專利名稱：一種腈水合酶基因工程菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種利用諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒構(gòu)建高效表達(dá)腈水合酶基因工程菌的方法以及所得到的基因工程菌株和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
利用丙烯酰胺(Acrylamide，分子式為C3H5N0，結(jié)構(gòu)式為H2C = CHC0NH2)合成的各種類型的聚丙烯酰胺(PAM)在三次采油、水處理、造紙、采礦、冶金、洗煤和制造高吸水性樹(shù)脂等工業(yè)生產(chǎn)中具有非常廣泛的應(yīng)用。 丙烯酰胺的生產(chǎn)一般是以丙烯腈為原料，進(jìn)行催化水合而成。丙烯酰胺的生產(chǎn)經(jīng)歷了硫酸水合法、銅催化法、微生物法三個(gè)發(fā)展階段。由于微生物法具有反應(yīng)在常溫常壓下進(jìn)行、能耗低、操作簡(jiǎn)單、安全、丙烯腈轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)物濃度和純度高等優(yōu)點(diǎn)，與其他方法相比，微生物法具有明顯的優(yōu)勢(shì)。 在利用微生物法的最初階段，主要是篩選和馴化具有腈水合酶活性的菌株。在微生物方面的主要進(jìn)展有日本，山田秀明研究組在專利《生物學(xué)生產(chǎn)酰胺的方法》(專利號(hào)ZL88106735))公開(kāi)了一種野生玫瑰色紅球菌J-l，日本化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社在專利《利用微生物制備酰胺的方法》(專利號(hào)ZL86100062)公開(kāi)了一種紅球菌S-6、氧化節(jié)桿菌和黃色微桿菌，英國(guó)西巴特殊化學(xué)水處理有限公司在專利《紫紅紅球菌菌株NCMB 41164及其生產(chǎn)腈水合酶的用途》(申請(qǐng)?zhí)?00480035487. 1)中公開(kāi)了 一種了紫紅紅球菌NCMB41164菌株或其突變體，美國(guó)亞什蘭許可和知識(shí)產(chǎn)權(quán)有限公司在專利《腈水合酶生產(chǎn)菌株紫紅紅球菌M33的培養(yǎng)方法》(申請(qǐng)?zhí)?00480043243. 8)"中公開(kāi)了一種紫紅紅球菌M33，上海市農(nóng)藥所在專利《微生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺》(申請(qǐng)?zhí)?3115536. 7)中公開(kāi)了野生丙酸棒桿菌及其馴化菌株等不同的微生物進(jìn)行丙烯酰胺的微生物法生產(chǎn)。在生產(chǎn)方法方面，清華大學(xué)化工系公開(kāi)了《一種應(yīng)用膜技術(shù)的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)丙烯酰胺的方法》(專利號(hào)ZL 03109806. 1)，《提高腈水合酶產(chǎn)物耐受性的定向培育法》(專利號(hào)ZL 03130658. 6)和《葡萄糖-Co2+耦合補(bǔ)加發(fā)酵制備腈水合酶的工藝方法》(專利號(hào)ZL 03121944.6);河南焦作多生多化工股份有限公司公開(kāi)了《微生物凝聚法生產(chǎn)丙烯酰胺的方法》(申請(qǐng)?zhí)?00410010364. 4);德國(guó)施托克豪森公司公開(kāi)了《用一種生物催化劑制備一種丙烯酰胺水溶液的方法》(申請(qǐng)?zhí)?2808905. 7);《傅里葉變換紅外在線測(cè)量丙烯腈和丙烯酰胺》等等。在轉(zhuǎn)化丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺的基因研究方面，日本三菱化成株式會(huì)社對(duì)來(lái)自根瘤菌屬的腈水合酶基因和蛋白申請(qǐng)了專利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和編碼該蛋白的基因》(申請(qǐng)?zhí)?3106122.9);三井化學(xué)株式會(huì)社對(duì)來(lái)自嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及編碼它的基因申請(qǐng)了專利《參與活化腈水合酶的蛋白以及編碼它的基因》(專利號(hào)ZL99106291.4);《新型腈水合酶》(專利號(hào)02156180. X)，并研究了該基因在重組大腸桿菌中的表達(dá)；德國(guó)底古薩股份公司申請(qǐng)了《紅球菌屬的腈水合酶》(申請(qǐng)?zhí)?00580008206. 8);日本三菱麗陽(yáng)株式會(huì)社公開(kāi)了《改良型腈水合酶》(申請(qǐng)?zhí)?00580016665. 0)，提供了對(duì)腈水合酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變來(lái)提高耐熱性的方法；清華大學(xué)從諾卡氏菌中克隆獲得了腈水合酶基因并申請(qǐng)了專利《一種腈水合酶及其編碼基因與應(yīng)用》(專利號(hào)ZL 200410042576. O)，進(jìn)一步對(duì)該基因在重組大腸桿菌中的突變和高表達(dá)進(jìn)行了研究。 