(見圖5.IVA-C)。與Western blot分析結(jié)果一致，siDCL-l的轉(zhuǎn)染并未改變內(nèi)源性DCL免疫細(xì)胞化學(xué)染色的模式。DCL的基因沉默是通過siDCL-3誘導(dǎo)，然而在抗 -DCLK染色下誘導(dǎo)幾乎完全消失(見圖5.IIIG)，明顯表明抗-DCLK抗體 在N115細(xì)胞中以高效特異的方式識(shí)別DCL。明顯地40%轉(zhuǎn)染了 siDCL-2 和80%轉(zhuǎn)染了 siDCL-3的細(xì)胞中細(xì)胞骨架被破壞，明顯地是由于^-微管 蛋白染色模式改變和分散以及不規(guī)則的組織。轉(zhuǎn)染了 siDCL-2和3的但有 正常細(xì)胞骨架的N115細(xì)胞也比異常細(xì)胞骨架的細(xì)胞顯示了更多的抗 -DCLK染色。這進(jìn)一步地支持了有效的DCL基因沉默和隨后的微管穩(wěn)定 性異常的因果關(guān)系。與非處理的細(xì)胞的正常微管骨架比較，DCL沉默后的 異常模式的特點(diǎn)是具有更濃縮和較少分散結(jié)構(gòu)的維管束，明顯地顯示了較 少的分支(圖5.11IHandl)。這表明DCL在微管骨架的分支和穩(wěn)定性的作 用。由于DCL蛋白質(zhì)在中心體周圍以高濃度狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)分布，DCL基因沉 默可能會(huì)影響中心體蛋白復(fù)合物和隨后其在細(xì)胞核的定位以及細(xì)胞骨架連 通性和(重新)組織。為了解決這一問題，DCL基因沉默在與Y-微管蛋 白染色結(jié)合下進(jìn)行(見圖5.IVD-I)。與N115細(xì)胞整倍體的性質(zhì)一致，每 個(gè)細(xì)胞都觀察到多中心體。然而盡管DCL基因沉默是有效的但在中心體的 數(shù)量上或結(jié)構(gòu)上并沒有明顯改變，表明DCL在中心體的組織結(jié)構(gòu)上不是一 個(gè)關(guān)鍵因素。例7- DCL是神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞有絲分裂紡錘體形成的必不可少的。 DCL在心室區(qū)的存在(圖4)與DCL在神經(jīng)元增殖和祖細(xì)胞分化的作用是 一致的。因此由siRNA導(dǎo)致的DCL沉默后利用共聚焦顯微鏡分析NlE-115 細(xì)胞。DCL強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)在所有的在中期或早后期分裂的N1E-115細(xì)胞 中被觀察(見圖6A和D)。 DCL免疫反應(yīng)主要定位于a-微管蛋白，顯示 了與有絲分裂紡錘體的聯(lián)系。然而，免疫反應(yīng)梯度在所有細(xì)胞的DCL被明 顯地分析，在中心體附近的較低水平和在有絲分裂紡錘體和附近著絲粒的 較高水平表明DCL在有絲分裂紡錘體的形成中的作用。與通過siDCL-2 和siDCL- 3轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的DCL基因沉默的顯著性影響相協(xié)調(diào)，這是與有絲 分裂紡錘體的完全變形和有時(shí)缺失相關(guān)聯(lián)的(圖6G-L)。這個(gè)對(duì)有絲分裂 紡錘體效應(yīng)被在40%的所有的分化細(xì)胞(siDCL-2)和在所有轉(zhuǎn)染siDCL-3 分化細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。，由siDCL-l導(dǎo)致DCL基因低效率的沉默與未發(fā)生改變 的有絲分裂紡錘體共定位，而有絲分裂紡錘體外觀的表型類似于非處理的 有絲分裂紡錘體(圖6D-F)。因此很顯然DCL是分裂的成神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞有絲分裂紡錘體正確的形成的必然需要。例8 _ DCL的過度表達(dá)導(dǎo)致有絲分裂紡錘體的伸長(zhǎng)。增益函數(shù)通過在通常不表達(dá)DCL蛋白的COS-l細(xì)胞中過度表達(dá)DCL而被 進(jìn)行研究。與上述在N115細(xì)胞中內(nèi)源性DCL的表達(dá)的研究結(jié)果相一致， DCL的免疫反應(yīng)與有絲分裂紡錘體共定位于分化的C0S-1細(xì)胞(見圖7)。 