專利名稱：蛋白s融合用于蛋白增溶的用途的制作方法
蛋白S融合用于蛋白增溶的用途 與相關(guān)申請的交叉引用本申請要求Inouye等人在2006年3月20日提交的題為"The Use of Protein S Fusion for Protein Solubilization"的美國臨時(shí)申 請No. 60/783,998的優(yōu)先權(quán)。在本文通過引用將該申請的全部內(nèi)容并 入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于增加蛋白的產(chǎn)生和溶解度的系統(tǒng)。 依據(jù)C. F. R. 1. 821(f)的聲明根據(jù)§ 1.821(f),所附紙件拷貝和所附的分別根據(jù)37 C. F. R. § 1. 821 (c)和(e)提交的序列表的計(jì)算機(jī)可讀拷貝"18622-12 umdnj. st25. txt"的內(nèi)容是一致的。發(fā)明背景蛋白表達(dá)是醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)中的主要挑戰(zhàn)，因?yàn)榇罅康鞍桩?dāng)在多 種不同的常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)會變得不溶。已經(jīng)為從生物樣品的其 它組分分離和純化蛋白、尤其是重組蛋白開發(fā)了許多方案。這些純化 方法包括，尤其是，離子交換色譜，凝膠過濾，和親和色譜。因?yàn)榘?蛋白或耙蛋白的標(biāo)記對其所結(jié)合的純化試劑(例如抗體或配體)的特異性，親和色譜比其它方法更有效。多年來，為其親和純化而標(biāo)記蛋白已經(jīng)成為蛋白純化的選擇方法，目前用于酵母的蛋白組學(xué)研究，在更低的范圍用于高等真核生物。可 得到從短至6個(gè)氨基酸殘基的小肽(His標(biāo)記)至大至40 kDa的大蛋 白(MBP)的大量獨(dú)特標(biāo)記(參見綜述Stevens, R. C， 2000. Structure Fold Des 8: R177-85)。在使用的標(biāo)記中，His-標(biāo)記得到最廣泛且成功 的應(yīng)用，因?yàn)镠is-標(biāo)記的蛋白可以特異性地捕獲在Ni-NTA (鎳-次氮 基三乙酸)樹脂上，其可以用EDTA或咪唑洗脫。其它蛋白標(biāo)記例如麥芽糖-結(jié)合蛋白(MBP)、葡萄球菌蛋白A、釣調(diào)蛋白-結(jié)合肽(CBP)和谷 胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)也已經(jīng)用于原核生物和真核生物蛋白。但是， 許多這樣的親和技術(shù)的特異性不足以在一個(gè)步驟中純化標(biāo)記的蛋白， 因?yàn)榉翘禺愋缘鞍滓步?jīng)常被使用的樹脂捕獲。為了克服該問題，已經(jīng) 開發(fā)了使用2種不同標(biāo)記的親和純化系統(tǒng)，所述標(biāo)記串聯(lián)地融合至蛋 白的N-末端(Rigaut， G.，等人1999. Nat Biotechnol 17:1030-2)。 已經(jīng)顯示該TAP標(biāo)記(串聯(lián)親和純化)技術(shù)可以非常有效地鑒別與目 標(biāo)蛋白形成復(fù)合物的蛋白因子?，F(xiàn)有的融合標(biāo)記系統(tǒng)的缺點(diǎn)包括，標(biāo)記的融合蛋白的低溶解度和 在許多蛋白純化方案中常見的條件下不能純化標(biāo)記的蛋白。此外，現(xiàn) 有的融合標(biāo)記難以用于蛋白結(jié)構(gòu)的分析研究。例如，His標(biāo)記不能用 于為NMR結(jié)構(gòu)研究設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)镹i-NTA樹脂不能用于NMR波鐠分析，這是因?yàn)镹r+離子的順磁效應(yīng)導(dǎo)致峰的增寬，并干擾數(shù)據(jù)收集。因而，需要改良的標(biāo)記系統(tǒng)，其允許標(biāo)記的融合蛋白保持可溶和 穩(wěn)定而用于蛋白的純化和研究，包括分析技術(shù)，例如蛋白純化，NMR 和x-射線晶體分析，和鑒定與特定蛋白相互作用的蛋白因子。本文證 實(shí)本發(fā)明的蛋白S標(biāo)記技術(shù)是用于改善不穩(wěn)定蛋白的表達(dá)的優(yōu)異融合 標(biāo)記。蛋白S是黃色粘J求菌(#yiococci/s ;^/7^"s)的芽胞外被蛋白，所述黃色粘球菌是一種進(jìn)化的革蘭氏陰性細(xì)菌，其在營養(yǎng)耗盡后形成 多細(xì)胞的子實(shí)體(綜述參見(Dworkin， M.等人1985. Science 230: 18-24， Shimkets， L. J.等人1990. Microbiol Rev 54: 473-501))。 在子實(shí)體中，細(xì)胞被轉(zhuǎn)化成直徑為1 Mm的均勻的球形孢子(粘孢子)， 它們非?？垢稍锖蜔?。已經(jīng)證實(shí)，粘孢子具有稱作蛋白S的主要外被 蛋白，所述蛋白S以€&++依賴性的方式聚集在粘孢子表面上(11101^6， M等人，1979. Proc Natl Acad Sci USA 76:209-13)。來自黃色粘球菌的蛋白S的獨(dú)特之處是，當(dāng)它與蛋白的N-末端融 合時(shí)，會顯著增強(qiáng)該蛋白的產(chǎn)生和溶解度。重要的是，與本發(fā)明有關(guān) 的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，蛋白S與0mpR (—種轉(zhuǎn)錄因子)的融合不會影響0mpR的性質(zhì)(Harlockcr, S. L.等人1995. J Biol Chem 270: 26849-56)，表明蛋白S結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地折疊且不會與目標(biāo)靶蛋白相互作用。我 們現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，蛋白S標(biāo)記的蛋白可以被特異性地捕獲在粘孢子上，后者可以容易地從黃色粘球菌的子實(shí)體純化。蛋白S具有幾個(gè)獨(dú)特的特征。在有EDTA存在下或在高鹽濃度下， 蛋白S可以容易地釋放。此外，在加入Ca"后，純化的蛋白S可以容 易地重新集合在粘孢子表面上(Inouye， M.等人，l979. Proc Natl Acad Sci U S A 76:209-13)。單個(gè)粘孢子可以在其表面結(jié)合最高達(dá) 3. 3 x 106個(gè)蛋白S分子(I謹(jǐn)ye， M.等人，1979， Proc Natl Acad Sci USA 76:209-13)。已經(jīng)測定了其NMR溶液結(jié)構(gòu)(

圖1A; (Bagby， S. 等人1994. Structure 2:107-22),它由173個(gè)氨基酸殘基組成，且 具有2個(gè)串聯(lián)的Ca"-結(jié)合域。2個(gè)Ca++-結(jié)合域可重疊，由7個(gè)|3-鏈 和l個(gè)oc螺旋組成(圖1A)。已經(jīng)顯示，蛋白S晶體高度抗X-射線輻 射(Inouye， S. , 1980. J Biol Chem 255: 3713-4)。蛋白S的這些優(yōu) 點(diǎn)可用于多種應(yīng)用，如本發(fā)明所示。發(fā)明概述本發(fā)明提供了含有多克隆位點(diǎn)的載體，所述多克隆位點(diǎn)包含來自 黃色粘^求菌的PrS標(biāo)記或PrS2標(biāo)記。本發(fā)明也提供了提高靶蛋白的溶解度的方法，其包括使編碼來 自黃色粘球菌的蛋白S的至少一個(gè)N-末端結(jié)構(gòu)域(PrS標(biāo)記)的核酸序 列與編碼耙蛋白的核酸序列融合，以建立編碼PrS標(biāo)記的靶蛋白的核 酸序列；將步驟(a)的蛋白S標(biāo)記的靶蛋白置于栽體中；用該載體轉(zhuǎn)化 宿主細(xì)胞；和在適合基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，由此表達(dá)的PrS 標(biāo)記的耙蛋白比未標(biāo)記的靶蛋白更易溶。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用串 聯(lián)重復(fù)的PrS的N-末端結(jié)構(gòu)域，稱作PrS2標(biāo)記。本發(fā)明另外提供了與一個(gè)或多個(gè)黃色粘球菌粘孢子結(jié)合的PrS-標(biāo) 記的蛋白分子。也提供了純化PrS-標(biāo)記的蛋白的方法，其包括使PrS-標(biāo)記的蛋 白接觸包含黃色粘球菌粘孢子的親和樹脂，從而將蛋白S標(biāo)記的蛋白固定化在親和樹脂上。也提供了制備用于分析研究的靶蛋白的方法，其包括制備PrS-標(biāo)記的靶蛋白，和進(jìn)行分析研究。本發(fā)明另外提供了表征靶蛋白的方法，其包括使至少一個(gè)PrS 標(biāo)記或PrS2標(biāo)記與靶蛋白融合，進(jìn)行核磁共振波傳分析，和分析來自 核磁共振波譜分析的數(shù)據(jù)。附圖簡述圖1.蛋白S的NMR結(jié)構(gòu)和PrS2標(biāo)記的蛋白的圖示。A.結(jié)合有 Ca"離子的黃色粘球菌蛋白S的NMR結(jié)構(gòu)(Bagby， S.等人1994， Structure 2: 107-22)。 B.顯示了用于PrSz標(biāo)記的蛋白S的N-末端結(jié) 構(gòu)域(l-92)。蛋白S(l-92)的2個(gè)串聯(lián)重復(fù)(PrS》(橢圓形)融合在目標(biāo) 蛋白(白色框)的N-末端。圖2.野生型0rapR和PrS廣0mpR的對比。A. EnvZc和PrS廣0mpR 之間的復(fù)合物形成?；旌螮nvZc (4 juM)和PrS2-OmpR (4 m M)(泳道 4)或0mpR (4 MM)(泳道2),并在室溫在反應(yīng)緩沖液中溫育5 min。 對樣品進(jìn)行10°/。非變性PAGE。 B.從磷酸化的EnvZc (EnvZc-P)向 PrS2-OmpR的磷酸轉(zhuǎn)移。在反應(yīng)緩沖液[50 raM Tris-HCl (pH 8. 0) ， 50 mMKCl， 5mMCaCl2， 5%甘油]中，將純化的"p-標(biāo)記的EnvZc-P (2 jj M)與0mpR (4 yM)、 PrSfOmpR (4 MM)或0mpR (2 jjM)和PrS廣O即R (2 juM)的混合物混合。在室溫溫育最終的反應(yīng)混合物。在20， 40， 60, 和120秒取出等分試樣，用5 x SDS上樣緩沖液停止反應(yīng)。對樣品進(jìn) 行17. 5% SDS-PAGE。 C. EnvZc對磷酸化的PrS廣OmpR (PrS廣O即R-P) 的去磷酸化。首先將純化的標(biāo)記的EnvZc-P (2 "M)與OmpR (4 y M)、 PrS廣OmpR (4 m M)或OmpR (2 |a M)和PrS2-OmpR (2 jjM)的混合 物混合，并在室溫在反應(yīng)緩沖液[50mMTri-HCl (pH8. 0)， 50 mM KC1， 5 mM CaCh， 5%甘油]中溫育2 min，以產(chǎn)生OmpR-P或PrS2-OmpR-P。 以終濃度lmM加入ADP后，在20， 40， 60，和120秒取出等分試樣， 用5 x SDS上樣緩沖液停止反應(yīng)。對樣品進(jìn)行17.5% SDS-PAGE。 D. PrS2-OmpR-P的DNA結(jié)合。在DNA結(jié)合緩沖液中，將凝膠頂部指示的OmpR-P和PrS2-0mpR-P的不同混合物與30-bp FlF2a DNA片段相混合。 用5'-末端標(biāo)記的DNA片段進(jìn)行DNA凝膠遷移率變動分析，a; 2個(gè) OmpR-P分子/FlF2a復(fù)合物，b; 1個(gè)OmpR-P分子和1個(gè)PrS廣OmpR-P 分子/FlF2a復(fù)合物，和c; 2個(gè)PrS廣OmpR-P分子/FlF2a復(fù)合物。干燥 來自B、 C和D的凝膠，并曝光進(jìn)行放射自顯影。圖3. PrS2-OmpR與粘孢子的結(jié)合的表征。A.粘孢子的相差光學(xué) 顯微鏡照片(100 x放大率)。B. PrS2-OmpR以Ca"依賴性的方式結(jié)合 粘孢子。將純化的PrS廣OmpR (3 iag)與粘孢子混合，在4 。