諾卡氏菌和紅球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌株，具有比較厚的細(xì)胞壁。同時(shí)，作為腈代謝酶系的天然表達(dá)菌株，諾卡氏菌和紅球菌中還可能存在某些分子伴侶，或良好的氧化還原環(huán)境，使得胞內(nèi)表達(dá)的腈水合酶與重組大腸桿菌相比，具有更高的熱穩(wěn)定性和底物、產(chǎn)物耐受性。為此，采用諾卡氏菌和紅球菌宿主進(jìn)行腈水合酶基因的過(guò)表達(dá)在工業(yè)生產(chǎn)中具有更廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種高效表達(dá)腈水合酶的基因工程菌的構(gòu)建方法。 本發(fā)明目的之二是提供高效表達(dá)腈水合酶的基因工程菌株。 本發(fā)明目的之三是提供利用腈水合酶基因工程菌株生產(chǎn)丙烯酰胺的方法。 本發(fā)明一種高效表達(dá)腈水合酶基因工程菌的構(gòu)建方法，主要是利用諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒PNV18和pNV19，既含有諾卡氏菌/紅球菌的復(fù)制起點(diǎn)pAL5000，又含有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)，因此既可以在諾卡氏菌/紅球菌中表達(dá)，又可以在大腸桿菌中表達(dá)的特點(diǎn)；可以方便地在重組大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因的重組改造，然后轉(zhuǎn)移至重組諾卡氏菌/紅球菌中進(jìn)行目標(biāo)基因的表達(dá)。 本發(fā)明一種高效表達(dá)腈水合酶基因工程菌的構(gòu)建方法，按照如下步驟進(jìn)行
(l)根據(jù)目的啟動(dòng)子基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物，以含有目的啟動(dòng)子基因的DNA為模板進(jìn)行PCR方法擴(kuò)增，得到啟動(dòng)子基因； (2)將啟動(dòng)子基因與諾卡氏菌_大腸桿菌穿梭質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，36 38t:反應(yīng)過(guò)夜；然后將酶切產(chǎn)物純化，再用T4DNA連接酶在3 5。C進(jìn)行連接反應(yīng)14 16h，得連接反應(yīng)物； (3)將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化宿主菌e. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板(卡那霉素抗性基因kan+)，挑選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取小量質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，可得帶有目的啟動(dòng)子基因的諾卡氏菌_大腸桿菌穿梭質(zhì)粒； (4)根據(jù)腈水合酶基因序列設(shè)計(jì)上、下游引物，并以具有原始腈水合酶基因的諾卡氏菌Nocardia YS-2002的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得腈水合酶的DNA序列；然后用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切，再用T4連接酶將腈水合酶DNA序列插入大腸桿菌質(zhì)粒pET28，獲得重組質(zhì)粒pET28-NHase;再用試劑盒定點(diǎn)突變方法將腈水合酶基因的a亞基起始密碼子gtg突變?yōu)閍tg，獲得突變腈水合酶基因NHaSeM ; (5)以步驟(4)獲得的突變腈水合酶基因NHaseM的DNA序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得突變腈水合酶基因NHaSeM的DNA序列，然后用BamHI和HindIII對(duì)突變腈水合酶基因NHaSeM與諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，36 38t:反應(yīng)過(guò)夜；然后將酶切產(chǎn)物純化，再用T4DNA連接酶在3 5t:進(jìn)行連接反應(yīng)14_16h，得連接反應(yīng)物；
(6)將步驟(5)連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布在LB平板(Kan+)培養(yǎng)基上，挑選陽(yáng)性克隆，并在LB培養(yǎng)基中37t:過(guò)夜培養(yǎng)，然后提取小量質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，可得帶有目的啟動(dòng)子基因及突變腈水合酶基因NHaSeM的穿梭質(zhì)粒；