觀察到兩種不同的表型第一，在20% (每組n=126)分析的分化的COS-l 細(xì)胞中，DCL過度表達(dá)與a-微管蛋白定位，類似于在分化N1E-115細(xì)胞 中內(nèi)源性DCL的表達(dá)模式(圖7 D-F)， DCL定位在著絲粒和有絲分裂紡 錘體。然而與N1E-115細(xì)胞不同，DCL也被發(fā)現(xiàn)與中心體和星形纖維相聯(lián) 系。其次，在大多數(shù)的分化的COS-l細(xì)胞(80%)中，由于事實(shí)上所有 DCL表達(dá)和分化的細(xì)胞顯示一種擁有扁長(zhǎng)的有絲分裂紡錘體的不正常的 表型，DCL表達(dá)的確切的有絲分裂階段的對(duì)照和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞被阻礙。最引人注目的，觀察到的半個(gè)紡錘體表明DCL的過度表達(dá)影響中心體隔 離和紡錘體的方向(圖7 7A-C，G-I)。此外，該有絲分裂紡錘體看起來較 對(duì)照細(xì)胞的有絲分裂紡錘體更長(zhǎng)而且往往較厚(如比較非處理細(xì)胞的紡 錘體長(zhǎng)度，圖7B與圖7C)。值得注意的是，這些DCL的影響與異常的 DNA染色和分布格局有關(guān)，如染色體在胞體中被完全置換和分散，與正常 方向有顯著不同的模式(圖7B)，即與中心體雙極的位置垂直(與圖7C 相比見參考長(zhǎng)度)。因此，DCL在COS-l細(xì)胞中過度表達(dá)導(dǎo)致紡錘體的伸 長(zhǎng)并形成半紡錘體，暗示DCL對(duì)有絲分裂紡錘體的形成和長(zhǎng)度起著關(guān)鍵的 作用。例9 -材料與方法 9.1小鼠DCL的克隆本發(fā)明的發(fā)明人研制出一種反義引物1A: CTGGAATTCTTACAC TGAGT CTCCTGAG (下劃線是EcoRl位點(diǎn))符合于CARP特異外顯子的終止密 碼子區(qū)域和有義引物2S: GCAGG TTCTC ACTGA CATTA CCG符合于小 鼠DCLK基因3號(hào)外顯子。利用小鼠胚胎的cDNA為模板和聚合酶PM (stratagene)進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)。DNA序列分析證實(shí)了 DCLK特異的 DNA序列。隨后利用CCAGGATCCACCATGTCGTTCGGCAGAGATATG (下劃線是BamHl位點(diǎn))作為有義和1A作為反義引物，酶切位點(diǎn)是BamHl 禾口 EcoRl并且在質(zhì)粒pcDNA 3.1 (InVitrogen, Groningen, The Netherlands )亞克隆中表達(dá)編碼完整DCL蛋白的DCL cDNA被擴(kuò)增。通過從pEGFP-Cl 的Smal/Kpnl位點(diǎn)的pcDNA3.1. DCL亞克隆KpnI/EcoRV DCL片段來 DCL-EGFP (Clontech;也見圖表l)。 9.2原位雜交技術(shù)DCL mRNA包括8號(hào)外顯子(圖1 )，其在大多數(shù)其他DCLK轉(zhuǎn)錄體除CARP 中缺失。由于CARP在胚胎發(fā)育過程中以非常低的水平表達(dá)，40-mer反義 寡核苷酸被揭露(5' -TTTGC TGTTA GATGC TTGCT TAGGA AATGG GAAACCTTGA-3')互補(bǔ)于8號(hào)外顯子的特定序列。作為一個(gè)陰性對(duì)照其 中含有6個(gè)錯(cuò)配(下劃線)的寡核苷酸5'-TTTGA TGTTA TATGC TTGAT TAGGA CATGG GACAC CTGGA-3'被使用。根據(jù)制造商的說明利用末端轉(zhuǎn) 移酶(Roche Molecular Biochemicals， Almere, The Netherlands), 將這兩個(gè) 寡核苷酸用a - 33P dATP做了末端標(biāo)記(NEN Life Science Products, Hoofddorp, The Netherlands, 2000Ci/mmol, 10 mCi/ml)。原位雜交技術(shù)和信 號(hào)的可視化表現(xiàn)如前面所描述被實(shí)施(Meijer et al., 2000, Endocrinology 141， 2192-2199)。 9.3抗體抗隱DCL抗體的產(chǎn)生之前已被描述(Kruidering et al., 2001, supra)。小鼠 單克隆抗a -微管蛋白抗體從81§11^購(gòu)得。山羊多克隆抗(10111^(:01^11((:-18) 抗體，羅丹明-共軛二抗和辣根過氧化物酶共軛二抗由Santa Cruz生物技術(shù) 公司購(gòu)得。 