C ，在有 20 mM EDTA、 10 mM MgCh或10 mM CaCh存在下，在含有50 mM KC1 的50 mM Tris-HCl緩沖液中溫育1小時(shí)。洗滌后，離心收集粘孢子， 并懸浮于SDS上樣緩沖液中。在沸水浴中溫育樣品5 min，對它們的 上清液進(jìn)行17.5% SDS-PAGE。泳道1，使用的純化的PrS廣OmpR的總 量。C. EDTA可以釋放結(jié)合到粘孢子上的PrS廠OmpR。首先，在有CaCl2 存在下，進(jìn)行PrS廣OmpR向粘孢子的結(jié)合。離心收集粘孢子，使用與 結(jié)合所用相同的緩沖液洗滌。在有20 mM EDTA或10 mM CaCh存在下， 在含有50 mM KC1的50 mM Tris-HC1緩沖液中溫育所收集的粘孢子 15min。泳道1，使用的PrS2-OmpR的總量，和泳道6，結(jié)合到粘孢子 上的總PrS廣OmpR。 D.加入大腸桿菌溶胞產(chǎn)物中的純化的PrS廣OmpR 被粘孢子特異性捕獲。將純化的PrS2-OmpR (3 jag)與大腸桿菌 BL21 (DE3)溶胞產(chǎn)物相混合，檢查PrS2-OmpR與粘孢子的特異性結(jié)合(泳 道5)。泳道1，使用的PrS廣OmpR的總量；泳道2，加入純化的 PrS2-OmpR，沒有溶胞產(chǎn)物；泳道3，使用單獨(dú)的溶胞產(chǎn)物；泳道4， 加入溶胞產(chǎn)物，沒有PrS廣OmpR。 E.甚至在有4 M尿素存在下， PrS2-OmpR仍可以結(jié)合粘孢子。在有尿素(2, 3，和4M)存在下，檢查 PrS廣OmpR結(jié)合。泳道3-5，沒有溶胞產(chǎn)物；泳道7-9，有溶胞產(chǎn)物；泳 道6，使用PrS廣OmpR和大腸桿菌BL21(DE3)溶胞產(chǎn)物的混合物。圖4. DM pull-down實(shí)驗(yàn)。A.混合純化的EnvZcll (用于磷酸 化OmpR)和ompF啟動子(ompFp)的上游區(qū)域的DM片段，在室溫，在 沒有(泳道3)或有PrS2-OmpR (泳道4)存在下，在含有50 mM KCl、mM ATP的50 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中溫育 混合物30min。將粘孢子加入混合物，在4 。C另外溫育l小時(shí)。離心 收集粘孢子，對樣品的上清液進(jìn)行1.7%瓊脂糖凝膠電泳。泳道1， 100-bp標(biāo)志(Bio-Rad);泳道2， ompFPDNA片段。B.使用2種不同 的線性化的質(zhì)粒(用BamH I消化的pCR-ompFp和用EcoR I消化的 pET-EnvZc)的混合物，進(jìn)行與上述相同的實(shí)驗(yàn)。前一種質(zhì)粒含有在上 面A中使用的ompFp DNA片段，而后一種質(zhì)粒不含有OmpR結(jié)合位點(diǎn)。 對樣品進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳。泳道1， pCR-ompFp DNA片段和 pET-EnvZc DNA片段；泳道4，入/Hind III標(biāo)志。圖5.源自pCold(PST)III的pCold(PST)栽體的質(zhì)粒圖譜。A. pCold(PST)源自pColdIII載體(Qing, G.等人 2004. Nat Biotechnol 22:877-82)。 TEE:翻譯增強(qiáng)元件。B. TEV切割位點(diǎn)、 多克隆位點(diǎn)、凝血酶切割位點(diǎn)和為pCold(PST)載體設(shè)計(jì)的His6標(biāo)記的 DNA序列。圖6. TEV切割位點(diǎn)、為T-REx(PST)設(shè)計(jì)的多克隆位點(diǎn)的DNA序 歹寸。c一myc表4立[Glu—Gln—Lys—Leu—Ile—Ser—Glu—Glu—Asp—:Leu]圖7.源自pCold(PST)IV的pCold(PST)載體的質(zhì)粒圖譜。(a)表 達(dá)載體pCold(PST)的圖解。使用pCold IV構(gòu)建pCold(PST)，所述 pCold IV是冷激載體之一，可從Takara Bio Inc., Shiga, Japan得 到。PrS標(biāo)記顯示了插入PrS標(biāo)記或PrS2標(biāo)記的DNA片段的位置。PrS 標(biāo)記由蛋白S的N-末端結(jié)構(gòu)域Metl - Arg82加上Tyr93組成，而PrS2 標(biāo)記由2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的PrS標(biāo)記(Metl - Arg82)的序列加上Tyrl85組 成。(b)多克隆位點(diǎn)和凝血酶切割位點(diǎn)的序列。凝血酶切割位點(diǎn)， LVPRGS; CTG GTG CCA CGC GGT AGT，導(dǎo)入PrS標(biāo)記的Tyr83或PrS2 標(biāo)記的Tyrl85和含有Ndel、 Sall、 Xhol、 BamHI和Xbal位點(diǎn)的多克 隆位點(diǎn)之間。cspA 3'-UTR，翻譯增強(qiáng)元件，cspA 5'-UTR， lac操縱 基因，和cspA啟動子來自原始pCold IV載體。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種新穎的蛋白技術(shù)，稱作蛋白S標(biāo)記(PST)。也提供了對不能通過常規(guī)方法測定其結(jié)構(gòu)的蛋白的結(jié)構(gòu)研究的新穎方案。我們可以應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)來表征蛋白，無論來自原核生物還是來自真核生物，包括人蛋白。因?yàn)楸磉_(dá)系統(tǒng)械j殳計(jì)為PrS或PrS2標(biāo)記 可以被特定蛋白酶(例如TEV蛋白酶或凝血酶)切割掉，可以得到與 它們的天然形式相同的可溶蛋白。重要的是，我們證實(shí)了 PrS和PrS2 標(biāo)記對耙蛋白的功能幾乎沒有影響(Harlocker SL等人J Biol Chem. 1995)。如果靶蛋白在切割PrS或PrS2標(biāo)記后變得不溶，仍然可以表 征靶蛋白(作為與PrS或PrS2標(biāo)記的融合蛋白)的功能。當(dāng)將蛋白表達(dá)為與黃色粘球菌的蛋白S的N-末端結(jié)構(gòu)域的融合蛋 白時(shí)，它們變成表達(dá)為可溶蛋白。我們研究的結(jié)果表明，當(dāng)表達(dá)為與 蛋白S的融合蛋白時(shí)，可以顯著提高來自人、果蠅("r^op力27a)、 秀麗隱桿線蟲(Cae/2or力a6cT/〃s e7egs/2力的多種不溶或差表達(dá)的真核 生物蛋白以及來自大腸桿菌(^sc/ er/c力/a co//)的蛋白的溶解度和 表達(dá)水平。否則，蛋白以不溶形式表達(dá)。對于這些以及其它的應(yīng)用，稱作"PrS標(biāo)記"的單--個(gè)蛋白S的N-末端結(jié)構(gòu)域和稱作"PrS2標(biāo)記"的2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的來自黃色粘球菌的蛋白S的N-末端結(jié)構(gòu)域會不同地 影響靶蛋白。因此，本文提供了用于表達(dá)含有PrS標(biāo)記或PrS2標(biāo)記的 靶蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明也提供了具有超過2個(gè)來自黃色粘球菌的 蛋白S的N-末端結(jié)構(gòu)域的表達(dá)系統(tǒng)。在"嵌合分子"中，將2個(gè)或多個(gè)能單獨(dú)存在的分子連接到一起，形成具有其所有組成分子的希望的功能的單個(gè)分子。嵌合分子的組成 分子可以通過化學(xué)綴合以合成方式連接，或者當(dāng)組成分子都是多肽時(shí)， 可以重組地將編碼多肽的多核苷酸融合到一起，從而表達(dá)單個(gè)連續(xù)的 多肽。這樣的嵌合多肽稱作"融合蛋白"。"融合蛋白"是一種嵌合分子， 其中組成分子都是多肽且彼此結(jié)合(融合)，使得嵌合分子形成連續(xù)的 單鏈。不同的組分可以直接彼此結(jié)合，或可以通過一個(gè)或多個(gè)肽連接 物偶聯(lián)。提及嵌合分子(例如本發(fā)明的融合蛋白)時(shí)使用的"連接物"是指 連接或結(jié)合嵌合分子的組成分子的任意分子。當(dāng)嵌合分子是融合蛋白時(shí)，連接物可以是連接構(gòu)成融合蛋白的蛋白的肽。盡管除了結(jié)合蛋白 或在它們之間保持 一 定最小距離或其它空間關(guān)系以外，連接物通常不 具有特定的生物活性，但可以選擇肽間隔物的組成氨基酸，以影響分 子的有些性質(zhì)，例如折疊、靜電荷或疏水性。肽連接物可以任選地包 括蛋白酶消化位點(diǎn)，用于分離融合的組成多肽。為了制備下面討論的用于核磁共振研究的蛋白，優(yōu)選的連接物包含約1至約20個(gè)氨基酸殘 基。特別優(yōu)選的連接物包含約3至約IO個(gè)氨基酸殘基。構(gòu)建大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞中的蛋白S標(biāo)記(PST)表達(dá)系統(tǒng)本文使用的術(shù)語"載體"和"表達(dá)栽體"表示復(fù)制子，即作用為另一 種遺傳序列或元件(DM或RNA )可以與之相連接以造成所連序列或元 件的復(fù)制并因此可將該序列或元件運(yùn)送到宿主細(xì)胞中的載體或轉(zhuǎn)運(yùn)物 的任何物質(zhì)，如噬菌體、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、桿?；虿《尽１疚乃?述的大腸桿菌載體系統(tǒng)利用了 pCold載體(可從Takara Bio Inc.， Shiga, Japan得到)，其在低溫下誘導(dǎo)蛋白生成。本發(fā)明提供了一種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其使用PCold冷激栽體來 進(jìn)行蛋白純化和NMR結(jié)構(gòu)研究。哺乳動物四環(huán)素誘導(dǎo)型系統(tǒng)可以用于 鑒別會與活細(xì)胞中的目標(biāo)蛋白形成復(fù)合物的蛋白因子。該目標(biāo)蛋白在 本文中稱作"靶蛋白"，它是指PrS或PrS2標(biāo)記與之結(jié)合的蛋白、多肽 或其片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶分子是蛋白。本發(fā)明提供了含有多克隆位點(diǎn)的載體，所述多克隆位點(diǎn)包含編碼 來自黃色粘球菌的PrS標(biāo)記(SEQ ID N0: 1)或PrS2標(biāo)記(SEQ ID NO: 2)的核酸序列。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明使用從來自黃色粘球菌的 蛋白S的N-末端結(jié)構(gòu)域得到的一種或多種標(biāo)記。PrS和PrS2標(biāo)記優(yōu) 選地是蛋白S的氨基酸殘基l-93 (SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2)， 但是也可以是1-92殘基或1-94殘基，或可以是蛋白S的1-173之間的任意氨基酸殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的栽體的多克隆位點(diǎn)包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2。該載體可以是高表達(dá)冷激栽體，例如pColdIII 或pColdIV載體。pColdIII栽體對于在大腸桿菌中的表達(dá)是優(yōu)選的，因?yàn)樵撦d體的翻譯增強(qiáng)元件(TEE)(參見圖5)會提供更好的表達(dá)。在 TEE對翻譯具有負(fù)作用的情況下，沒有TEE的pColdIV表達(dá)(圖7) 是有用的。在哺乳動物系統(tǒng)中，優(yōu)選的載體是攜帶PrS2-標(biāo)記的蛋白的來自人 胚腎293細(xì)胞系的四環(huán)素誘導(dǎo)型PST表達(dá)系統(tǒng)(TREx-PST)。因而， 本發(fā)明提供了在哺乳動物宿主細(xì)胞、包括人細(xì)胞中表達(dá)的栽體。