(7)將步驟(6)所得穿梭質(zhì)粒以電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，即獲得具有目的啟動(dòng)子基因和突變腈水合酶基因NHaSeM的基因工程菌。 上述構(gòu)建方法步驟(1)中所述的目的啟動(dòng)子基因?yàn)轷０访竼?dòng)子基因或大腸桿菌tac啟動(dòng)子基因。 上述構(gòu)建方法中所述的酰胺酶啟動(dòng)子基因，其-35區(qū)和-10區(qū)序列分別為TTGTGG和TAACGT ;它來(lái)自諾卡氏菌Nocardia YS-2002,用上游引物CGGAATTCTGCGGACGGCGGATACGT和下游引物CGGGATCCCTAGGACTCCTTAGTGACT,以諾卡氏菌Nocardia YS-2002的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增可得酰胺酶啟動(dòng)子基因。 上述構(gòu)建方法中所述的大腸桿菌tac啟動(dòng)子基因，其-35區(qū)和-10區(qū)序列分別為
TTGACA和TATAAT。大腸桿菌tac啟動(dòng)子基因來(lái)自質(zhì)粒pMAL-p2x (美國(guó)NEB公司)，以上游
引物CGGAATTCATTCTCATGTTTGACAGCT和下游引物CGGGATCCGGTCCTTG TTGGTGAAGT為擴(kuò)增引
物，以質(zhì)粒pMAL-p2x的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增可得大腸桿菌tac啟動(dòng)子基因。 上述構(gòu)建方法步驟(2)中所述的諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒為諾卡氏菌-紅球
菌穿梭質(zhì)粒pNV18或pNV19(pNV18 :DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)，AB267085 ;pNV19 :DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)，AB267086)
及其衍生質(zhì)粒。 所述的衍生質(zhì)粒可以是pNV18. 1等。 上述構(gòu)建方法步驟(2)中酶切產(chǎn)物的純化可以采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒或其它分子克隆中常用的純化方法。 上述構(gòu)建方法步驟(4)中所述的腈水合酶基因是指來(lái)自于諾卡氏菌的原始腈水合酶基因(Genbank :AY168347)或經(jīng)過(guò)突變、重排、缺失等方法獲得的與來(lái)自諾卡氏菌的腈水合酶基因的DNA序列一致性大于等于70%、蛋白質(zhì)序列一致性大于等于70%的同源基因。 上述構(gòu)建方法步驟(4)中所述的試劑盒定點(diǎn)突變方法(ExSite PCR-basedsite-directed mutagenesis kit， Stratagene， USA) 見(jiàn)Yue SHI等 (EnzymeandMicrobial Technology, 2004， 35 (6-7) ， 557-562);可將腈水合酶基因的a亞基起始密碼子gtg突變?yōu)閍tg，從而獲得突變腈水合酶基因NHaSeM。 上述構(gòu)建方法步驟(4)中所述的突變腈水合酶基是指a亞基起始密碼子gtg突變?yōu)閍tg的腈水合酶基因。 上述構(gòu)建方法步驟(3)中所述的目的啟動(dòng)子基因的諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒
為帶有酰胺酶啟動(dòng)子基因或tac啟動(dòng)子基因的pNV18質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒。 上述構(gòu)建方法步驟(6)中所述的穿梭質(zhì)粒為帶有酰胺酶啟動(dòng)子基因或tac啟動(dòng)子
基因及突變腈水合酶基因NHaSeM的pNV18質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒。 上述構(gòu)建方法步驟(7)中所述的宿主為諾卡氏菌或紫紅紅球菌。 上述宿主所述的諾卡氏菌是諾卡氏菌Nocardia YS-2002或其誘變株；其中諾卡
氏菌Nocardia YS-2002是發(fā)明人從來(lái)自勝利油田采集的菌株通過(guò)篩選得到；Nocardia
YS-2002的誘變株可采用Nocardia YS-2002在紫外燈下加入LiCl2方法進(jìn)行誘變獲得。
上述宿主所述的紫紅紅球菌是紫紅紅球菌Rhodococcus rhodochrousATCC33278 (在美國(guó)菌種保藏中心保藏)或其馴化株或誘變株。 上述構(gòu)建方法步驟(7)中所述的獲得具有目的啟動(dòng)子和突變腈水合酶基因的基因工程菌可以是諾卡氏基因工程菌或紫紅紅球菌基因工程菌。 利用上述構(gòu)建方法所得的腈水合酶基因工程菌株，攜帶tac啟動(dòng)子基因或酰胺酶啟動(dòng)子基因和突變腈水合酶基因NHaSeM。 上述腈水合酶基因工程菌株中所述的突變腈水合酶基因是指a亞基起始密碼子gtg突變?yōu)閍tg的腈水合酶基因。 上述腈水合酶基因工程菌株，攜帶tac啟動(dòng)子基因和突變腈水合酶基因NHaSeM。