9.4細(xì)胞培養(yǎng)及處理所有細(xì)胞培養(yǎng)的化學(xué)品由生命科學(xué)技術(shù)公司購(gòu)得，除非另有說明。所有細(xì) 胞保持在37'C， 5%二氧化碳的條件下培養(yǎng)。在COS-細(xì)胞培養(yǎng)在 Dulbecco ， s modified Eagles medium (DMEM培養(yǎng)液)中，輔以100單位/ 毫升青霉素，100 ug/ml的鏈霉素和10%的胎牛血清。NG108-15和N115 細(xì)胞在無丙酮酸鈉培養(yǎng)液中培養(yǎng)，輔以100單位/毫升青霉素，IOOU g/ml 的鏈霉素，雜交瘤細(xì)胞(HAT)的組合物和10%的胎牛血清。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí) 驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)平板或涂以多聚賴氨酸的玻片。從新生小鼠中原代分離的神 經(jīng)元在補(bǔ)充了 L-谷氨酰胺，100單位/毫升青霉素，100ug/ml的鏈霉素和 10%的胎牛血清的F-12 Ham， Kaighn， s modification (Sigma)培養(yǎng)基培養(yǎng)。 從一天齡的小鼠的海馬區(qū)分離出的原代神經(jīng)元在37'C胰蛋白酶溶液孵育 25min。隨后用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次并鋪在涂以多聚賴氨酸的玻片上。24小時(shí)后去掉培養(yǎng)基并補(bǔ)充的胞嘧啶-3-阿拉伯糖苷(Sigma)以減少 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是利用superfect試齊lj(Qiagen, Valencia, CA)根據(jù)制造商的說明來完成的。原代神經(jīng)元在分離的四后天轉(zhuǎn)染。 9.5 siRNA實(shí)驗(yàn)在siRNA實(shí)驗(yàn)中采用小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系NIE-115 (ATCC貨號(hào) CRL-2263 )。合成RNA的寡核苷酸5， -CAAGA AGACG GCUCA CUCC-3' 和 5' -GGAGU GAGCC GUCUU CUUG-3' (annealed siDCL-l)， 5， - CAAGA AGACG GCUCA CUCCT T- 3， (SEQ ID NO: 5) 和5 ，匿GGAGU GAGCC GUCUU CUUGT T-3 ， (SEQ ID NO: 6) (annealed siDCL-2)和5 ， -GAAAG CCAAG AAGGU UCGAT T-3 ， (SEQ ID NO: 9) 和5 ， -TCGAA CCUUC UUGGC UUUCT T-3 ， (SEQ ID NO: 10) (annealed siDCL-3)，其中3'胸苷是脫氧核苷酸，是從Eurogentec公司購(gòu)得，并溶解 在退火緩沖液(100mMKAc，30mMHepespH7.5,2mMMgAc)中使最終 的濃度為100 PM。 siRNA雙鏈的形成，有義和反義寡核苷酸相等的摩爾數(shù) 量進(jìn)行混合，在37oC孵育1小時(shí)后94oC加熱1分鐘。每孔使用最終濃度 是lOOnM的siRNA雙鏈。在基因沉默的試驗(yàn)中，60 pmol的siRNA雙鏈被 溶解在50 W優(yōu)化的-MEM培養(yǎng)基(生命技術(shù))中并用移液器與3W轉(zhuǎn)染 試劑(Irwitrogen公司)進(jìn)行混合，溶解于12W優(yōu)化的-MEM培養(yǎng)基。孵 育20分鐘后在室溫下，體積增加與3214優(yōu)化的-MEM培養(yǎng)基并且總的混 合物(100W)添加到細(xì)胞(500W)。 48小時(shí)后利用免疫印跡分析和免疫熒 光檢測(cè)基因沉默。 9.6免疫細(xì)胞化學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染如上文所述。在預(yù)定的時(shí)間，玻片上的細(xì)胞在室溫下 被80%丙酮固定5分鐘。然后細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩次，0.05 %吐溫-20和在封閉緩沖液封閉至少1小時(shí)PBS， 0.05%吐溫-20， 5%正 常山羊血清(NGS，Sigma)。 