對于指定的核酸，本文使用的術(shù)語"編碼"表示儲存于核酸內(nèi)的 信息，用于翻譯成指定的蛋白。編碼蛋白的核酸可以在核酸的翻譯區(qū) 內(nèi)包括有非翻譯序列(例如內(nèi)含子)，或者可以缺乏這些間插的非翻 譯序列(例如在cDNA中)。通過使用密碼子指定編碼蛋白的信息。通 常核酸利用"通用的"遺傳密碼編碼氨基酸序列。本文使用的術(shù)語"密碼子，，表示核苷酸三聯(lián)體，它們一起規(guī)定了 多肽鏈中的氨基酸殘基。大多數(shù)有機(jī)體都使用20或21個(gè)氨基酸來制 備它們的多肽，所述多肽是蛋白或蛋白前體。因?yàn)镈NA中有著四種可 能的核苷酸，即腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、和胸腺嘧 啶(T )，所以存在64種可能的三聯(lián)體來識別僅20種氨基酸加上終止 信號。因?yàn)檫@種冗余性，大多數(shù)氨基酸由超過一種的三聯(lián)體編碼。規(guī) 定單個(gè)氨基酸的密碼子并不都是以均等頻率使用的。不同的有機(jī)體常 常表現(xiàn)出對編碼相同的給定氨基酸的若干密碼子中的一種的特別"偏 愛，，。如果編碼區(qū)含有高水平的罕見密碼子或罕見密碼子簇，通過重Sambrook和D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第3版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)， 15.12;通過引用將其并入本申請。因此可以進(jìn)行"密碼子選 擇，，以優(yōu)化在選定宿主中的表達(dá)。最優(yōu)選的密碼子是那些在高表達(dá)基 因中經(jīng)常能找到的密碼子。對于大腸桿菌中的"密碼子偏愛"，見 Konigsberg，等人，Proc. Nat/1. Acad. Sci. U.S.A. 80:687—91 (1983),在本文通過引用并入本申請。技術(shù)人員將認(rèn)識到，改變、添加或刪除編碼序列內(nèi)的單個(gè)氨基酸或一小部分氨基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白序列的個(gè)別替換、刪除 或添加是"保守修飾變體"，其中改變造成了氨基酸被化學(xué)相似氨基 酸替換。術(shù)語"保守修飾變體"適用于氨基酸和核酸序列。對于特定 的核酸序列，保守修飾變體表示那些編碼相同的氨基酸序列或氨基酸 序列的保守修飾變體的核酸。因?yàn)檫z傳密碼的簡并性，大量的功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白。例如，密碼子UUA、 UUG、 CUU、 CUC、 CUA、和CUG都編碼氨基酸亮氨酸。因此，在密碼子規(guī)定為亮氨酸的每 一個(gè)位置，密碼子可以被改變成任何所述的相應(yīng)的密碼子，而不改變 所編碼的多肽。這些核酸變異是"沉默變異"，它們代表一類保守修 飾變異。根據(jù)遺傳密碼，在本文編碼多肽的每一種核酸序列也描述了 核酸的每種可能的沉默變異。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到核酸中 的每個(gè)密碼子(除了 AUG，其通常是曱硫氨酸的唯一密碼子；和UGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)都可以被修飾而產(chǎn)生功能相同的分子。 因此，編碼本發(fā)明的多肽的核酸的每種沉默變異都是在本發(fā)明的范圍 之內(nèi)。本發(fā)明包括蛋白S的活性部分、片段、衍生物、突變體、和功能 變體，它們保留蛋白S的任何生物學(xué)性質(zhì)。結(jié)合對的一個(gè)成員可以用于"標(biāo)記"目標(biāo)蛋白，另一個(gè)成員用作親 和配體或"親和樹脂"。這樣的蛋白"標(biāo)記"可以重組地"融合"和表達(dá)， 以生成連有標(biāo)記的融合蛋白。然后通過與標(biāo)記的結(jié)合伴侶的相互作用， 親和純化"標(biāo)記的"融合蛋白，然后任選地切割標(biāo)記，以釋放純蛋白。術(shù)語"基因"表示位于編碼特定功能產(chǎn)物(即蛋白或RM分子) 的DNA區(qū)段的特定位置上的有序的核苷酸序列。它可以包括在編碼DNA 之前和之后的區(qū)域以及在外顯子之間的內(nèi)含子。術(shù)語"誘導(dǎo)"或"可誘導(dǎo)的/誘導(dǎo)型"表示通過將細(xì)胞暴露于誘導(dǎo) 物或條件(例如熱)增加其轉(zhuǎn)錄或合成的基因或基因產(chǎn)物。術(shù)語"誘導(dǎo)物"或"誘導(dǎo)劑"表示低分子量的化合物或物理因子， 其與阻遏蛋白相結(jié)合生成不再能與操縱基因相結(jié)合的復(fù)合物。術(shù)語"誘導(dǎo)"表示引起一些特殊效應(yīng)的行為或方法，例如特定基因或操縱子的轉(zhuǎn)錄、或在有機(jī)體暴露于特殊刺激之后的蛋白生成。在向細(xì)胞內(nèi)插入核酸的上下文中的術(shù)語"導(dǎo)入"、"轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn) 化"和"轉(zhuǎn)導(dǎo)"包括表示將核酸摻入到原核細(xì)胞或真核細(xì)胞內(nèi)，其中 核酸可以被整合到細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，被轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子，或者被短暫表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。 術(shù)語"分離的"表示物質(zhì)例如核酸或蛋白，其實(shí)質(zhì)上從其天然存 在的環(huán)境中所能發(fā)現(xiàn)的通常伴隨于它的或與它相互作用的組分中游或者如果物質(zhì)是處于其天然的環(huán)境中，那么該物質(zhì)已經(jīng)被有意的人為 干涉所合成地(非天然地)改變。例如"分離的核酸，，可以包括被插 入到載體(例如質(zhì)粒或病毒載體)內(nèi)的DNA分子，或者被整合到原核 或真核細(xì)胞或宿主有機(jī)體的基因組DNA內(nèi)的DNA分子。當(dāng)應(yīng)用于RNA 時(shí)，術(shù)語"分離的核酸"主要表示如上定義的分離的DM分子所編碼 的RNA分子?；蛘?，該術(shù)語可以表示已經(jīng)被充分地與其天然狀態(tài)(即 細(xì)胞或組織內(nèi))中通常與其相伴的其它核酸分離開的RNA分子。分離 的核酸(DNA或RM)還可以表示用生物學(xué)或合成工具直接生成的并且 與其產(chǎn)生過程中存在的其它組分分離開的分子。本文使用的術(shù)語"核酸"或"核酸序列"包括任何DNA或RNA分 子，單鏈或雙鏈，以及如果是單鏈，包括它的線型或環(huán)型的互補(bǔ)序列 分子。在討論核酸分子時(shí)，在本文可以根據(jù)按5，到3，方向提供序列 的正常約定描述特定核酸分子的序列或結(jié)構(gòu)。除非有其它的限定，該 術(shù)語包括已知的類似物。術(shù)語"寡核苷酸"表示由經(jīng)磷酸二酯鍵連接的兩個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選 地超過3個(gè))核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸組成的核酸分子。術(shù)語"操縱基因，，表示位于基因上游(5，)的并且一種或多種調(diào) 節(jié)蛋白(阻抑物或激活物)與其結(jié)合以控制基因表達(dá)的DNA區(qū)域。本文使用的術(shù)語"操縱子"表示用于控制基因表達(dá)的功能整合的 遺傳單位。它是由一個(gè)或多個(gè)編碼一種或多種多肽的基因以及通過調(diào) 節(jié)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄而控制其表達(dá)的鄰近位點(diǎn)(啟動子和操縱基因)組成。術(shù)語"表達(dá)操縱子"表示可以具有轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的核酸片 段，所述序列例如啟動子、增強(qiáng)子、翻譯起始信號、多腺苷酸化信號、 終止子等，其促進(jìn)了多肽編碼序列在宿主細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)的表達(dá)。短語"可操縱地連接，，包括表示啟動子和第二序列之間的功能性連接，其中啟動子序列啟動并介導(dǎo)對應(yīng)于第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。 一般而言，可操縱地連接意思是所連接的核酸序列是連續(xù)的，對于必 須連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)的情況，所連接的核酸序列是連續(xù)的并位于相 同的閱讀框內(nèi)?？s寫"0RF"代表"開放閱讀框"，其是基因序列的一部分，它含 有不被內(nèi)在終止序列中斷的堿基序列，并且它具有編碼肽或蛋白的潛 能。開放閱讀框開始于起始密碼子并終止于終止密碼子。終止或末端 密碼子決定了多肽的末端。術(shù)語"多肽"、"肽，，和"蛋白"在本文可互換使用，表示氨基 酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)天 然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然 存在的氨基酸的聚合物?？s寫"PCR"表示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其是擴(kuò)增DM的量的技術(shù)，因 此使得DM更容易被分離、克隆和測序。見例如美國專利No. 5,656,493、 5，33，675、 5，234，824、和5, 187, 083,在本文通過引用 將每個(gè)專利的內(nèi)容都并入本申請。本文使用的術(shù)語"啟動子，，包括轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游(5')的DM區(qū)域， 其參與RNA聚合酶和其它蛋白的識別和結(jié)合，以《更啟動轉(zhuǎn)錄。術(shù)語"誘 導(dǎo)型啟動子"表示應(yīng)答于特定化合物(即誘導(dǎo)物或誘導(dǎo)劑)的存在或 應(yīng)答于限定的外部條件(例如升高的溫度)而激活的啟動子。短語"定點(diǎn)誘變，，表示一種體外技術(shù)，其利用重組DNA方法將堿 基變化即突變引入到一段DNA的特定位點(diǎn)。本文使用的術(shù)語"非翻譯區(qū)"或UTR表示其堿基不參與蛋白合成 的DNA部分。術(shù)語特定序列核酸的"變體，，、"突變體"和"衍生物"表示與特定序列緊密相關(guān)的核酸序列，但是它們可以天然地或通過設(shè)計(jì)具有 序列或結(jié)構(gòu)上的變化。"緊密相關(guān)"意思是在限定長度的核酸序列上，序列的至少約60%，但是常常超過85%的核苷酸是匹配的。緊密相關(guān)的 核酸序列之間的核苷酸序列的變化或差異可以代表在正常復(fù)制或該特 定核酸序列性狀被重復(fù)過程中生成的序列中的核苷酸變化。對于特殊 的目的，可以特異地設(shè)計(jì)出其它的變化，并將其引入到序列內(nèi)。利用 各種誘變技術(shù)可以在體外生成這些特定的變化。這些特異生成的序列 變體可以被稱作原始序列的"突變體"或"衍生物"。技術(shù)人員可以生成具有單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失、添加或替 換的蛋白變體。這些變體尤其可以包括(a)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸 殘基被保守或非保守氨基酸替換的變體；(b)其中添加了一個(gè)或多個(gè) 氨基酸的變體；(c)其中至少一個(gè)氨基酸包括取代基的變體；(d) 其中在保守或非保守位點(diǎn)上來自 一個(gè)物種的氨基酸殘基被替換為另一 個(gè)物種的相應(yīng)殘基的變體；和(d)其中靶蛋白與另一種肽或多肽例如 融合伴倡、蛋白標(biāo)記或其它可賦予靶蛋白有用的性能的化學(xué)部分例如 抗體的表位融合的變體。