專利名稱：：利用2-5A合成酶和RNaseL基因提高水稻品種對水稻條紋葉枯病抗性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了一種利用2-5A合成酶和RNaseL基因轉(zhuǎn)化水稻獲得對水稻條紋葉枯病抗性提高的品種的新方法，屬于農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：水稻條紋病毒(Ricestripetenuivirus，RSV)于1902年首次在曰本分離獲得，現(xiàn)廣泛分布于中國、朝鮮、曰本及前蘇聯(lián)東部各國，在田間引起水稻條紋葉枯病。RSV主要侵染禾本科植物，通過灰飛虱(LaodelphaxstriatellusFallen)以持久性方式傳播，在寄主植物和介體昆蟲中均能復(fù)制，并可由灰飛虱帶毒雌蟲經(jīng)卵以較高比例傳播給后代。近五年來水稻條紋葉枯病在江蘇各水稻產(chǎn)區(qū)爆發(fā)流行，發(fā)病面積均在1000萬畝以上，2004年更是出現(xiàn)了特大爆發(fā)，全省共有42個縣發(fā)生水稻條紋葉枯病，波及面積達(dá)2320萬畝，全省單季水稻損失在5億斤以上，造成了糧食減產(chǎn)、農(nóng)民減收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失，同時也嚴(yán)重挫傷了農(nóng)民的種糧積極性。由于迄今為止幾乎沒有能有效地從感染病毒的植株上除去病毒的化學(xué)藥劑，而治蟲防病的應(yīng)急防治措施也無法作為一項長期的策略加以應(yīng)用，這些原因進(jìn)一步加大了病害的防治難度。國外的防治經(jīng)驗表明，利用品種自身的抗病性是防治病毒病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，可是生產(chǎn)上目前使用的抗病品種抗性基因的來源多為巴基斯坦的水稻品種Modan,而隨著病害的連年趨重發(fā)生，病毒亦存在進(jìn)化變異進(jìn)而克服上述抗病基因的可能性。因此有必要發(fā)掘和創(chuàng)制新的抗性資源，為水稻條紋葉枯病的可持續(xù)綜合防控提供材料上的儲備。植物抗病毒轉(zhuǎn)基因工程策略是通過導(dǎo)入一些植物外源的抗病毒基因來提高品種對病毒的抗性，一般分為以病毒基因組介導(dǎo)的抗性、以動物干3擾素介導(dǎo)的抗性和以毒蛋白介導(dǎo)的抗性等幾種。而其中以動物干擾素介導(dǎo)的抗性由于具有廣譜抗性和環(huán)境友好等特點備受關(guān)注。動物的干擾素(Interferon,INF)是動物細(xì)胞在病毒或其它誘生劑作用下產(chǎn)生的，具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其是目前所知的發(fā)揮作用最快的第一病毒防御體系。目前已見報道的主要為2，-5，寡腺苷酸酶系統(tǒng)(2-5A系統(tǒng))，該系統(tǒng)在病毒dsRNA的作用下激活2-5A合成酶，產(chǎn)生一系列短的2'-5'寡腺苷酸(2-5A),2-5A再激活2-5A依賴性RNaseL,RNaseL進(jìn)一步非特異的降解mRNA,從而對高等脊推動物體內(nèi)被侵染細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯產(chǎn)生抑制，并可引發(fā)細(xì)胞凋亡，以達(dá)到限制病毒增殖的目的。Mitra將人類的2-5A系統(tǒng)的兩個酶以不同啟動子驅(qū)動導(dǎo)入煙草中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株對TMV、AMV和TEV的侵染均表現(xiàn)出了侵染部壞死現(xiàn)象。同時他還發(fā)現(xiàn)壞死現(xiàn)象僅局限于葉片部分，而未延伸至這個植株，另外他還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株上未接種病毒的葉片沒有被侵染，這表明2-5A系統(tǒng)在煙草中表達(dá)可以有效的提高植物對病毒的抗性，并具有廣譜抗性和特異性特點。Tmve則將2-5A系統(tǒng)導(dǎo)入土豆中也獲得了相類似的結(jié)果。由于2-5A系統(tǒng)來源于高等脊推動物，因此其與病毒基因組發(fā)生互作的機(jī)會很小，這從一定程度上規(guī)避了轉(zhuǎn)基因風(fēng)險。但目前為止，以2-5A系統(tǒng)轉(zhuǎn)化水稻獲得抗病毒轉(zhuǎn)基因材料的研究未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用2-5A合成酶和RNaseL基因轉(zhuǎn)化水稻獲得對水稻條紋葉枯病抗性提高的品種的新方法。