一抗被加入封閉緩沖液在室溫下封閉1小時(shí)， 用PBS， 0.05%吐溫-20洗滌3次并在室溫封閉緩沖液中用羅丹明標(biāo)記的二 抗孵育30分鐘。然后在進(jìn)行洗漆，將細(xì)胞核用0.21^g/ml Hoechst 33258染 色5分鐘，洗滌4次并分析。圖像是由奧林巴斯AX70熒光顯微鏡再加上 一個(gè)由分析@軟件所操作的索尼3CCD彩色攝像機(jī)(Soft Imaging System, Corp.)進(jìn)行獲得。為了描繪DCL蛋白質(zhì)分布，ED9, 10禾n 11小鼠的晶 胚的胚胎CD1在PBS中做短暫的洗滌和然后在室溫下用甲醇/丙酮/水(40:40:20)中固定4小時(shí)(MAW, Franco et al, 2001 )，然后儲(chǔ)存在70%乙 醇2周，在被嵌入蠟片之前(Kendall, Tyco Healthcare, Mansfield, MA 02048, USA)以6 厚的截面固定在SuperfrostTMPlus防脫玻片(Menzel-Gmser)。 TBS在所有下列步驟中被用來作為洗滌緩沖液。在二甲苯和梯度乙醇中清 洗后，切片在Bouin的定影液中被進(jìn)行后固定，由0.1%過氧化氫處理15min 洗滌和封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。為了減少非特異性吸附，用1%奶粉 PBS溶液(Campina, The Netherlands)作用30分鐘。DCL的一抗以1: 50 加入0.25X凝膠/0.5^TritonX-100的TBS (supermix)溶液中在室溫下作 用1小時(shí)，然后4'C過夜。二抗(biotinylated anti-rabbit,生物素標(biāo)記的抗兔 的抗體，Amersham Life Sciences, 1:200)在室溫下孵化小時(shí)30分鐘在 supermix 1中，擴(kuò)增親和素-生物素((ABC) ) ( Vector Laboratories, Burlingame)，生物素化酪胺(1: 500)與ABC孵育45分鐘之后，再與 0.01 %過氧化氫反應(yīng)30分鐘。最后在0.05 MTrisHCl緩沖液(pH7.6)中洗 滌兩次，這種緩沖液也可以用來溶解(DAB)(0.05M)。切片也可以被甲酚 紫復(fù)染和用Entellan封片劑蓋上蓋玻片(默克公司)。作為對(duì)比，以1:75稀釋度使用C-18微管相關(guān)蛋白特異性抗體(Santa Cruz Biotechnology, South Cruz CA, USA)， DCX蛋白質(zhì)的分布被映射在鄰 近的截面。象以上一樣，使用相同的方案，除了奶粉封閉的步驟是省略的 和生物素標(biāo)記的抗山羊抗體作為二抗。 9.7蛋白提取和免疫印跡分析小鼠組織和細(xì)胞溶解于溶解緩沖液(20mMtriethanolaminepH7.5, 140mM NaCl, 0.05% deoxycelate, 0,05% dodecyl sodium sulfate, 0.05% Triton X100, supplemented with Complete EDTA-free蛋白酶抑制劑混合物(羅氏分子生 化)并在16,000 g離心30分鐘。收集上清并使用Pierce方法測(cè)定蛋白濃度。 等量的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到immobilon-P的聚偏氟乙烯膜 (millipore)。雜交點(diǎn)與封閉緩沖液封閉1小時(shí)(Tris-buffered saline, 0.2% Tween 20 (TBST), 5%牛奶)，與一抗在封閉緩沖液中孵育1小時(shí)，用TBST 洗滌3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在封閉緩沖液中孵育30min并用 TBST洗滌3次。通過ECL檢測(cè)抗體的結(jié)合(Amersham法瑪西亞生物技 術(shù)公司)。 9.8磷酸酶處理DCL轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的NlE-115細(xì)胞溶解于裂解緩沖液(50mM Tris-HCl pH9.3， lmMMgC12, 0.1mMZnC12， 1 mM亞精胺補(bǔ)充Complete EDTA-free 蛋白酶抑制混合物(Roche Molecular Biochemicals)， 16,000 g離心30分鐘。 