技術(shù)人員已知用于獲得這些變體的技術(shù)，包 括遺傳學(xué)的(抑制、缺失、突變等)、化學(xué)的和酶的技術(shù)。親和純化粘孢子用于親和純化的用途本發(fā)明也提供了純化PrS-標(biāo)記的或PrS廣標(biāo)記的蛋白的方法，其 包括，使標(biāo)記的蛋白接觸包含黃色粘球菌粘孢子的親和樹脂，從而將 PrS-標(biāo)記的或PrS廣標(biāo)記的蛋白固定化在所述親和樹脂上。也提供了結(jié) 合到一個(gè)或多個(gè)黃色粘球菌粘孢子上的PrS-標(biāo)記的或PrS「標(biāo)記的蛋 白分子。在有Ca^或Mg ^存在下，PrS或PrS2標(biāo)記可以結(jié)合于粘孢子(黃 色粘球菌的孢子)的表面。在該純化方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在有Ca^ 或Mg 2+存在下，使PrS-標(biāo)記的或PrS廣標(biāo)記的蛋白接觸親和樹脂。通 過加入螯合鈞或鎂的試劑，使PrS-標(biāo)記的或PrS2-標(biāo)記的蛋白從親和 樹脂釋放。因而，使用粘孢子，可以特異性地分離PrS廣標(biāo)記的靶蛋白， 因?yàn)樗Y(jié)合于粘孢子的表面，且可以通過加入EDTA或EGTA等螯合試劑而容易地從粘孢子的表面釋放。對于作為蛋白親和純化中的樹脂的用途，用25 mM EDTA洗滌粘 孢子，以去除粘孢子表面上存在的蛋白S和蛋白C。純化的粘孢子由 直徑約1 Mm的均一^^形顆粒組成。它們可以長時(shí)間地均勻地懸浮于 溶液中。值得注意地，粘孢子具有對蛋白S的高吸附能力(3. 3 x 106 分子/孢子)，這對于蛋白的親和純化也是理想的。通過簡單地在4 。C將粘孢子與溶胞產(chǎn)物溫育1小時(shí)，然后通過低 速離心收集這些粘孢子，可以容易地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的親和純化。融合蛋 白與粘孢子的親和力是在l(T9 M的范圍內(nèi)，粘孢子可以特異性地捕獲 在大腸桿菌細(xì)胞中以非常低的水平表達(dá)的融合蛋白。本發(fā)明也提供了根據(jù)本發(fā)明的方法純化的蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，純化的蛋白是PrS-標(biāo)記的或PrS廣標(biāo)記的蛋白。本發(fā)明也提供了一種試劑盒，其包含親和樹脂和用于純化PrS-標(biāo) 記的蛋白的方法中的說明書。試劑盒另外包含產(chǎn)生PrS-標(biāo)記的蛋白的 組分。術(shù)語"親和配體"或"親和試劑"是指以高親和力特異性地結(jié)合同源 配體的試劑。這樣的試劑可以結(jié)合到稱作"基質(zhì)"、"樹脂"或"基 質(zhì)材料"的支持物上，形成"親和基質(zhì)"或"樹脂基質(zhì)"或"親和樹脂"。本發(fā)明的親和樹脂包含稱作黃色粘球菌"粘孢子"的黃色粘球菌孢子或 其衍生物或片段，其能結(jié)合它相應(yīng)的同源配體。同源配體可以"固定化 "或"保持"或"結(jié)合"在基質(zhì)上，直到用釋放劑釋放。"釋放劑"是指一種組合物，其能從親和基質(zhì)釋放固定化的、結(jié)合 的分子(例如從粘孢子親和樹脂基質(zhì)釋放結(jié)合的PrS-或PrS廣標(biāo)記的分子)。本發(fā)明的釋放劑可以通過多種機(jī)制起作用，包括螯合二價(jià)陽離子， 蛋白的變性，和蛋白酶消化以將結(jié)合的標(biāo)記與它所連的分子分離。 分析技術(shù)本發(fā)明的方法適用于表征蛋白，無論來自原核生物還是來自真核 生物的蛋白，包括人蛋白。因?yàn)楸磉_(dá)系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為PrS或PrS2標(biāo)記可 以被特定蛋白酶(例如TEV蛋白酶或凝血酶)切割掉，可以得到與它們的天然形式相同的可溶蛋白。以前我們已經(jīng)證實(shí)了 PrS和PrS2標(biāo)記 對靶蛋白的功能具有可忽略的影響或沒有影響(Harlocker SL等人J Biol Chem. 1995)。因此，如果華巴蛋白在切割PrS或PrS2標(biāo)記后變得不溶，仍然可以表征作為與PrS或PrS2標(biāo)記的融合蛋白的靶蛋白的功臺匕 b匕。重要的是，本發(fā)明的PrS和PrS2標(biāo)記對蛋白酶是高度穩(wěn)定和抗性 的。此外，已經(jīng)通過NMR確定了蛋白S的結(jié)構(gòu)(Bagby S等人Proc Natl Acad Sci USA. 1994， Wenk M等人J Mol Biol. 1999),并已經(jīng)證實(shí) 其容易地形成晶體。通過使用這些優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的PrS和PrS2標(biāo)記可 以用于對高濃度的不穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)研究，例如核磁共振(NMR)和X-射線晶體分析。我們已經(jīng)證實(shí)，與PrS2標(biāo)記融合的靶蛋白的NMR譜不 受PrS2標(biāo)記的影響。當(dāng)乾蛋白與PrS2標(biāo)記相融合時(shí)，PrS2標(biāo)記改善靶 蛋白晶體的形成。捕獲在粘孢子上的蛋白S-標(biāo)記的蛋白的NMR結(jié)構(gòu)研究 存在大量的不能通過常規(guī)技術(shù)(X-射線和NMR)來確定其三維結(jié)構(gòu) 的蛋白，因?yàn)檫@些蛋白不穩(wěn)定或在溶液中溶解度差。通過使用捕獲在 粘孢子上的PrS-或PrS廣標(biāo)記的蛋白，本發(fā)明提供的技術(shù)克服了該問 題。使用結(jié)合于粘孢子表面的PrS2標(biāo)記的該性質(zhì)，也可能從PrS2-標(biāo)記 的靶蛋白的NMR譜中消除PrS2標(biāo)記的譜。因?yàn)镻rS2標(biāo)記與粘孢子表面 的相互作用會限制它的移動，將顯著減弱它的信號。這樣的導(dǎo)致減弱 的信號的限制作用稱作增寬效應(yīng)。另一方面，通過柔性連接物與PrS2 標(biāo)記融合的靶蛋白會保留它的自由旋轉(zhuǎn)運(yùn)動，導(dǎo)致產(chǎn)生令人滿意的信 號用于NMR研究。重要的是注意到連接PrS2標(biāo)記和靶蛋白的連接物在 PrS廣標(biāo)記的融合蛋白的結(jié)晶和NMR研究中具有關(guān)鍵作用。因此，設(shè)計(jì)含有不同長度的連接物的表達(dá)系統(tǒng)是有用的。優(yōu)選的連接物包含約1 至約20個(gè)氨基酸殘基。特別優(yōu)選的連接物包含約3至約10個(gè)氨基酸 殘基。權(quán)利要求l的方法，其中所述PrS-標(biāo)記的蛋白包含在蛋白S和 靶蛋白之間的連接物。本發(fā)明的方法包括制備用于分析研究的靶蛋白，其包括制備PrS-標(biāo)記的或PrS廣標(biāo)記的耙蛋白，和進(jìn)行分析研究。除了 NMR以外，在本 發(fā)明中有用的其它研究包括藥物篩選測定、結(jié)合測定和X-射線晶體分 析或需要可溶靶蛋白的任意研究。在本文和所附的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式"一/該"包括復(fù)數(shù) 指示，除非在上下文中有清楚的其它說明。除非另有定義，本文使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明 所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或 測試中也可以使用與本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和 材料，現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。在本文通過引用將在本文所提及 的所有出版物都并入本申請，用于公開和描述與所引用文獻(xiàn)相關(guān)的方 法和/或材料。實(shí)施例給出下面的實(shí)施例，以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供關(guān)于如何制 備和利用本發(fā)明的完整闡述和說明，這并不打算限制本發(fā)明人所視為 本發(fā)明的范圍，也不打算表示下面的試驗(yàn)是所能實(shí)施的全部或唯一的 試驗(yàn)。已經(jīng)努力保證所用數(shù)字(例如量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但是一 些試驗(yàn)誤差和偏差應(yīng)該考慮到。除非有其它不同的說明，份數(shù)是重量 份，分子量是重量平均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近 大氣壓。對于在本文所給出的數(shù)值范圍，要明白到下限單位的1/10 (除非上下文中有不同的說明)、該范圍的上限和下限之間的每個(gè)間插數(shù)值以及任何其它在該指定范圍內(nèi)的指定的或間插的數(shù)值都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？赡鼙华?dú)立地包含于較小范圍內(nèi)的這些較小范圍的上限和下限也包括在本發(fā)明中，指定的范圍中可有任何特別排除的極限。指定的范圍包含極限值之一或兩者時(shí)，排除了那些所包括的極限值之一或兩者的范圍也包括于本發(fā)明內(nèi)。在本文所討論的出版物僅僅提供其在本申請?zhí)峤蝗掌谥暗墓_ 內(nèi)容。太子w^M5T朝A擁:7;^赫據(jù)齟力^IU人太洽-日月矛,奴因A杏.步日/先于這些出版物。此外，在本文所提供的出版物的日期可能不同于實(shí) 際的出版日期，這可能需要獨(dú)立地驗(yàn)證。蛋白S-0mpR融合OmpR是大腸桿菌的一種轉(zhuǎn)錄因子，它是編碼主要外膜蛋白的ompF 和ompC基因的交互表達(dá)所必需的。以前，將它融合至蛋白S的N-末 端結(jié)構(gòu)域(殘基1-92)的2個(gè)串聯(lián)重復(fù)(稱作PrS2-0mpR)，以測定在ompF 啟動子的上游區(qū)域中OmpR-結(jié)合位點(diǎn)的確切數(shù)目(Harlocker， S. L.等 人1995. J Biol Chem 270: 26849-56)。蛋白S在0mpR的N-末端的 這種融合，沒有妨礙0mpR的DNA結(jié)合能力，因而當(dāng)以不同比例混合 0mpR和PrS2-0mpR時(shí)，允許在DNA延滯測定中梯的形成。最近，我們進(jìn)行了對0mpR結(jié)合DNA的詳細(xì)分子機(jī)制的進(jìn)一步表征。 在這些實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)(a) PrS廣0mpR在pET表達(dá)系統(tǒng)中以 比野生型0mpR明顯更高的水平表達(dá)，和(b) OmpR在溶液中的溶解度 被蛋白S融合顯著(超過20倍)提高。意義1. 所提出的使用在大腸桿菌中的pCold的蛋白S-標(biāo)記(PST)載體 是一種最通用的表達(dá)系統(tǒng)，其允許(a)非常高水平的表達(dá)，(b)不 能由任何其它表達(dá)系統(tǒng)容易地表達(dá)的蛋白的表達(dá)，(c)不穩(wěn)定蛋白的 表達(dá)，和(d)否則會表達(dá)在包涵體內(nèi)的蛋白的溶解度的顯著提高。這 些特征提供了在用同位素("N和"C)標(biāo)記靶蛋白用于NMR研究中的巨 大優(yōu)勢。2. 所提出的在哺乳動物細(xì)胞中的PST載體系統(tǒng)允許鑒別蛋白復(fù) 合物的形成和蛋白-蛋白相互作用。更具體地，該系統(tǒng)可以鑒別僅在活 細(xì)胞中形成復(fù)合物的蛋白因子。3. 粘孢子的應(yīng)用在下述3個(gè)方面值得注意(a)制備黃色粘球菌 培養(yǎng)物非常容易，最終的純化的粘孢子相對便宜，(b)它們是均一的， 可以通過輻射轉(zhuǎn)化成完全無生物活性的顆粒(以預(yù)防萌發(fā))，所以它們 可以重復(fù)用于無限次數(shù)的實(shí)驗(yàn)，(c)粘孢子的密度相對低，使其更容易 重懸于均質(zhì)的懸浮液中。4. 我們發(fā)現(xiàn)，甚至在有4M尿素存在下，蛋白S仍然可以結(jié)合粘 孢子。因此，盡管有些與蛋白S融合的蛋白形成包涵體，在用4M尿素 溶解后，可以重新折疊這些蛋白，并使用粘孢子進(jìn)行純化。