上述腈水合酶基因工程菌株是諾卡氏菌TH-1， Nocardia，于2007年7月12日保藏在中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物保藏中心，菌種保藏登記號(hào)為CGMCC No. 2104，它帶有tac啟動(dòng)子和突變腈水合酶基因NHaSeM。 上述腈水合酶基因工程菌株是紫紅紅球菌TH-2 ， R. rhodochrous ，于2007年7月12日保藏在中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物保藏中心，菌種保藏登記號(hào)為CGMCCNo. 2105，它帶有tac啟動(dòng)子和突變腈水合酶基因NHaSeM。 上述腈水合酶基因工程菌株，攜帶酰胺酶啟動(dòng)子基因和突變腈水合酶基因NHaseM。 上述腈水合酶基因工程菌株是諾卡氏菌N0Cardia/pNV-Pa-NHM，它帶有酰胺酶啟動(dòng)子和突變腈水合酶基因NHaSeM。 上述腈水合酶基因工程菌株是紫紅紅球菌rh0d0Chr0uS/pNV-Pa-NHM，它帶有酰胺酶啟動(dòng)子和突變腈水合酶基因NHaSeM。 利用上述腈水合酶基因工程菌生產(chǎn)丙烯酰胺的方法，按照如下步驟進(jìn)行
(1)將在4t:保藏的腈水合酶基因工程菌接入活化培養(yǎng)基中，在28 30°C 、搖床轉(zhuǎn)速為150 250轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)32 56小時(shí)，得到活化的腈水合酶基因工程菌的菌液；其中所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏1 5g/L，蛋白胨7 10g/L， KH2P04 0. 5 0. 75g/L， K2HP04 0. 5 0. 75g/L， MgS04 7H20 0. 5 1. 0g/L， pH7. 5，其余為水； (2)按照0. 5 1. 0%的體積百分比將步驟(1)的腈水合酶基因工程菌液接種到裝有培養(yǎng)基的種子罐中，在28 3(TC、搖床轉(zhuǎn)速為200 300轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)32 48小時(shí)，得腈水合酶基因工程菌的種子液；所述的培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏1 5g/L，蛋白胨7 10g/L， KH2P04 0. 5 0. 75g/L， K2HP04 0. 5 0. 75g/L，MgS04 7H20 0. 5 1. 0g/L，泡敵0. 2 0. 3g/L， pH7. 5，其余為水; (3)按照5. 0 10. 0%的體積百分比將步驟(2)所得種子液轉(zhuǎn)接種到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在28 3(TC、pH7. 5 8. 5條件下培養(yǎng)36 48小時(shí)，得發(fā)酵液；所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20 40g/L，酵母膏5. 0 10. 0g/L，尿素7. 5 10. 0g/L， KH2P040. 5 1. 0g/L，K2HP04 0. 5 1. 0g/L，MgS04 *7H20 0. 5 1. 5g/L，味精0. 5 1. 5g/L，CoCl20. 04 0. 12mM，丙烯酰胺2 6mM，泡敵0. 2 0. 3g/L， pH 7. 5 8. 5，其余為水；
(4)將發(fā)酵液稀釋為5 8g/L(干重)的菌液，然后用中空纖維微濾膜對(duì)收獲的菌體進(jìn)行微濾洗滌，清洗時(shí)采用正洗和反洗雙向反復(fù)操作直至洗滌液的色度為5 20，蛋白質(zhì)濃度為3 10卯m ;正洗壓力控制為0. 06 0. lMPa，反洗壓力控制為0. 01 0. lMPa ;再將菌液配成10 20g/L(干重)，體積分?jǐn)?shù)5 8%，打入水合反應(yīng)釜，調(diào)節(jié)丙烯腈流量至0. 5 1. OmVh，然后向水合釜內(nèi)流加丙烯腈，流加速度從高向低逐步調(diào)?。环磻?yīng)釜夾套通-5 -9。C冷凍鹽水或液氨，在16 26°C， p朋.7 7. 5條件下進(jìn)行水合反應(yīng)1 3小時(shí)；接著用循環(huán)泵將水合液打入中空纖維超濾膜分離系統(tǒng)，用正洗和反洗方法反復(fù)操作濾去水合液中的細(xì)胞雜質(zhì)和雜蛋白，直至水合液的色度為5 15，蛋白質(zhì)濃度為5 15ppm，得到丙烯酰胺水合液。 上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法步驟(1)中所述的腈水合酶基因工程菌是指諾卡氏菌Nocardia/pNV-Pa-NHM、諾卡氏菌TH-1、紫紅紅球菌R. rhodochrous/pNV-Pa-NHM或紫紅紅球菌TH-2。 上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法中所述的泡敵是聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚，可從市場(chǎng)上購(gòu)買。 上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法中步驟(2)中當(dāng)大量種子細(xì)胞形態(tài)為鏈球狀時(shí)，結(jié)束種子培養(yǎng)，生物量約為3 6g/L。 上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法中步驟(3)中至菌體形態(tài)為單個(gè)小球狀，生物量^ 8g/L，腈水合酶酶活^ 1850U/ml。 上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法步驟(4)中所述的腈水合酶基因工程菌細(xì)胞可以重復(fù)使用3 8次。 上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法中清洗時(shí)采用正洗和反洗雙向反復(fù)操作，是為了防止堵塞。 上述生產(chǎn)丙烯酰胺的方法步驟(4)中當(dāng)丙烯酰胺濃度達(dá)到25% 40% (W% V)，丙烯腈濃度小于0. 1% (W% V)，丙烯酸副產(chǎn)物《0. 5% (W% V)時(shí)，可停止水合反應(yīng)。