收集上清并使用Pierce方法測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)上清液分為含有為50Pg 蛋白質(zhì)的三份樣本。第一份個(gè)樣本是未經(jīng)處理的，第二份樣本是在37° C 沒有酶的情況下孵育30min和第三份樣本與10個(gè)單位的小牛腸道堿性磷 酸酶(promega生物科學(xué)公司)孵育。樣本如上文所述用免疫印跡進(jìn)行分 析。9.9微管蛋白聚合試驗(yàn)編碼被從pcDNA3.1中切除的cDNA的DCL表達(dá)建構(gòu)并且使用BamHl and EcoRl連接至(JpET28。 DCL表達(dá)構(gòu)建的結(jié)果被轉(zhuǎn)入BL21細(xì)胞。 一個(gè) 單克隆在500毫升LB培養(yǎng)基終長(zhǎng)至OD 0.7，此時(shí)IPTG以終濃度為0.4 mM 被添加到其中。誘導(dǎo)3小時(shí)后，收集細(xì)菌并用PBS洗滌和收集。通過重懸 重組的DCL蛋白被分離并通過高壓處理后，根據(jù)制造商的說明使用 probond (Invitrogen公司)鎳離子親和樹脂純化純化DCL集中到0.8 mg/ml 使用centricon 30濃度裝置。微管蛋白聚合檢測(cè)均根據(jù)Gleeson等人 (Gleeson et al., 1999, supra)使用微管蛋白聚合分析試劑盒(cat no BK006) 由細(xì)胞骨架。簡(jiǎn)單來說，1毫克微管蛋白被解散， 一點(diǎn)一毫升冰冷聚合緩 沖區(qū)根據(jù)制造商的指示和100 U L的，這是添加到10 u升DCL蛋白不同 濃度在96孔微板。隨后，吸收在340 nm處測(cè)量為30 '在30 "間隔使用 HTS2000 (Biorad/Perkin Elmer)。Del禾n DCL序列 SEQ ID NO: 1ccacgcgtcc geggagaace gcatttcaa_t g己ggaccagc tccagcgcat cagtgeacta gcggtcgcsg cttccagacg ctcgtgctcc gcagccccag ccgcgcccag cccggcgagg 3cagctcca_g cagccggccs cagacaaccc agcctccacc cgcga_ccggt tccatsagca sgccagccst gtcgttcggc agagatatgg agttggagca ttttgatg3g cgggaca己gg cgcagaggt己 cagcaggggg tcccgtgtga atggcctgcc ca_gccccaca cacagcgcccactgeagett ctsccgcacc cgcaccctgc agacactcag ctccgagasg 3aagcca_aga aggttcgatt ctacagaaat ggtgaccgct acttcaaagg aattgtgtst gccatctccc csgaccgctt cagstctttc gaggccctgc tggctgsttt gacccgaact etcteggataatgtgwtttgccccaggggccsgcctggaccagctggtgagaagctggacagcctcccgcgcsgtgtcttctttggcc3tttcattcgscccaagctgggg33ggctgtcagaa_tcctgctgaacaagactgscsttsccga^cgctstcaagctggactatgggaagcaggtgatgtgccttca_ggactgtggaccagsgssgttccgttaccaggatgtggtgaaatc33Cttctt3Cgcccaggaccttcccggagactggt3gtc3gctctctactccacgctcggcsgga^gcctgcggssgcsgagggacctgtcaggagactcttcSEQIDNO: 