實(shí)際上， 一個(gè)類似的方案成功地用于His-標(biāo)記的蛋白。5. 所提出的本發(fā)明的PST技術(shù)是新穎的且非常通用的，預(yù)期會為 蛋白技術(shù)作出重大貢獻(xiàn)。C.初步研究1.與0mpR融合的PrS2標(biāo)記不會影響0mpR的性質(zhì) 將0mpR (大腸桿菌的一種轉(zhuǎn)錄因子)融合至蛋白S的N-末端結(jié) 構(gòu)域(殘基1-92)的2個(gè)串聯(lián)重復(fù)(稱作PrS廣0mpR),以測定在ompF 啟動子的上游區(qū)域中OmpR-結(jié)合位點(diǎn)的精確數(shù)目(Harlocker， S， L., 等人1995. J Biol Chem 270:26849-56)。 0mpR是參與雙組分信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)系統(tǒng)的響應(yīng)調(diào)節(jié)物，它的同源組氨酸激酶是EnvZ。 EnvZ會在保守的 Asp殘基(D55)磷酸化0mpR，以產(chǎn)生磷酸化的0mpR (0mpR-P),且也可 以將OmpR-P去磷酸化。通過監(jiān)測(i) EnvZ的月包質(zhì)域(EnvZc)和0mpR 之間的復(fù)合物形成，(ii) 0mpR的磷酸化和OmpR-P的去磷酸化，和 (iii) 0mpR的DNA結(jié)合，我們檢查了與0mpR融合的PrS2標(biāo)記是否會 影響0mpR的性質(zhì)。已知EnvZc/0mpR復(fù)合物可以通過非變性PAGE容易地檢測到 (Yoshida, T.等人2002. Mol Microbiol 46:1273-82)。如圖2A所 示，當(dāng)混合純化的0mpR和EnvZc并進(jìn)行10%非變性PAGE時(shí)，它們形 成復(fù)合物(泳道2)，其遷移得比0mpR和EnvZc (分別是泳道1和3)慢。 我們測試了 PrS2標(biāo)記是否會影響EnvZc和0mpR之間的復(fù)合物形成。 當(dāng)混合純化的EnvZc和PrS廣0mpR時(shí)，它們也形成復(fù)合物(泳道4)， 表明與0mpR融合的PrS2標(biāo)記不會妨礙EnvZc和0mpR之間的復(fù)合物形 成。接著，我們檢查了 EnvZc和OmpR的酶性質(zhì)是否受OmpR與PrS2標(biāo) 記的融合的影響。首先，測試了 EnvZc-P對PrS廣0mpR的磷酸化。當(dāng) 混合OmpR和純化的"P-標(biāo)記的磷酸化EnvZc (EnvZc-P)時(shí)，EnvZ上的磷酰基立即轉(zhuǎn)移給0mpR,該反應(yīng)在120秒內(nèi)完成(泳道2-5，圖2B)。 當(dāng)用PrS2-OmpR進(jìn)行該反應(yīng)時(shí)，EnvZc-P能磷酸化PrS廣OmpR,結(jié)果與 未標(biāo)記的OmpR幾乎相同(泳道7-10，圖2B)。竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)， OmpR和PrS廣OmpR是EnvZc-P的同樣好的底物(泳道12-15，圖2B)。 其次，檢查了磷酸化PrS廣OmpR的去磷酸化。如上所述創(chuàng)建OmpR-P后， 在加入ADP后觀察OmpR-P的去磷酸化，ADP已知是該反應(yīng)的輔因子 并會刺激EnvZc的躊酸酶活性。OmpR-P被迅速地去磷酸化，釋放出Pi, 如圖2C的泳道3-6所示。盡管在PrS2-OrapR的情況下，該反應(yīng)被PrS2 標(biāo)記減慢，磷酸化的PrS廣OmpR被EnvZc去磷酸化(泳道9-1" 。 OmpR 和PrS2-OmpR之間的竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)再次證實(shí)，OmpR-P和PrS廣OmpR等同地 充當(dāng)EnvZc的底物(泳道15-18)。最后，我們測試了 PrS廠OmpR與DNA的結(jié)合是否受PrS2標(biāo)記的影 響(圖2D)。已知2個(gè)OmpR-P分子可以結(jié)合每個(gè)20-bp結(jié)合位點(diǎn)，在 DNA上形成二聚體樣結(jié)構(gòu)。當(dāng)混合OmpR-P和30-bp DNA片段(FlFh， 它具有20-bp Fl位點(diǎn)和F2的半位點(diǎn)(F2a))時(shí)，檢測到OmpR-P/FlF2a 復(fù)合物[條帶(a)，泳道2]。當(dāng)混合PrS廣OmpR時(shí)，PrS廣0mpR/FlF2a復(fù) 合物遷移得比OmpR-P/FlF2a復(fù)合物慢得多，PrS廣OmpR/ FlF2a復(fù)合 物條帶的遷移被進(jìn)一步延滯[條帶(c)，泳道8]。 一旦將OmpR和 PrS廣OmpR的多種不同混合物與FlF2a相混合時(shí)，在條帶(a)和條帶(c) 之間出現(xiàn)另一個(gè)新條帶[在泳道3-7中的條帶(b)]。該條帶源自1個(gè) OmpR分子和1個(gè)PrS2-OmpR分子與FlF2a的結(jié)合，表明PrS2標(biāo)記不會 影響OmpR的DNA結(jié)合能力以及結(jié)合在DNA上的OmpR分子之間的相互作用。這些數(shù)據(jù)清楚地證實(shí)，融合到OmpR上的PrS2標(biāo)記不會改變OmpR 的性質(zhì)，表明PrS2標(biāo)記域的折疊獨(dú)立于OmpR。2.PrS「OmpR與粘孢子的結(jié)合是0&++依賴性的為了檢查新構(gòu)建的PrS2片段(蛋白S的N-末端結(jié)構(gòu)域的2個(gè)串聯(lián) 重復(fù))以及PrS廣OmpR是否能結(jié)合粘孢子，我們從黃色粘球菌的10天 成熟子實(shí)體制備了粘孢子。我們從1.5L培養(yǎng)物能收獲約2 g純化的粘孢子。通過在使用前用20mMEDTA洗滌它們，從粘孢子徹底去除蛋 白S (Inouye， M.等人，1979. Proc Natl Acad Sci US A 76:209-13) 和蛋白C (McCleary， W. R.等人1991. J Bacterial 173:2141—5)。首先，我們測試了 PrS2-OrapR是否以Ca"離子依賴性的方式結(jié)合無 蛋白S的粘孢子。在有20 mM EDTA、 10 mM MgCh或10 mM CaCh存在 下，在100 ju 1含有50 mM KC1的50 mM Tris-HCl (pH 8. O)緩沖液 中，混合純化的PrS廣OmpR (3 jLig)和粘孢子，在4 。C溫育最終的混 合物1小時(shí)。使用微量離心機(jī)(Biofuge Pico， SORVALL)，以6， 500 rpm 離心3 min收集粘孢子，用相應(yīng)的結(jié)合緩沖液洗滌粘孢子沉淀一次。 將最終的粘孢子沉淀懸浮于20 w 1 SDS-上樣緩沖液[20 mM Tris-HCl (pH 6.8)， 40 mM P-巰基乙醇，0.8% (w/v) SDS, 4%甘油，和0.04% (w/v)溴酚藍(lán)]中。在沸水浴中溫育粘孢子懸浮液5min。通過該處理， 僅結(jié)合到粘孢子表面上的蛋白被溶解，但是粘孢子的胞內(nèi)蛋白不受影 響。然后通過17.5% SDS-PAGE分析這些樣品。如在圖3B中所示，在 有MgCL (泳道3)和CaCh (泳道4)存在下，PrS2-OmpR結(jié)合到粘孢子 上；但在EDTA (泳道2)存在下并非如此。因?yàn)橥ㄟ^加入EDTA可以釋放結(jié)合到粘孢子上的蛋白S，我們還檢 查了 EDTA是否可以釋放結(jié)合到粘孢子上的PrS2-標(biāo)記的蛋白。在4 。C 與粘孢子一起溫育PrS廣OmpR 1小時(shí)后，在室溫在EDTA緩沖液[50mM Tris-HCl (pH 8.0)， 50 mM KC1，和20 mM EDTA]中溫育粘孢子沉淀 15min。在有EDTA存在下，PrS廣OmpR被釋放到上清液中(泳道2，圖 3C)，而在有Ca"存在下，PrS廣OmpR仍然結(jié)合到粘孢子上(泳道4，圖 3C)。這些結(jié)果證實(shí)，PrS廣標(biāo)記的OmpR中的PrS2片段完全保留了以 Ca"依賴性的方式結(jié)合到粘孢子表面的能力。注意到，盡管在有Mg++離 子存在下蛋白S可以結(jié)合到粘孢子，已知它的結(jié)合比在有Ca"存在下 弱(Inouye， M.等人，1979. Proc Natl Acad Sci U S A 76: 209-13)。 因此，對于使用PrS廣標(biāo)記的蛋白的所有實(shí)驗(yàn)，在結(jié)合緩沖液中包含 Ca"離子。我們的下一個(gè)問題是，PrS廣標(biāo)記的蛋白結(jié)合粘孢子有多特異。為了實(shí)現(xiàn)蛋白的一步親和純化，非常重要的是，使污染蛋白與粘孢子的非特異性結(jié)合最小化。在有大腸桿菌BL21(DE3)溶胞產(chǎn)物存在下，測 試了 PrS2-0mpR與粘孢子的結(jié)合(泳道3，圖3D)。在該條件下， PrS2-OmpR特異性地結(jié)合粘孢子，通過考馬斯藍(lán)染色僅觀察到極小量污 染物(泳道5，圖3D)。令人感興趣地，甚至在有高達(dá)4 M的尿素存在 下，PrS廣0mpR與粘孢子的結(jié)合也不受影響(圖5E)。 PST技術(shù)的應(yīng)用親和蛋白純化的優(yōu)點(diǎn)之一是，親和標(biāo)記的蛋白的結(jié)合和洗脫可以 在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，這可以允許研究蛋白-DNA或蛋白-蛋白相互作用。 我們測試了 PST (蛋白S標(biāo)記)技術(shù)是否允許使用PrS廣0mpR來檢測蛋 白-DNA相互作用。PrS2-0mpR/DM復(fù)合物的分離因?yàn)镺mpR可以結(jié)合DM,如圖2D所示，我們測試了 PrS2-0mpR/DM 復(fù)合物是否可以使用粘孢子來分離。為此目的，使用了含有來自ompF 啟動予(omppP)的上游區(qū)域的序列的500-bp DNA片段。首先，混合 ompFP DNA和PrS2-OmpR (3 |a g)，將混合物在室溫溫育！30 min。然后 將粘孢子加入混合物。在4 。C溫育l小時(shí)后，離心收集粘孢子。將最 終的沉淀懸浮于含有尿素的DNA上樣緩沖液[20 mM Tris-HC1 (pH 7.5)， 5 M尿素，40 mM ^-巰基乙醇，0.8% (w/v) SDS， 4%甘油，和 0. 04%(w/v)溴酚藍(lán)]中，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析上清液的DNA 結(jié)合。如圖4A所示，在有PrS廣OmpR存在下將DNA片段與粘孢子混合 的樣品中，檢測到ompFp DNA(泳道4)，而在沒有PrS廣OmpR存在下進(jìn) 行的反應(yīng)中沒有檢測到(泳道3)。接著，通過用BamH I消化pCR-ompFp制備含有ompFP片段的線性 化的質(zhì)粒DNA (pCK-ompFp， 4.5 kbp)[條帶(b)]，還用EcoR I消化 pET-EnvZc，以釋放EnvZc片段(1.5 kbp)[條帶(c)]。注意到，通 過在pETlla載體的EcoR I位點(diǎn)插入EnvZc片段，構(gòu)建pET-EnvZc。 因此，對pET-EnvZc的EcoR I消化會產(chǎn)生2個(gè)條帶(a) ， pETlla載 體，和(c)， EnvZc片段。^f吏用由BamH I消化過的pCR-ompFP和由EcoRI消化過的pET-EnvZc的DM混合物，在有或沒有PrS廣0mpR存在下 進(jìn)行與圖4A所述相同的實(shí)驗(yàn)。如圖4B所示，在有PrS廣0mpR存在下， 從粘孢子沉淀僅檢測到與pCR-ompFP片段相對應(yīng)的1個(gè)條帶(泳道3), 而在沒有PrS2-0mpR存在下，沒有檢測到DM (泳道2)。這些結(jié)果證 實(shí)，粘孢子能夠捕獲PrS廣0mpR/0. 5-kbp ompFp DNA復(fù)合物和 PrS2-OmpR/4. 5-kbp pCR-ompFp DNA片段復(fù)合物。值得注意，這里使用 的方法足夠溫和而可用于分離完整的蛋白-DNA復(fù)合物。 研究i殳計(jì)和方法在上述初步結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們可以進(jìn)行下述的2個(gè)研究。