本發(fā)明采用諾卡氏菌或紅球菌為宿主菌株，采用諾卡氏菌/紅球菌_大腸桿菌穿梭質(zhì)粒高表達(dá)腈水合酶基因，通過(guò)穿梭質(zhì)粒上啟動(dòng)子基因的篩選優(yōu)化及腈水合酶基因的突變改造，提高重組菌株腈水合酶的活性、熱穩(wěn)定性和產(chǎn)物、底物耐受性；采用基因重組諾卡氏菌或基因重組紅球菌游離細(xì)胞為催化劑，可實(shí)現(xiàn)大宗化學(xué)品丙烯酰胺的微生物法生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明所得腈水合酶基因工程菌株腈水合酶表達(dá)水平高；(2)本發(fā)明腈水合酶酶活水平高，熱穩(wěn)定性好，對(duì)丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；(3)本發(fā)明方法生產(chǎn)的丙烯酰胺質(zhì)量高，適于工業(yè)化的生產(chǎn)。


圖1攜帶tac啟動(dòng)子(Ptac)的腈水合酶表達(dá)穿梭質(zhì)粒pNV_PtaC-NHM的示意圖。
圖2攜帶酰胺酶啟動(dòng)子(Pa)的腈水合酶表達(dá)穿梭質(zhì)粒pNV-Pa-NHM的示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 攜帶tac啟動(dòng)子的穿梭質(zhì)粒pNV18-Ptac-NHM的構(gòu)建 以質(zhì)粒pMAL-p2x(美國(guó)NEB公司)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物為CGGAATTCATTCTCATGTTTGACAGCT (下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn))和下游引物為CGGGATCCGGTCCTTG TTGGTGAAGT (下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn))得到含有tac啟動(dòng)子(-35 區(qū)和-10區(qū)序列為TTGACA和TATAAT)的DNA序列；用EcoR I和BamH I雙酶切tac啟動(dòng) 子基因和穿梭質(zhì)粒pNV18，37t:反應(yīng)過(guò)夜；將酶切產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化，然后采 用T4DNA連接酶在fC進(jìn)行連接反應(yīng)14h ;將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli JM109的感 受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，在LB培養(yǎng)基中37t:過(guò)夜培養(yǎng)后提取小量質(zhì)粒進(jìn)行酶切和電泳驗(yàn) 證，得到含有tac啟動(dòng)子的穿梭質(zhì)粒；用BamHI和HindIII雙酶切所得的含有tac啟動(dòng)子 的穿梭質(zhì)粒，用T4DNA連接酶連接插入a亞基起始密碼子gtg突變?yōu)閍tg的腈水合酶基因 (突變方法見(jiàn)Yue SHI等，Enzyme and MicrobialTechnology， 2004， 35 (6-7) ， 557-562)，轉(zhuǎn) 化E.coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，在LB培養(yǎng)基中37t:過(guò)夜培養(yǎng)后提取小量質(zhì) 粒進(jìn)行酶切和電泳驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的穿梭質(zhì)粒即為攜帶tac啟動(dòng)子的突變腈水合酶基因表 達(dá)穿梭質(zhì)粒pNV-Ptac-NHM(見(jiàn)圖1)。