2gcscstccctgcactagtggccgc33ccg3a_gcccggccccgccgccgccccccagccctcggcgaggacagcsccsggaggcggccccctctccgcggaccggtcctscttgdsgtccsagcacttcga_cgagcgggattgccg3gcccgscgcacagcgcccactgcatcsgctccg3gaagaaggcc3sga^3gttcasgggsttgtgtstgcc3tctccccsg3ccatttgacccg3sctctgtcggataacgtgaccattgatgg3tttccsgcctatgtggctcttcaagaaacggtcggtgaacgtcaagsccacctcggcttaaggaagcccttcsgsggtgtcatcagaagtggcgtgaagctcsttcctttgagcaggtcctc3ccgst3tggtgaaacgcctgtscscgttggatgggatC七3C3CC3tcgstggsctcgctstgtctgcggctccs七cgsgccctttsccaactggtcsgtgaacgtcctgccssgggtgggccttcggsggttcgggtC3CC3tC3tcagsagtgggagscggctcactccttcgagcaggttctcaccggtgtggtgaagcgcctgtsc3ctctggtttttggtgacgstg3C3tttttattgcatstttcttgctgsatgtcgsgcstcagcgtcccgcagaggcC3gcctccsccagctcagttaatggaacccgcaagtC3ccaagtccatcaccc3cc3gccsccgccccctctcgtcggstgstttggsctgdcgccgcgctccagcagctgctgccgcccgcsgccccgc3gccccggccgcgcccsgccsgcgcggccacggcggcgtctcstgtccttcggcagagac3tggagctggg3t3csgccgsgggtcgcgggtgaacggccgcttctaccgcscccgcscgctgcagacgcgtttctstcgcg3t3cttcsggttccgstcttttgaggccctgctggctg3tttgccccsgggsgtga^gstggaccaactggtggaaggagagagttstgtggagtacacC33gaatgtgctcgggcagtgtcttcwtggccactgccaaggstttcsttcggcccaagctggtcaccactgtcaggattctgctgaactcaccgatgcC3tcasgctggactcgggag33C3ggtgst 38gtgccttcaggacttttttggtgstgatgstgctsgstcatcccgcsgccaccagctccgccaagcccccctctcttccaitttttatt aagtga_atgt gagcaccacc agttsatgga a±csccc3cc ggaitgacttggc3tgtgg3c cgagtggtaa aagagcccsg scccctggt3 agcccaggaa g3ttc3gt3gsgtcc3cttc gsccgtccsg gtcsgctctc gcctgcggaaccgttscc^gtactccgcgc gcagagggacgstgatttct 3t3gcttc3t tcccctgcct tcaggcaagt ctgtsccgccSEQ ID NO: 3Met Ser Phe Gly Arg Asp Met Glu Leu Glu His Phe Asp Glu Arg Asp15 10 15Lys Ala Gin Arg Tyr Ser Arg Gly Ser Arg Val Asn Gly Leu Pro Ser20 25 30Pro Thr His Ser Ala His Cys Ser Phe Tyr Arg Thr Arg Thr Leu Gin35 40 45Thr Leu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Lys Lys Val Arg Phe Tyr Arg Asn50 55 60Gly Asp Arg Tyr Phe Lys Gly lie Val Tyr Ala lie Ser Pro Asp Arg65 70 75 80Phe Arg Ser Phe Glu Ala Leu Leu Ala Asp Leu Thr Arg Thr Leu Ser85 90 95Asp Asn Val Asn Leu Pro Gin Gly Val Arg Thr lie Tyr Thr lie Asp100 105 110Gly Leu Lys Lys工le Ser Ser Leu Asp Gin Leu Val Glu Gly Glu Ser115 120 125Tyr Val Cys Gly Ser lie Glu Pro Phe Lys Lys Leu Glu Tyr Thr Lys130 135 140Asn Val Asn Pro Asn Trp Ser Val Asn Val Lys Thr Thr Ser Ala Ser145 150 155 160Arg Ala Val Ser Ser