本發(fā)明所提供的提高水稻品種對水稻條紋葉枯病抗性水平的方法，是根據(jù)人類2，-5'寡腺苷酸酶系統(tǒng)的2-5A合成酶和RNaseL可以響應(yīng)于病毒dsRNA,并通過降解病毒RNA來限制寄主體內(nèi)病毒增殖的原理，將兩基因全長序列導(dǎo)入水稻中使之表達(dá)，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因品種(系)對水稻條紋葉枯病的抗性水平。本發(fā)明所提供的能提高轉(zhuǎn)基因受體品種(系)對水稻條紋葉枯病抗性水平的方法，是通過以下方法驗證的1)從公共數(shù)據(jù)庫獲得2-5A合成酶和RNaseL兩基因全序列，將其分別構(gòu)建植物表達(dá)載體'2)轉(zhuǎn)化水稻品種獲得轉(zhuǎn)基因再生植株；3)通過PCR或Southernblot方法多代篩選獲得的轉(zhuǎn)基因雙陽性水稻品種(系)；4)通過RT-PCR或Northernblot方法確定轉(zhuǎn)基因雙陽性水稻品種(系)中兩基因是否正常轉(zhuǎn)錄；5)通過接種鑒定方法表明轉(zhuǎn)基因雙陽性水稻品種(系)對水稻條紋葉枯病的抗性水平較轉(zhuǎn)基因受體品種(系)有顯著提高。本發(fā)明提供了一種為水稻抗條紋葉枯病材料的創(chuàng)制提供新方法，其具有以下優(yōu)點①鑒于生產(chǎn)上目前使用的抗病品種抗性來源多為巴基斯坦的水稻品種Modan中的單一主效基因，而隨著病害的連年趨重發(fā)生，病毒亦存在進(jìn)化變異進(jìn)而克服上述抗病基因的可能性，本方法可以為水稻條紋葉枯病的可持續(xù)綜合防控提供材料上的儲備；②由于2-5A系統(tǒng)來源于高等脊推動物，因此其與病毒基因組發(fā)生互作的機(jī)會很小，不易出現(xiàn)病毒異源包被和重組的情況，較之病毒來源轉(zhuǎn)基因策略本方法從一定程度上規(guī)避了轉(zhuǎn)基因風(fēng)險。圖1為2-5A合成酶基因全序列獲得方法示意圖圖2為RNAseL基因全序列獲得方法示意圖圖3為2-5A合成酶基因植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖圖4為RNAseL基因植物表達(dá)載體構(gòu)建示意5為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻圖(a為轉(zhuǎn)化后愈傷組織開始分化；b為篩選出新的小苗)圖6為L代轉(zhuǎn)2-5A系統(tǒng)基因水稻的PCR檢測結(jié)果示意圖(A為2-5A基因檢測結(jié)果；B為RNaseL基因檢測結(jié)果；M為天為時代MarkerIII;1為植物轉(zhuǎn)化載體擴(kuò)增結(jié)果；2為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諗U(kuò)增結(jié)果；3-10為L代轉(zhuǎn)2-5A基因水稻植株擴(kuò)增結(jié)果)圖7為L代轉(zhuǎn)2-5A系統(tǒng)基因水稻的RT-PCR檢測結(jié)果示意圖(A為2-5A基因檢測結(jié)果；B為RNaseL基因檢測結(jié)果；M為天為時代MarkerIII;l-4為T4代轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增結(jié)果；CK為未轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增結(jié)果)具體實施例方式下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、2-5A合成酶和RNaseL基因植物表達(dá)載體的獲得目的基因是來自于人類的2-5A系統(tǒng)的2-5A合成酶基因和RNAseL基因，具體獲得方式為在因特網(wǎng)上輸入網(wǎng)址http:〃匿ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/2379,進(jìn)入圖1頁面，獲得人類2-5A合成酶基因全序列；在因特網(wǎng)上輸入http://www,ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/485407report-genbank網(wǎng)址，進(jìn)入圖2頁面，獲得人類RNaseL基因(2-5A依賴性RNase基因)全序列。獲得的兩基因長度分別為1.3kb和2.8kb,分別編碼364個和741個氨基酸。按照圖3、4構(gòu)建植物載體pA匿21(^和pA畫2106,包括目的基因和選擇標(biāo)記兩個表達(dá)單元。啟動子大小為800bp，來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子，啟動目的基因組成性表達(dá)。