PST技 術(shù)可以使我們分析不能通過常規(guī)的X-射線和NMR技術(shù)來測定的蛋白的結(jié)構(gòu)。研究#1大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞中蛋白S標(biāo)記(PST)表達(dá)系統(tǒng) 的構(gòu)建及粘孢子用于親和純化的應(yīng)用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們可以開發(fā)2種PrS廠OmpR-標(biāo)記的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，(1) 大腸桿菌PST-表達(dá)系統(tǒng)這可以使用在我們實(shí)驗(yàn)室最近開發(fā)的 高表達(dá)冷激栽體pCold來構(gòu)建(Qing， G.等人2004. Nat Biotechnol 22: 877-82)。最終的產(chǎn)物稱作pCold(PST)，其中目標(biāo)蛋白在N-末端融 合至PrS2標(biāo)記，在冷激處理后以非常高的水平誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。(2) 哺乳動物PST-表達(dá)系統(tǒng)這可以使用四環(huán)素誘導(dǎo)型載體來構(gòu)建。 該系統(tǒng)被設(shè)計(jì)用于分離在活細(xì)胞中形成的多蛋白復(fù)合物。使用粘孢子 可以捕獲與PrS廣標(biāo)記的蛋白相關(guān)聯(lián)的復(fù)合物，通過質(zhì)譜法可以鑒別復(fù) 合物中的蛋白。在該目的第三個(gè)方案中，我們可以建立制備高度純化 的不含有蛋白S和蛋白C的粘孢子的方法，所述粘孢子用于PrS廣標(biāo)記的蛋白和蛋白復(fù)合物的親和蛋白純化。 方案#1:大腸桿菌中的PST表達(dá)系統(tǒng)最近在我們實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了冷激栽體(pCold載體)，且已經(jīng)證實(shí)與 pET載體系統(tǒng)互補(bǔ)(Qing， G.等人2004. Nat Biotechnol 22: 877-82)。 在冷激(15 。C)后，目標(biāo)蛋白的表達(dá)以非常高的水平被誘導(dǎo)。在冷激表 達(dá)系統(tǒng)下目標(biāo)蛋白的產(chǎn)生僅伴隨低背景產(chǎn)量的細(xì)胞蛋白。因而，當(dāng)細(xì)胞生長在含有15NH4C1和"C-葡萄糖的培養(yǎng)基中時(shí)，所述蛋白可以幾乎 專一地被"N和13C同位素標(biāo)記，這允許不經(jīng)進(jìn)一步純化而簡單地使用 溶胞產(chǎn)物進(jìn)行對所述蛋白的NMR結(jié)構(gòu)研究(Qing， G.等人2004. Nat Biotechnol 22: 877-82)。我們可以釆用pCold載體系統(tǒng)來構(gòu)建在大腸 桿菌中的PST系統(tǒng)。a. pCold(PST)的構(gòu)建pColdin栽體(Qing， G.等人2004. Nat Biotechnol 22: 877—82); 參見圖1)由cspA啟動子(cspA，大腸桿菌中的主要冷激基因)、cspA 5'-UTR (159個(gè)堿基)、起始密碼子、翻譯增強(qiáng)元件(TEE)和多克隆 位點(diǎn)組成。使用該質(zhì)粒，可以將PrS2 (184個(gè)殘基)的DNA片段插入TEE 和多克隆位點(diǎn)之間。在多克隆位點(diǎn)之后，可以插入His6標(biāo)記，凝血酶 切割位點(diǎn)(Leu-Val-Pro-Arg 4 Gly-Ser)在His6標(biāo)記的N-末端，由此 His6標(biāo)記可以容易地從蛋白去除。該新構(gòu)建的載體稱作pCold(PST) (圖5)。值得注意地，His6標(biāo)記也可以添加在PrS「標(biāo)記的蛋白的C-末端，在該情況下，目標(biāo)蛋白的DNA片段可以與Hise標(biāo)記符合讀框地 插入。DNA片段也可以通過PCR來制備，以具有終止密碼子以在C-末 端消除H"6標(biāo)"^己。關(guān)于實(shí)驗(yàn)#2中所述的蛋白的NMR結(jié)構(gòu)研究，在蛋白S和目標(biāo)蛋白 之間的連接物是使蛋白可自由運(yùn)動所必需的，即使N-末端PrS,標(biāo)記牢 固地固定在粘孢子表面上(參見實(shí)驗(yàn)#2)。盡管蛋白S片段(殘基1_92) 的C-末端具有由6個(gè)氨基酸殘基(-，PVQPR92-)組成的隨機(jī)結(jié)構(gòu)，我 們可以在必要時(shí)優(yōu)化連接物的長度(細(xì)節(jié)參見特定目的#2)。將TEV 切割位點(diǎn)(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln 4 Gly)添加在PrS2的C-末端 之后，使得克隆的基因產(chǎn)物可以通過TEV處理從PrS2脫離。最終的載 體稱作pCold(PST)。b. pCold(PST)應(yīng)用于模型蛋白我們可以使用pCold(PST)來表達(dá)3種模型蛋白CspA， EnvZ結(jié)構(gòu) 域A和EnvZ結(jié)構(gòu)域B。 CspA是一種由70個(gè)殘基組成的小0-桶蛋白， 起RNA陪伴分子的功能(Jiang， W. ， 1997. J Biol Chetn 272:196-202);已經(jīng)通過NMR測定了它的結(jié)構(gòu)(Newkirk. L等人1994. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 5114-8)。通過NMR測定，EnvZ結(jié)構(gòu)域A (67 個(gè)殘基)結(jié)構(gòu)由2個(gè)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的螺旋組成(Tomomori, C.等人 1999. Nat Struct Biol 6:729-34)。該片段是中央二聚化結(jié)構(gòu)域， 其具有His殘基作為EnvZ的自磷酸化位點(diǎn)。EnvZ是參與大腸桿菌中 的ompF和ompC基因的滲透調(diào)節(jié)的組氨酸激酶(綜述參見Egger， L. A. 等人1985. Genes Cells 2:167-84， Forst， S. A.等人1994. Res Microbiol 145:363-373)。 EnvZ結(jié)構(gòu)域B是一種oc / |3蛋白(161個(gè)殘 基)，用作EnvZ的ATP-結(jié)合域。已經(jīng)通過NMR測定了它的三維結(jié)構(gòu) (Tanaka， T.等人1998. Nature 396:88-92)。因?yàn)橐呀?jīng)通過NMR測定了所有這些蛋白結(jié)構(gòu)， oc，和oc / P), 它們是特定目的#2的理想模型蛋白。在使用pCold(PST)表達(dá)這些蛋 白后，可以使用Ni-NTA樹脂來純化它們。與它們的未標(biāo)記的蛋白相對 比，檢查它們各自的生化性質(zhì)，例如對于CspA為RNA結(jié)合，對于EnvZ 結(jié)構(gòu)域A為EnvZ的磷酸化作用，和對于EnvZ結(jié)構(gòu)域B為ATP結(jié)合。 在用PrS2-0mpR得到的結(jié)果(參見初步結(jié)果部分)的基礎(chǔ)上，預(yù)期所有 這些蛋白保留它們的生化性質(zhì)。觀察到的生化性質(zhì)的任何變化，將歸 因于在C-末端的His6標(biāo)記。在該情況下，我們可以用凝血酶去除C-末端His6標(biāo)記，并重新檢查它們的生化性質(zhì)。預(yù)期通過冷激處理[在 15 。C 12小時(shí);(Qing， G.等人2004. Nat Biotechnol 22:877-82)]， 所有這些蛋白會以非常高的水平產(chǎn)生(總細(xì)胞蛋白的30-50%)。對于特 定目的#2，我們可以使用在我們實(shí)驗(yàn)室建立的方法，用"N標(biāo)記這些 蛋白(Qing， G.等人2004. Nat Biotechnol 22:877-82)。C.蛋白表達(dá)和溶解度的增強(qiáng)由于0mpR的表達(dá)和溶解度被它與PrS2標(biāo)記的融合顯著增強(qiáng)，我們 可以使用該P(yáng)rS2標(biāo)記作為通用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。我們可以檢查 pCold (PST)用于表達(dá)用作模型基因的基因集合的有效性。該集合稱作" 核心50"，含有來自擬南芥(J"6油;7^ ^s7/膽)、秀麗隱桿線 蟲(Cae/7or力a6t/27/s e/e^s/2S)、，繁、腹果錄("rosop力27a /zze7a/2c^asfer)和智人(j7o范o M/7/ew)的基因，且已經(jīng)用于測試各種不同的表達(dá)系統(tǒng)， 例 如 pET， pCold 和 小 麥 胚 系 統(tǒng) (http: //www-nmr. cabm. rutgers. edu/bioinformatics/ZebaView/)。 因此，"核心50"的使用對于測試pCold(PST)是理想的。我們可以使用 pCold(PST)來測試基因、尤其是它們的產(chǎn)物差表達(dá)或產(chǎn)生在包涵體中 的那些基因的表達(dá)和溶解度(方法參見Qing， G.等人2004. Nat Biotechnol 22:877-82))。方案#2:哺乳動物細(xì)胞中的PST表達(dá)系統(tǒng)如我們上面已經(jīng)證實(shí)的，使用PrS廣標(biāo)記的OmpR和粘孢子可以分離蛋白-DNA復(fù)合物(圖4)，該方法也可以用于分離其它蛋白復(fù)合物和鑒別蛋白 -蛋白相互作用。PST技術(shù)在哺乳動物系統(tǒng)中具有巨大潛力，尤其用于分離僅在活細(xì)胞中形成的多蛋白復(fù)合物。因此，我們可以構(gòu) 建四環(huán)素誘導(dǎo)型PrS2-融合表達(dá)系統(tǒng)，并用TATA-結(jié)合蛋白(TBP)作為模型系統(tǒng)測試該系統(tǒng)。已知這會形成在真核生物轉(zhuǎn)錄起始中起重要作用的多蛋白復(fù)合物。a.四環(huán)素誘導(dǎo)型PST系統(tǒng)T-REx (PST)的構(gòu)建 為了構(gòu)建四環(huán)素諫導(dǎo)型PST系統(tǒng)，我們可以^使用質(zhì)粒載體 pcDNA4/T0/myc-His (Invitrogen),它是四環(huán)素誘導(dǎo)型載體，且具有 C-末端myc表位和H"6標(biāo)記。使用該載體的多克隆位點(diǎn)中的Hind III 和KpnI位點(diǎn)，可以插入PrS2片段。如圖6所示，使用多克隆位點(diǎn)中 的Kpn I和Xba I位點(diǎn)，也可以插入TEV切割位點(diǎn)和一個(gè)新的多克隆 位點(diǎn)，從而在必要時(shí)可以去除與目標(biāo)蛋白融合的PrS2標(biāo)記。因?yàn)樵?PrS2-標(biāo)記的蛋白在C-末端具有c-myc表位，它可以通過簡單的蛋白印 跡法來檢測。為了建立表達(dá)PrS廣標(biāo)記的蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系，我們可以使用 T-REx 293細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞(InvUrogen)。該T-REx 293是組成 型表達(dá)Tet阻遏蛋白的人胚腎293細(xì)胞系，所述Tet阻遏蛋白可以抑 制PrS廣標(biāo)記的蛋白的轉(zhuǎn)錄，直至加入誘導(dǎo)物四環(huán)素。使用PolyFect 轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)，可以將攜帶PrS2-標(biāo)記的蛋白的T-REx(PST)轉(zhuǎn)染進(jìn)T-REx 293細(xì)胞，在添加了 10%小牛血清和藥物(5 |j g/ml殺稻 痘素和40 Mg/ml Zeocin)的Dulbecco氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM) 上選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體2周。