Leu Ala Thr Ala Lys Gly Gly Pro Ser Glu Val165 170 175Arg Glu Asn Lys Asp Phe lie Arg Pro Lys Leu Val Thr 工le 工le Arg180 185 190Ser Gly Val195 Thr Ala His210 Lys Leu Asp 225Gin Val MetLys Pro Arg Lys Ala Val Arg 工le Leu Leu Asn Lys Lys20〇 205 Ser Phe Glu Gin Val Leu Thr Asp工le Thr Asp Ala工le 215 220Ala Cys GlySer Gly Val Val Lys Arg Leu230 235 Cys Leu Gin Asp Phe Phe Gly245 250 Pro Glu Lys Phe Arg Tyr 260 265 Glu Ser Glu Cys Arg Val Val Lys Ser Thr275 280 Ser Ala Ser Arg Arg Gly Thr Thr Lys 290 295Tyr Thr Leu Asp Gly Lys 240Asp Asp Asp工le Phe工le 255Gin Asp Asp Phe Leu Leu Asp 270Ser Tyr Thr !Lys lie Ala 285Pro Gly Pro Ser Arg ArgSer !Lys Ser Pro Ala Ser Thr Ser SerSer300 Val Asn305 310 315Gin Leu Ser Thr Pro Arg Ser Gly Lys Ser Pro 325 330 Ser Leu Arg Lys Gin Arg Asp Leu 345Ser Gly Asp Ser Val 360AspSer Pro Gly340Ser Asp Asp Leu 355SEQ ID NO: 4Met Ser Phe Gly Arg 1 5 Lys Ala Gin Arg Tyr 20Pro Thr His Ser Ala 35Thr Leu Ser Ser Glu 50Gly Asp Arg Tyr PheGly Thr Pro Gly Ser 320Ser Pro Ser Pro Thr 335Tyr Arg Pro Leu Ser 350Asp Met Glu Leu 10Ser Arg Gly Ser 25His Cys Ser Phe 40Lys Lys Ala Lys 55Lys Gly工le ValGlu HisArg Va丄TyrLys 60Arg 45 ValTyr Ala 40Phe Asp Glu Arg Asp 15Asn Gly Leu Pro Ser 30Thr Arg Thr Leu Gin Arg Phe Tyr Arg Asn lie Ser Pro Asp ArgGly65 70 75 80Phe Arg Ser Phe Glu Ala Leu Leu A丄a Asp Leu Thr Arg Thr85 90 95Asp Asn Val Asn Leu Pro Gin Gly Val Arg Thr 工le Tyr Thr105 110 工le Ser Ser Leu Asp Gin Leu Val Glu Gly120 125 Ser 工le Glu Pro Phe Lys Lys Leu Glu Tyr 135 140 Asn Pro Asn Trp Ser Val Asn Val Lys Thr Thr Ser150 155 Val Ser Ser Leu Ala Thr Ala Lys 165 17 0Lys Asp Phe 工le Arg Pro Lys 185Pro Arg Lys Ala Val Arg 200Phe Glu Gin Val Leu Thr 215Asp Ser Gly Val Val Lys 230Leu Gin Asp Phe250Lys Phe Arg Tyr 265Val Val Lys Ser Thr 280Ser Thr Thr Lys Ser 295Ser Thr Ser310Pro Arg Ser Gly100Gly Leu Lys Lys 115Tyr Val Cys130 Asn Val 145Arg AlaArg Glu Asn180Ser Gly Val 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權(quán)利要求