實(shí)施例2 攜帶酰胺酶啟動(dòng)子(Pa)的穿梭質(zhì)粒pNV18-Pa-NHM的構(gòu)建 以發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室馴化篩選的諾卡氏菌Nocardia YS-2002 (保存在清華大學(xué)化 工系生物化公所生物信息與生物催化工程實(shí)驗(yàn)室)的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上 游弓I物CGGAATTCTGCGGACGGCGGATACGT (下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn))和下游引物 CGGGATCCCTAGGACTCCTTAGTGACT(下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn))，獲得酰胺酶啟動(dòng)子基因 Pa的DNA序列；用EcoR I和BamH I雙酶切Pa和穿梭質(zhì)粒pNV18， 37。C反應(yīng)過(guò)夜；將酶切 產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化后，在4t:采用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)14h。將連接 反應(yīng)物轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板(Kan+)，挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行搖 瓶培養(yǎng)12h。收獲細(xì)胞，提取小量質(zhì)粒進(jìn)行酶切和電泳驗(yàn)證，得含有pa的質(zhì)粒；用BamHI和 HindIII雙酶切含有pa的質(zhì)粒、用T4DNA連接酶連接插入a亞基起始密碼子gtg突變?yōu)?atg的腈水合酶基因(突變方法見(jiàn)Yue SHI等，Enzyme and Microbial Technology, 2004， 35 (6-7) ， 557-562)，轉(zhuǎn)化E. coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，搖瓶培養(yǎng)后提取小量 質(zhì)粒再次進(jìn)行酶切和電泳驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的穿梭質(zhì)粒即為攜帶Pa啟動(dòng)子的突變腈水合酶 基因表達(dá)穿梭質(zhì)粒pNV-Pa-NHM(見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例3 基因重組諾卡氏菌TH-1的構(gòu)建 將實(shí)施例1構(gòu)建的帶有tac啟動(dòng)子和突變腈水合酶基因高表達(dá)穿梭質(zhì)粒 pNV-Ptac-NHM以電穿孔法轉(zhuǎn)化諾卡氏菌Nocardia YS-2002的感受態(tài)細(xì)胞，可得基因重組 諾卡氏菌TH-1。其中，諾卡氏菌感受態(tài)細(xì)胞的制備采用《分子克隆指南》(J.薩姆布魯克， D.W.拉賽爾著)中革蘭氏陽(yáng)性菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。取liU純化后的質(zhì)粒于一個(gè) 1. 5ml的離心管中，將其和0. 1CM的電轉(zhuǎn)杯一起置于冰上預(yù)冷；將50 y 1制備好的感受態(tài)細(xì) 胞轉(zhuǎn)移至此l. 5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置lOmin ;打開(kāi)電轉(zhuǎn)儀，調(diào)節(jié)電壓為1250V ; 將穿梭質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞的混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，輕輕敲擊使得混合物均勻進(jìn) 入電轉(zhuǎn)杯的底部，同時(shí)注意混合物中不能有氣泡。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)化儀，按下電擊鍵，聽(tīng) 到蜂鳴聲后，向杯中迅速加入800 1的S0C液體培養(yǎng)基(配方見(jiàn)《分子克隆指南》)，重懸 細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。置于28t:，220rpm搖床培養(yǎng)2h ;取200iU菌液涂布于 含有20 g/ml卡那抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板，放入2『C培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 72小時(shí)后出現(xiàn)重組諾卡氏菌的單菌落，得基因重組諾卡氏菌Nocardia/pNV-Ptac-NHM，菌株名為TH-1。
實(shí)施例4 基因重組紅球菌TH-2的構(gòu)建 將實(shí)施例1所得pNV-Ptac-NHM穿梭質(zhì)粒以電傳孔法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞紅球 菌R. rhodochrous ATCC 33278，其中電轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例3，獲得基因重組紅球菌 R. rhodochrous/pNV-Ptac-NHM，菌株名為TH-2。