分析抗藥性克隆在用四環(huán)素誘導(dǎo)后PrS2-標(biāo)記的蛋白的表達(dá)，將以最高水平表達(dá)PrS廣標(biāo)記的蛋白的克隆用于該研九<■b. T-REx(PST)系統(tǒng)應(yīng)用于模型蛋白使用人TATA-結(jié)合蛋白(TBP)作為模型蛋白，我們可以在哺乳動物 細(xì)胞中測試PST系統(tǒng)。TBP在轉(zhuǎn)錄起始中的參與被充分表征，它是形 成多蛋白-DNA復(fù)合物的核心蛋白(Hori， R.和M. Carey等人1994. Curr Opin Genet Dev 4: 236-44， Maldonado, E.等人1995. Curr Opin Cell Biol 7:352-61, Roeder， R. G.等人1991. Trends Biochem Sci 16: 402-8)。該多蛋白-DNA復(fù)合物形成通過TBP與TATA元件的結(jié)合和 它與轉(zhuǎn)錄因子IIB (TFIIB)(通用的轉(zhuǎn)錄因子之一)的關(guān)聯(lián)來啟動，最 終裝配含有RM聚合酶II和其它已知的通用轉(zhuǎn)錄因子的前起始復(fù)合 物(PIC) (Zawel， L.等人1993. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 44: 67-108)。首先，我們可以如上所述制備穩(wěn)定細(xì)胞系，可以收獲受誘導(dǎo)的細(xì) 胞，未誘導(dǎo)的細(xì)胞作為對照。我們可以檢查通過與粘孢子混合是否可 以從溶胞產(chǎn)物分離PrS2-TBP。證實(shí)可以通過粘孢子分離PrS廣TBP后， 我們可以對比來自受誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的細(xì)胞的與粘孢子結(jié)合的蛋白。 如果在PrS2-TBP誘導(dǎo)細(xì)胞中檢測到的蛋白條帶不同于在未誘導(dǎo)的細(xì)胞 中檢測到的蛋白條帶，我們可以通過蛋白印跡法或質(zhì)譜指紋法鑒定這 些蛋白，后一種方法可以由為我們實(shí)驗(yàn)室常規(guī)運(yùn)行所述儀器的 Takeshi Yoshida在醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室的MALDI-T0F質(zhì)譜儀上實(shí)現(xiàn)。如果使用PrS廣TBP和粘孢子成功地分離了關(guān)聯(lián)因子，我們可以應(yīng) 用該系統(tǒng)來研究與Su(z)12(zeste-12的抑制劑，其參與組蛋白H3-H1 曱基轉(zhuǎn)移酶活性)相互作用的蛋白(Kuzmichev， A.等人2002. Genes Dev 16: 2893-905)。方案#3:高度純化的耗盡蛋白S的粘孢子的制備對于PrS廣標(biāo)記的蛋白的親和純化和蛋白復(fù)合物的分離，必需得到 高度純化的粘孢子。在該方案中，我們可以建立制備大量純化的粘孢 子的方法，所示粘孢子被耗盡了聚集在表面上的蛋白S和蛋白C。我 們還可以建立滅活粘孢子的方法，使得它們在任意條件下都不會萌發(fā)， 因而可以用作可重復(fù)使用的生物材料。因?yàn)檎虫咦油ㄟ^生物方法制備， 與其它親和樹脂(例如Ni-NTA，鏈霉抗生物素，谷胱甘肽，直鏈淀粉， 和鉤調(diào)蛋白樹脂)相比，制備純化的粘孢子的成本非常經(jīng)濟(jì)。此外，黃 色粘球菌和它的孢子不是致病性的，操作完全安全。
a.粘孢子的制備
黃色粘球菌FB(DZF1)用作粘孢子來源。為了培養(yǎng)細(xì)胞，使用酪胨 -酵母浸出物(CYE)培養(yǎng)基[1%酪胨，0.5%酵母浸出物，10 mM Tris-HC1 (pH 7. 6)，和8 mM MgS0j ，對于子實(shí)體形成，使用克隆生 成(clone fruiting) (CF)瓊脂
平板。在使用前， 在30 。C干燥平板過夜，然后在室溫干燥5天。
使細(xì)胞在3(TC生長至它們達(dá)到指數(shù)期(100 Klett單位)。通過在 室溫以4000 x g離心10 min,收獲細(xì)胞。用等體積的TM緩沖液[10 mM Tris-HCl (pH 7. 6)和8 mM Mg2S04]洗滌細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀重 懸于TM緩沖液，達(dá)到4000 Klett單位/ml的濃度。將該濃縮的細(xì)胞 懸浮液點(diǎn)種在CF瓊脂平板上(每個(gè)點(diǎn)4 ial，每個(gè)平板H4個(gè)點(diǎn))，在 30 。C溫育平板10天。通過輕刮平板的表面，收獲子實(shí)體，并懸浮于 冷TM緩沖液。將細(xì)胞超聲處理3次5 min，以破壞營養(yǎng)細(xì)胞。用TM 緩沖液洗滌粘孢子數(shù)次，最后重懸于10 mM Tris-HCl (p'H 7.6)緩沖 液中。將粘孢子保存在4 'C備用。
在室溫在含有25 mM EDTA的10 mM Tris-HCl (pH 8. O)緩沖液中 溫育純化的粘孢子1小時(shí)，以從它們的表面去除天然蛋白S (Inouye， M.等人，1979. Proc Natl Acad Sci U S A 76: 209—13)和蛋白C (McCleary， W. R.等人1991. J Bacterial 173:2141-5)，洗滌幾次后，再重復(fù)該步驟一次。然后在60 。C加熱該經(jīng)EDTA處理的粘孢子10 min，以滅活任何可能存在的蛋白酶。如圖3A所示，這些處理過的粘 孢子具有均一的球形，并用于我們的研究中。
b. 良好懸浮的粘孢子的維持
純化的粘孢子的大小是均一的(直徑1 Mm;參見圖3A)，比水的 密度略大(因而如果粘孢子懸浮液長時(shí)間放置，它們會在緩沖溶液中 沉積到試管底部)。為了維持粘孢子的良好懸浮狀態(tài)，我們測試了蔗糖 對粘孢子懸浮液的影響。在室溫將粘孢子懸浮于0. 3 ml的0， 5， 10， 15，和20%蔗糖溶液中。在5%蔗糖的最低濃度，它們良好懸浮，沒有 沉積(數(shù)據(jù)未顯示)。我們可以使用該條件進(jìn)行為NMR結(jié)構(gòu)研究設(shè)計(jì)的 實(shí)驗(yàn)。
c. 粘孢子的滅活
在諸如有1 mM 0&++離子和酪胨培養(yǎng)基存在下等特定條件下，粘孢 子會萌發(fā)(0tani， M.等,1995， J Bacterial 177:4261-5)。對于PST 技術(shù)，必須阻止粘孢子萌發(fā)，以便可以重復(fù)使用它們多次。我們可以
測試下述方法，以完全滅活粘孢子的萌發(fā)能力。
NaN3的作用——為了測試NaN3 (1 inM)是否會阻止粘孢子萌發(fā)，我 們可以在有和沒有NaN3存在下，在30 X:在萌發(fā)培養(yǎng)基(含有1 mMCa++ 的0. 2%酪胨)中溫育粘孢子10小時(shí)。通過在相差顯微鏡下監(jiān)測粘孢子 的折射率，可以監(jiān)測對萌發(fā)的抑制。
熱處理的作用——為了測試用高溫處理粘孢子是否會阻止它們的 萌發(fā)，我們可以在70， 80， 90，和100 。C溫育它們30 min。我們可以 確定使粘孢子喪失它們的萌發(fā)能力、但是保留它們的蛋白S結(jié)合性能 的最佳熱處理。
Y-射線輻射的作用一一如果上述2種方法在抑制粘孢子的萌發(fā) 方面是無效的，我們可以使用Y-射線輻射來殺死粘孢子。應(yīng)當(dāng)指出， 粘孢子是耐受UV輻射的。
研究2對捕獲在粘孢子上的蛋白S-標(biāo)記的蛋白的核磁共振(NMR)
結(jié)構(gòu)研究如果蛋白由2個(gè)完全獨(dú)立的通過柔性連接物相連的結(jié)構(gòu)域X和Y 組成，且2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間沒有相互作用，我們假設(shè)通過限制結(jié)構(gòu)域X 的各向同性運(yùn)動，可以消除來自結(jié)構(gòu)域X的NMR信號。這可以通過結(jié) 構(gòu)域X牢固結(jié)合到顆粒表面來實(shí)現(xiàn)，所述顆粒良好地懸浮于溶液中。 在該條件下，結(jié)構(gòu)域Y仍然在溶液中保持它的各向同性運(yùn)動，因?yàn)樗?通過高度柔性的連接物與結(jié)構(gòu)域X相連。因此，結(jié)構(gòu)域X的HSQC譜的 每個(gè)峰可被增寬，同時(shí)結(jié)構(gòu)域Y的HSQC謙的每個(gè)峰保持尖銳，用于結(jié) 構(gòu)分析。如果成功的話，所提出的PST技術(shù)因而將為下述研究打開一 條新穎的令人興奮的途徑
1. 對溶解度差的蛋白的NMR結(jié)構(gòu)研究。
對于NMR結(jié)構(gòu)研究，需要高濃度的目標(biāo)蛋白來達(dá)到高信噪比。絕 對必要的是，蛋白是完全可溶的，沒有任何聚集物或沉淀物。如果目 標(biāo)蛋白在高濃度時(shí)不穩(wěn)定，預(yù)期該問題可通過使用PST技術(shù)來克服。 除了 PrS2-標(biāo)記會增強(qiáng)蛋白溶解度這一事實(shí)以外，PrS2-標(biāo)記的蛋白與 粘孢子的結(jié)合可以避免蛋白的聚集。此外，PrS廣標(biāo)記的蛋白的濃度可 比未標(biāo)記的蛋白更為濃縮得多。
2. 對僅在與PrS2標(biāo)記融合時(shí)才表達(dá)的蛋白的NMR結(jié)構(gòu)研究。
3. 對膜蛋白的結(jié)構(gòu)研究。
膜蛋白通常不以高水平表達(dá)。使用所提出的PST技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn) 對溶于適當(dāng)去污劑中的膜蛋白的一步純化。因而可以以其NMR結(jié)構(gòu)研 究所需的非常高濃度制備粘孢子結(jié)合的膜蛋白。
實(shí)驗(yàn)方案
通過使用粘孢子和"N-標(biāo)記的PrS2-標(biāo)記的蛋白(來自實(shí)施例1)， 我們可以測試上述假設(shè)。在上述假設(shè)中，PrS2標(biāo)記用作結(jié)構(gòu)域X，與 PrS2標(biāo)記融合的蛋白用作結(jié)構(gòu)域Y。為了實(shí)現(xiàn)我們的目的，重要的是， 以實(shí)施例l提出的成本有效的方式，建立制備大量可重復(fù)使用的粘孢 子的方法。
方案#1:粘孢子的結(jié)合對蛋白S的HSQC譜的影響
PrS2片段(184個(gè)殘基)可以用pCold栽體以非常高的水平表達(dá)，因而20 mg純化的"N-標(biāo)記的PrS2片段可以從500ml培養(yǎng)物容易地得 到。使用"N-標(biāo)記的PrS2片段，我們可以對比它在有和沒有粘孢子存 在下的異核單級量子相干(HSQC)語。預(yù)期在有10 mM CaCh存在下加 入粘孢子后，PrS2的HSQC譜的每個(gè)峰將變寬，因?yàn)镻rS2的分子運(yùn)動 將受到與粘孢子結(jié)合的極大限制。我們可以確保，加入粘孢子的該作 用可以通過加入10 mM EDTA來逆轉(zhuǎn)。因?yàn)镋DTA會從粘孢子釋;^結(jié)合 的PrS2， HSQC語的每個(gè)峰應(yīng)再次變尖。
方案#2: PrS廣標(biāo)記的模型蛋白的HSQC譜
在證實(shí)粘孢子會造成PrS2的HSQC譜的峰增寬后，我們?nèi)缓罂梢栽?有和沒有粘孢子存在下，采取來自特定目的#1的"N-標(biāo)記的PrS廣標(biāo) 記的CspA、 EnvZ結(jié)構(gòu)域A和EnvZ結(jié)構(gòu)域B的HSQC鐠。然后可以使 用下述標(biāo)準(zhǔn)，分析這些謙
預(yù)期加入粘孢子引起的在所有3個(gè)語中增寬的那些峰是來自PrS2 標(biāo)記。預(yù)期這些增寬的譜非常類似于在粘孢子存在下PrS,的譜。如果 確實(shí)如此，將證實(shí)我們的假設(shè)是正確的。因此，所有這些峰可以從在 粘孢子存在下得到的HSQC譜中除去。
這樣得到的HSQC譜(去除所有來自PrS2標(biāo)記的峰后)可以與單個(gè) 蛋白的HSQC譜相比較，所有都可以在我們實(shí)驗(yàn)室得到，因?yàn)槲覀円呀?jīng) 與G. Montelione博士 [CspA; (Newkirk， K.等人1994. Proc Natl Acad Sci USA 91: 5114-8)]和Ikura博士 [EnvZ結(jié)構(gòu)域B和A; (Tanaka， T.等人1998. Nature 396:88-92， Tomomori, C，等人1999. Nat Struct Biol 6: 729-34)]協(xié)同測定了這些NMR結(jié)構(gòu)。