終止子大小為253bp的Nos3，序列，來自于Ti質(zhì)粒中胭脂堿合成酶基因的終止序列，起終止表達(dá)的作用。標(biāo)記基因用叩tll基因，大小為795bp來自于Kanr細(xì)菌，編碼產(chǎn)物APH(3，)-II氨基糖苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶II，亦稱新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II,已證明無安全問題，是第一個安全使用的標(biāo)記基因。載體中沒有使用報告基因。實施例2、利用2-5A合成酶和RNaseL基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻將兩個植物轉(zhuǎn)化載體pA固2109和pA薩2106以凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，以粳稻品種鹽粳21的幼胚愈傷組織作為轉(zhuǎn)基因的受體材料進(jìn)行同時轉(zhuǎn)化(圖5),水稻轉(zhuǎn)化方法按Hiei等人的方法稍做改進(jìn)。經(jīng)抗生素篩選獲得8個T。代再生植株，移栽到坡璃溫室均能正常生長、開花和結(jié)實，故獲得8個家系的l代種子。實施例3、轉(zhuǎn)基因后代的PCR篩選根據(jù)2-5A和RNaseL的序列設(shè)計特異性引物，其中2-5A為5-TTCCTCAgTCCTCTCACCAC-3和5-gAgCTgCCTTCTCAggTACT-3，擴(kuò)增片斷大小為630bp;RNaseL為5—CCTCTGCATAACGCAGTA-3和5—GCTCCAGAAGCCTCTGCAC-3,,擴(kuò)增片斷大小為590bp。釆用CTAB大量DNA提取方法提取水稻DNA(方法參照分子克隆實驗指南，略)。PCR反應(yīng)體系為lOngDNA模板，0.7ulPrimer(4pmol/ul)，lul10xBuffer(freeMgCh)，0.2uldNTP(2.5mM),0.6ulMgCl2(25mM)，0.lulTa"5u/ul)，6.4ulddH20。PCR反應(yīng)程序為95。C變性5min;95。C變性30s、55-62。C退火30s、72。C延伸lmin，共進(jìn)行35次循環(huán)72'C延伸7min。用0.8%的瓊脂糖檢測其擴(kuò)增產(chǎn)物，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄試驗結(jié)果。采用PCR方法對T「L代連續(xù)進(jìn)行選擇，對以鹽粳21為受體的1個L代轉(zhuǎn)基因雙陽性株的200個后代進(jìn)行選擇，獲得17個雙陽性L代株，2-5A和RNaseL兩對引物從轉(zhuǎn)基因陽性株中分別擴(kuò)增出630bp和590bp的帶；選擇10個T2代播種8株進(jìn)行鑒定，PCR鑒定篩選獲得27個雙陽性T3代株，但來源于同一T2代的T3代株系沒有全表現(xiàn)為雙陽性的株系；對其中的編號為4的T3代轉(zhuǎn)基因株的8個后代進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)8株均表現(xiàn)為雙陽性(圖6)。從8株中選擇4株4-2、4-4、4-5和4-6的后代各20個株系進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)，其后代亦均表現(xiàn)為雙陽性。實施例4、2-5A系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因水稻植株的轉(zhuǎn)錄檢測釆用TRIzol法提取水稻總RNA對4-5等4個1"3代轉(zhuǎn)基因雙陽性株進(jìn)行RT-PCR,取水稻葉片組織O.lg，加入lmLTRIzolreagent充分研磨，室溫放置5min;加入氯仿200ML,充分震蕩15sec,室溫放置3min;12，000g,4匸離心15min;取上層水相加入另一離心管中，加入0.5mL異丙醇；12，000g，4°C，離心10min(可見RNA沉淀)，棄去上清；加入lmL70%乙醇(渦漩，7，000g離心5min);干燥RNA沉淀，加ddH2040jaL溶解即可。取一Eppendorf管，加入各樣品RNA3|aL,3、-端引物1juL，D.D.W6iaL,置于70°C下變性5min，立即取出置于冰上放置5min。再依次加入下列試劑2jliL5xM-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、0.5juL40mmol/LdNTPs(每種10mmol/L)、0.5|aLRNasin(40U/|aL)、0.5jaLM—MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(20U/jaL)和1.5jaL加入DEPC處理過的D.D.W。