實(shí)施例5 : 諾卡氏菌TH-1腈水合酶的表達(dá)試驗(yàn) 采用500ml帶擋板的三角搖瓶，裝培養(yǎng)基的量為10%，將實(shí)施例3所得諾卡氏菌 TH-1和諾卡氏菌Nocardia YS-2002 (簡(jiǎn)稱"野生菌")在28。C搖床分批培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為 200rpm，培養(yǎng)92小時(shí)。所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7. 5g/ L， KH2P04 0. 5g/L， K2HP04 0. 5g/L， MgS04 7H200. 5g/L，泡敵0. 2g/L， pH值為7. 5，二價(jià)鈷離 子40ppm，其余為水；結(jié)果表明，采用tac啟動(dòng)子表達(dá)腈水合酶的重組諾卡氏菌的生長(zhǎng)情況 與原始菌株基本一致，酶活表達(dá)情況則有所不同。在發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)，重組菌的酶活達(dá)到 2939U/ml，而野生菌酶活為2711U/ml，重組菌酶活比野生菌提高了 8.4% ;發(fā)酵培養(yǎng)72小 時(shí)，重組菌酶活(3331U/ml)比野生菌(2838U/ml)提高17.4%。繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)到92小時(shí)， 重組菌酶活高達(dá)4015U/ml 。其中，腈水合酶的酶活檢測(cè)采用標(biāo)準(zhǔn)的氣相色譜內(nèi)標(biāo)法，酶活的 國(guó)際單位定義為每分鐘催化生成lPmol丙烯酰胺所需的酶量；lymol丙烯酰胺/(min. ml菌液)=1U/ml 。
實(shí)施例6 紫紅紅球菌TH-2腈水合酶基因的表達(dá)試驗(yàn) 將實(shí)施例4所得基因重組紫紅紅球菌TH-2進(jìn)行72h搖瓶培養(yǎng)，并以原始野生菌株 R. rhodochrous ATCC 33278為對(duì)照，在28°C 、搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/min條件下培養(yǎng)48小時(shí)，培 養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨7g/L， KH2P04 0. 5g/L， K2HP04 0. 5g/ L，MgS04 *7H20 0. 5g/L，pH7. 5，甲基丙烯酰胺O. 2g/L，其余為水。結(jié)果表明，野生紫紅紅球菌 的腈水合酶活性很低，總酶活僅為49U/ml，但重組紫紅紅球菌TH-2的總酶活提高到352U/ ml，比野生菌株提高了約7.2倍。
實(shí)施例7、 利用諾卡氏菌TH-1生產(chǎn)丙烯酰胺的試驗(yàn) 挑取諾卡氏菌TH-1固體平板上光滑、濕潤(rùn)的單菌落，接種在50ml種子培養(yǎng)基中 (500ml搖瓶)中，28t:培養(yǎng)48h，搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/min(所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄 糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L， KH2P04 0. 5g/L， K2HP040. 5g/L， MgS04 7H20 0. 5g/L， pH7. 5，其余為水)，得活化的諾卡氏菌TH-1 ;然后以體積比為0. 5%的接種量接種到500L 種子罐中，攪拌轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/min， 2『C培養(yǎng)40hr，種子細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殒溓驙睿Y(jié)束種子培 養(yǎng)(培養(yǎng)基組成同前)，以體積比為10%的接種量轉(zhuǎn)接裝液量為3噸的5!113發(fā)酵罐(發(fā)酵 培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖30g/L，酵母膏5. Og/L，尿素7. 5g/L， KH2P04 0. 75g/L， K2HP04 0. 75g/L， MgS04 7H20 1. Og/L，味精0. 75g/L， CoCl2 0. 06mM，丙烯酰胺4mM，泡敵0. 2g/L， pH 7. 5，其余為水)，2『C條件下培養(yǎng)至40h時(shí)，菌體形態(tài)為單個(gè)小球狀，生物量為10g/L，腈水 合酶酶活為2780U/ml。
停止培養(yǎng)，將3噸發(fā)酵液稀釋到4噸，采用微濾膜洗滌細(xì)胞，正洗壓力壓力約 0. 08MPa、反洗壓力約0. 09Mpa ;按照5%的體積分?jǐn)?shù)配制細(xì)胞懸浮液，重懸液的酶活力約為 2300U/ml。調(diào)節(jié)初始丙烯腈流量1. OmVh，向水合釜內(nèi)流加丙烯腈，流加速度從高向低逐步 調(diào)??；反應(yīng)釜夾套通_5°C冷凍鹽水，保證水合溫度維持在20°C左右，pH7. 5， 2小時(shí)后測(cè)定丙 烯酰胺濃度達(dá)到30% (W% V)，結(jié)束水合反應(yīng)。采用循環(huán)泵將丙烯酰胺水溶液打入中空纖維 超濾膜分離系統(tǒng)進(jìn)行超濾分離，結(jié)果得到30%的丙烯酰胺水溶液，外觀清澈透明；經(jīng)檢測(cè) 雜蛋白含量為8ppm，色度為10，丙烯腈濃度0.01% (W% V)，丙烯酸副產(chǎn)物濃度O. 1%，是高 質(zhì)量的丙烯酰胺水劑產(chǎn)品。 基因工程菌游離細(xì)胞反復(fù)使用6次后，腈水合酶顯著失活，將細(xì)胞離心、收集后進(jìn)