1.一種SEQ ID NO1或2或SEQ ID NO1或2變異體的核酸片段在制備用于治療癌癥的組合物方面的應(yīng)用，所述的核酸片段能夠造成SEQ IDNO3或4的DCL-蛋白的數(shù)量的顯著減少。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述癌癥是指神經(jīng)外胚層起源的癌癥。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，用于治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤，髓母細(xì)胞瘤，膠 質(zhì)母細(xì)胞瘤，少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，寡樹突星狀膠質(zhì)細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤， 神經(jīng)纖維瘤，室管膜瘤，MPNST (惡性周圍神經(jīng)鞘瘤)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤， 神經(jīng)鞘瘤，橫紋肌肉瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，小細(xì)胞肺癌，腎上腺嗜鉻細(xì)胞 瘤，原始的PNET (周邊神經(jīng)外胚層腫瘤)，尤文氏肉瘤和黑色素瘤。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l-3任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述核酸片段是選自反義 RNA寡核苷酸，反義DNA寡核苷酸和/或雙鏈小干擾RNA。
5. —種SEQIDNO: 1或2的、或SEQIDNO: 1或2的變異體的有義和 /或反義核酸片段，其特征在于所述的核酸片段，當(dāng)其被導(dǎo)入到神經(jīng)外胚 層起源的癌細(xì)胞時(shí)能造成SEQ ID NO: 3或4的DCL-蛋白數(shù)量的顯著減 少。
6. —種組合物，其特征在于包含一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求4的核酸片段和一個(gè) 生理學(xué)上可接受的載體。
7. 根據(jù)前述的任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，所述組合物進(jìn)一步包含一 個(gè)或多個(gè)靶向化合物，其中所述的耙向化合物能夠在體內(nèi)或體外定位神經(jīng) 外胚層來源的癌癥細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述靶向化合物是一種免疫脂質(zhì)體 或單克隆抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8任意一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的組合物合適于治 療神經(jīng)外胚層起源的癌癥。
10. SEQ ID NO: 3的鼠doublecortin樣蛋白和SEQ ID NO: 4的人微 doublecortin樣蛋白。
11. 一種診斷神經(jīng)外胚層起源的癌癥的方法，包含步驟a)通過分析血清樣 本或一個(gè)主體的活檢樣本來檢測(cè)SEQ ID NO: 2 RNA或DNA的存在或缺 失和/或SEQ ID NO: 4 DCL蛋白存在或缺失和b)量化樣品中SEQ ID NO: 2禾口/或SEQ ID NO: 4存在的數(shù)量。
12. —種診斷試劑盒，包括引物，探針禾n/或能夠探測(cè)樣本中SEQIDNO:2 和/或SEQIDNO: 4的存在的抗體，以及所需要的檢測(cè)試劑和使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型的核酸和蛋白質(zhì)分子和它們?cè)诎┌Y的治療和診斷上的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/54GK101405392SQ200780009777
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2007年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月25日
發(fā)明者格拉德·約漢娜斯·普萊騰伯格, 派綽·凡·克威克-羅眉靖, 艾爾諾·維尤格登赫勒 申請(qǐng)人:普繞申薩公司