目前，不知道粘孢子表面上會觸發(fā)蛋白S的自裝配的組分。有待 檢查PrS廠標(biāo)記的蛋白的表面密度如何影響目標(biāo)蛋白的HSQC譜。如果 PrS2-標(biāo)記的蛋白的表面密度過高，蛋白之間可能存在分子間相互作 用，這會限制蛋白的自由移動，導(dǎo)致峰增寬。這可以通過使用不同量 的粘孢子和相同量的PrS廣標(biāo)記的蛋白進(jìn)行NMR分析來檢查。更多粘 孢子的加入會降低每個(gè)粘孢子結(jié)合的PrS2-標(biāo)記的蛋白的密度，結(jié)果可 以避免增寬效應(yīng)?？赡苡绊慔SQC譜的質(zhì)量的另一個(gè)重要因素是柔性連接物的長度。通過一次一個(gè)添加(GGGGS)n (n = 1， 2， 3 ...)殘基， 我們可以檢查連接物長度的影響。通過這些實(shí)驗(yàn)，可以建立PST技術(shù) 的最佳連接物。
如果這些方案是成功的，我們可以將PST技術(shù)應(yīng)用于在特定目的 #1的方案#1中測試的有些蛋白，以便測試該技術(shù)的普遍適用性。更具 體地，我們可以測試(a)僅在用PrS2標(biāo)記時(shí)才良好表達(dá)的那些蛋白， (b)僅以低水平表達(dá)的那些蛋白。在這些情況下，它們與粘孢子的結(jié)合 可以實(shí)質(zhì)上增加它們的濃度以用于NMR研究，和(c)僅在4M尿素中 可溶的那些蛋白。由于在4M尿素中PrS2完全能結(jié)合粘孢子，在有4M 尿素存在下可以容易地純化PrS2-標(biāo)記的蛋白(參見初步結(jié)果部分)。應(yīng) 當(dāng)指出，由于用于粘孢子懸浮的溶液可以容易地通過簡單離心替換，4 M尿素溶液可以容易地替換為不含尿素的緩沖溶液。如此容易的緩沖 液替換，也可以提供快速篩選用于固R實(shí)驗(yàn)的最佳緩沖條件的方法。
得到最佳結(jié)果
PrS2-標(biāo)記的蛋白的語與未標(biāo)記的蛋白的譜有多相似，是確定所提 出的PST技術(shù)用于蛋白的NMR結(jié)構(gòu)研究的可行性的關(guān)鍵問題。盡管 PrS2-標(biāo)記的蛋白與粘孢子的結(jié)合可能不可預(yù)知地影響PrS2 HSQC譜的 每個(gè)峰的分辨度(增寬效應(yīng))，N-末端0&++結(jié)合域由非常穩(wěn)定的球形結(jié) 構(gòu)組成，該球形結(jié)構(gòu)主要由P-鏈組成(Bagby， S.等人1994， Proc Natl Acad Sci U S A 91:4308-12)，且PrS2的每個(gè)Ca"結(jié)合單位能抗 胰蛋白酶消化(Inouye， S.等人1981. J Bacteriol 148: 678-83)和 熱處理(Bagby， S.等人1998. J Mol Biol 276:669-81)。因此，當(dāng) 92個(gè)殘基的N-末端結(jié)構(gòu)域通過它的0&++結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合粘孢子時(shí)，可能 整個(gè)結(jié)構(gòu)域剛性地固定在粘孢子表面上。這會造成PrS2 HSQC譜的每 個(gè)峰的增寬。但是，如果結(jié)構(gòu)域Y的移動受到PrS2標(biāo)記的限制，也可 能與PrS2融合的結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域Y)的HSQC譜的質(zhì)量可收到影響。
由于該原因，認(rèn)為連接PrS2標(biāo)記和結(jié)構(gòu)域Y的連接物在結(jié)構(gòu)域Y 的自由運(yùn)動中起重要作用。必須確定連接物的長度如何影響結(jié)構(gòu)域Y 的HSQC鐠的質(zhì)量。我們可以使用PrS廣CspA作為;f莫型系統(tǒng)，通過添加(GGGGS)n連接物(n = 1， 2， 3…)，首先測試該問題。預(yù)期一次一個(gè) 添加該4殘基序列，會為結(jié)構(gòu)域Y的運(yùn)動增加更多的自由度，這又將 使CspA HSQC讒的峰變尖銳。通過對比該HSQC譜和純化的CspA的HSQC 譜，我們應(yīng)該能優(yōu)化柔性連接物的長度。在確定最佳連接物長度后， 我們將證實(shí)該最佳長度是否也適用于其它模型系統(tǒng)。
雖然已經(jīng)參照特定的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)明白可以進(jìn)行各種變化以及可以替換等同方案，而不脫離本發(fā)明的 真實(shí)的精神和范圍。另外，可以進(jìn)行多種修飾以便使得特定的情形、 材料、物質(zhì)的組成、方法、方法步驟適應(yīng)于本發(fā)明的目標(biāo)、精神和范 圍。所有這些修飾旨在屬于所附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.含有多克隆位點(diǎn)的載體，所述多克隆位點(diǎn)包含編碼來自黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)的PrS標(biāo)記或PrS2標(biāo)記的核酸序列。
2. 權(quán)利要求l的載體，其中所述多克隆位點(diǎn)包含SEQ ID N0: 1。
3. 權(quán)利要求2的載體，其中所述多克隆位點(diǎn)包含SEQ ID NO: 2 。
4. 權(quán)利要求l的載體，其中所述栽體是高表達(dá)冷激載體。
5. 權(quán)利要求4的載體，其中所述冷激栽體是pColdIII載體。
6. 在大腸桿菌中表達(dá)的權(quán)利要求4的栽體。
7. 權(quán)利要求1的載體，其中所述載體是四環(huán)素誘導(dǎo)型PST表達(dá) 系統(tǒng)。
8. 在哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)的權(quán)利要求7的載體。
9. 權(quán)利要求8的載體，其中所述哺乳動物宿主細(xì)胞來自TREx293 人胚腎細(xì)胞系。
10. 提高靶蛋白的溶解度的方法，其包括a) 使編碼來自黃色粘球菌的蛋白S的至少一個(gè)N-末端結(jié)構(gòu)域 (PrS標(biāo)記)的核酸序列與編碼靶蛋白的核酸序列融合，以建立編碼PrS 標(biāo)記的耙蛋白的核酸序列；b) 將步驟(a)的蛋白S標(biāo)記的靶蛋白置于載體中；c) 用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和d) 在適合基因表達(dá)的條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞， 由此表達(dá)的PrS標(biāo)記的靶蛋白比未標(biāo)記的靶蛋白更易溶。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述核酸序列編碼PrS2標(biāo)記，該 PrS2標(biāo)記具有2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的蛋白S的N-末端結(jié)構(gòu)域。
12. 權(quán)利要求10的方法，其中在執(zhí)行步驟(d)后，任選地使用蛋 白酶從靶蛋白切割掉PrS標(biāo)記。
13. 權(quán)利要求10的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核生物。
14. 權(quán)利要求1的方法，其中所述靶蛋白來自原核生物或真核生
15. 權(quán)利要求1的方法，其中所述載體是含有多克隆位點(diǎn)的大腸 桿菌pCold表達(dá)系統(tǒng)，所述多克隆位點(diǎn)包含編碼PrS標(biāo)記的靶蛋白的核酸。
16. 權(quán)利要求l的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核生物。
17. 權(quán)利要求1的方法，其中所述載體是哺乳動物四環(huán)素誘導(dǎo)型 系統(tǒng)。
18. 權(quán)利要求1的方法，其中所述N-末端結(jié)構(gòu)域核酸序列編碼 85-100個(gè)氨基酸殘基。
19. 權(quán)利要求1的方法，其中所述N-末端結(jié)構(gòu)域核酸序列編碼93 個(gè)氨基酸殘基。
20. 結(jié)合到一個(gè)或多個(gè)黃色粘球菌粘孢子上的PrS-標(biāo)記的蛋白 分子。
21. 純化PrS-標(biāo)記的或PrS廣標(biāo)記的蛋白的方法，其包括使標(biāo) 記的蛋白接觸包含黃色粘球菌粘孢子的親和樹脂，從而將PrS-標(biāo)記的 或PrS廣標(biāo)記的蛋白固定化在所述親和樹脂上。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中在有Ca"或Mg2+存在下，使所述 PrS-標(biāo)記的或PrS「標(biāo)記的蛋白接觸親和樹脂。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中通過添加螯合鈣的試劑，從親和 樹脂釋放所述PrS-標(biāo)記的或PrS廣標(biāo)記的蛋白。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中螯合鈣的試劑是EDTA或EGTA。
25. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法純化的蛋白。
26. 權(quán)利要求25的蛋白，其中所述蛋白是PrS-或PrS廣標(biāo)記的蛋白。
27. 試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求21的親和樹脂和用于純化PrS-或PrS廣標(biāo)記的蛋白的方法中的說明書。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，另外包含用于產(chǎn)生PrS-或PrS廣 標(biāo)記的蛋白的組分。
29. 權(quán)利要求1的方法，其中PrS-或PrS「標(biāo)記的蛋白包含在蛋 白S和乾蛋白之間的連接物。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述連接物是多肽。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述多肽是3-10個(gè)氨基酸殘基。
32. 制備用于分析研究的靶蛋白的方法，其包括制備PrS-或 PrS「標(biāo)記的耙蛋白，和進(jìn)行分析研究。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述分析研究選自核磁共振波謙 分析，藥物篩選測定，結(jié)合測定和X-射線晶體分析或需要可溶性靶蛋 白的任意研究。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所迷PrS-或PrS廠標(biāo)記的靶蛋白包 含在PrS標(biāo)記或PrS2-標(biāo)記和靶蛋白之間的連接物。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述連接物是多肽。
36. 權(quán)利要求33的方法，其中所述分析研究是核磁共振波譜分析。
37. 表征靶蛋白的方法，其包括使至少一個(gè)PrS標(biāo)記或PrS2標(biāo) 記融合到靶蛋白上，進(jìn)行核磁共振波譜分析，和分析來自核磁共振波 譜分析的數(shù)據(jù)，從而表征靶蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有多克隆位點(diǎn)的載體，所述多克隆位點(diǎn)包含來自黃色粘球菌的PrS標(biāo)記或PrS₂標(biāo)記。提供了使用蛋白S標(biāo)記的靶融合蛋白來提高靶蛋白的溶解度的方法。
文檔編號C12P21/04GK101405393SQ200780009852
公開日2009年4月8日 申請日期2007年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月20日
發(fā)明者M·井上, T·吉田 申請人:新澤西內(nèi)科與牙科大學(xué)