42。C水浴1h，7(TC滅活10min,-2(TC保存?zhèn)溆?。再按上一步程序進(jìn)行PCR,結(jié)果顯示2-5A和RNaseL兩對引物從4個轉(zhuǎn)基因雙陽性株中分別擴(kuò)增出630bp和590bp的帶，表明在4個轉(zhuǎn)基因雙陽性株中2-5A和RNaseL兩基因均能正常轉(zhuǎn)錄(圖7)。實施例5、2-5A系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因水稻株系對水稻條紋葉枯病的抗性表現(xiàn)利用上述研究確定的方法鑒定4個以鹽粳21為受體的轉(zhuǎn)基因株系的抗性表現(xiàn)，試驗預(yù)設(shè)水稻條紋葉枯病抗病對照鎮(zhèn)稻88、感病對照武育粳3號及受體對照鹽粳21。鑒定方法具體如下(l)浸種，催芽，至0.5葉時播于燒杯中，每個材料鑒定35株左右，3次重復(fù)；(2)到1.5葉齡時，接種帶毒灰飛虱2-5齡若蟲，有效接種蟲量為4蟲/苗，接種前要齊苗；(3)燒杯用紗布封口，48小時后，將灰飛虱移走。移栽接種苗至秧盤，置于玻璃房中，注意水、溫管理；(4)接種后7天開始調(diào)查病害發(fā)生情況，其后每隔三天調(diào)查一次，連續(xù)調(diào)查5次。病害調(diào)查參照周彤等制訂的標(biāo)準(zhǔn)0級，無癥狀；1級，有輕微黃綠色斑駁癥狀，病葉不卷曲，植株生長正常；2級，病葉上褪綠擴(kuò)展相連成不規(guī)則黃白色或黃綠色條斑，病葉不卷曲或略有卷曲，生長基本正常；3級，病葉嚴(yán)重褪綠，病葉卷曲呈捻轉(zhuǎn)狀，少數(shù)病葉出現(xiàn)黃化枯萎癥狀；4級，大部分病葉卷曲呈捻轉(zhuǎn)狀，葉片黃化枯死，植株呈假枯心狀或整株枯死。其中2-4級直接記為發(fā)病，l級在2天后再次調(diào)查確認(rèn)，0級記為不發(fā)病，計算發(fā)病率。結(jié)果顯示4個轉(zhuǎn)基因株系對水稻條紋葉枯病的抗性水平較受體鹽粳21和感病對照武育粳3號有顯著性提高(表l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>鑒于生產(chǎn)上目前使用的抗病品種抗性來源多為巴基斯坦的水稻品種Modan中的單一主效基因，而隨著病害的連年趨重發(fā)生，病毒亦存在進(jìn)化變異進(jìn)而克服上述抗病基因的可能性，本方法可以為水稻條紋葉枯病的可持續(xù)綜合防控提供材料上的儲備。同時由于2-5A系統(tǒng)來源于高等脊椎動物，因此其與病毒基因組發(fā)生互作的機(jī)會很小，不易出現(xiàn)病毒異源包被和重組的情況，較之病毒來源轉(zhuǎn)基因策略本方法從一定程度上規(guī)避了轉(zhuǎn)基因風(fēng)險。上述實施不以任何形式限定本發(fā)明。權(quán)利要求1、2-5A合成酶和RNaseL基因在提高水稻品種(系)對水稻條紋葉枯病抗性上的應(yīng)用，其特征在于將2-5A合成酶和RNaseL兩基因全序列分別構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻品種獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，通過PCR多代篩選獲得的轉(zhuǎn)基因雙陽性水稻品種(系)對水稻條紋葉枯病的抗性水平較轉(zhuǎn)基因受體品種(系)有顯著提高。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用2-5A合成酶和RNaseL基因轉(zhuǎn)化水稻獲得對水稻條紋葉枯病抗性提高的品種的新方法。本發(fā)明的實質(zhì)是根據(jù)2-5A合成酶和RNaseL向應(yīng)于病毒dsRNA，進(jìn)而降解病毒RNA以限制寄主體內(nèi)病毒增殖的原理，將兩基因全長序列導(dǎo)入水稻中表達(dá)來提高轉(zhuǎn)基因品種(系)對水稻條紋葉枯病的抗性水平。鑒于現(xiàn)有抗病品種存在抗性喪失的風(fēng)險，本方法可以為水稻條紋葉枯病的可持續(xù)綜合防控提供材料上的儲備。文檔編號C12N15/82GK101580847SQ200910032718公開日2009年11月18日申請日期2009年6月26日優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日發(fā)明者于嘉林,任春梅,劉偉華,彤周,周益軍,季英華,熊如意,程兆榜,潔陳申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院