行廢棄處理。 實(shí)施例8 利用紫紅紅球菌TH-2生產(chǎn)丙烯酰胺的試驗(yàn) 按照實(shí)施例7所描述的方法，挑取基因重組紫紅紅球菌TH-2的單菌落，進(jìn)行搖瓶 培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)，得到12g/L的重組紅球菌，腈水合酶酶活為690U/ml。收 獲重組紅球菌游離細(xì)胞，按照實(shí)施例7所描述的方法，微濾洗滌后，催化水合丙烯腈生產(chǎn)丙 烯酰胺。按照10%的體積分?jǐn)?shù)配制細(xì)胞懸浮液，重懸液的酶活力約為1000U/ml。調(diào)節(jié)初 始丙烯腈流量1. OmVh，向水合釜內(nèi)流加丙烯腈，流加速度從高向低逐步調(diào)小。反應(yīng)釜夾套 通-5t:冷凍鹽水，保證水合溫度維持在2(TC左右，pH7. 5，2小時(shí)后測(cè)定丙烯酰胺濃度達(dá)到 20% (WXV)，結(jié)束水合反應(yīng)。采用循環(huán)泵將丙烯酰胺水溶液打入中空纖維超濾膜分離系統(tǒng) 進(jìn)行超濾分離，結(jié)果得到20 %的丙烯酰胺水溶液，外觀清澈透明，雜蛋白含量為15ppm，色 度為20，丙烯腈濃度0. 08% (W% V)，丙烯酸副產(chǎn)物濃度0. 4%，是合格的丙烯酰胺水劑產(chǎn)
權(quán)利要求
一種腈水合酶基因工程菌株紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)TH-2，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏登記號(hào)為CGMCC No.2105。
2. 利用權(quán)利要求1所述的腈水合酶基因工程菌生產(chǎn)丙烯酰胺的方法，按照如下步驟進(jìn)行(1) 將在4t:保藏的腈水合酶基因工程菌接入活化培養(yǎng)基中，在28 30°C 、搖床轉(zhuǎn)速為150 250轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)32 56小時(shí)，得到活化的腈水合酶基因工程菌的菌液；其中所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏1 5g/L，蛋白胨7 10g/L，KH2P04 0. 5 0. 75g/L， K2HP04 0. 5 0. 75g/L， MgS04 7H20 0. 5 1. 0g/L， pH7. 5，其余為水；(2) 按照0. 5 1. 0%的體積百分比將步驟(1)的腈水合酶基因工程菌液接種到裝有培養(yǎng)基的種子罐中，在28 3(TC、搖床轉(zhuǎn)速為200 300轉(zhuǎn)/min的條件下培養(yǎng)32 48小時(shí)，得腈水合酶基因工程菌的種子液；所述的培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏1 5g/L，蛋白胨7 10g/L， KH2P04 0. 5 0. 75g/L， K2HP04 0. 5 0. 75g/L，MgS04 7H200. 5 1. 0g/L， pH7. 5，其余為水;(3) 按照5. 0 10. 0%的體積百分比將步驟(2)所得種子液轉(zhuǎn)接種到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在28 3(TC、pH7. 5 8. 5條件下培養(yǎng)36 48小時(shí)，得發(fā)酵液；所述培養(yǎng)基的組成比例為葡萄糖20 40g/L，酵母膏5. 0 10. 0g/L，尿素7. 5 10. 0g/L，KH2P04 0. 5 1. 0g/L，K2HP04 0. 5 1. 0g/L，MgS04 *7H20 0. 5 1. 5g/L，味精0. 5 1. 5g/L， CoCl2 0.04 0. 12mM，丙烯酰胺2 6mM，泡敵0. 2 0. 3g/L， pH 7. 5 8. 5，其余為水；(4) 將發(fā)酵液稀釋為5 8g/L的菌液，然后用中空纖維微濾膜對(duì)收獲的菌體進(jìn)行微濾洗滌，清洗時(shí)采用正洗和反洗雙向反復(fù)操作直至洗滌液的色度為5 20，蛋白質(zhì)濃度為3 10卯m ;正洗壓力控制為0. 06 0. lMPa，反洗壓力控制為0. 01 0. lMPa ;再將菌液配成10 20g/L，體積分?jǐn)?shù)5 8% ，打入水合反應(yīng)釜，調(diào)節(jié)丙烯腈流量至0. 5 1. 0mVh，然后向水合釜內(nèi)流加丙烯腈，流加速度從高向低逐步調(diào)??；反應(yīng)釜夾套通_5 _9°〇冷凍鹽水或液氨，在16 26°C，pH6. 7 7. 5條件下進(jìn)行水合反應(yīng)1 3小時(shí)；接著用循環(huán)泵將水合液打入中空纖維超濾膜分離系統(tǒng)，用正洗和反洗方法反復(fù)操作濾去水合液中的細(xì)胞雜質(zhì)和雜蛋白，直至水合液的色度為5 15，蛋白質(zhì)濃度為5 15ppm，得到丙烯酰胺水合液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種腈水合酶基因工程菌株紫紅紅球菌(R.rhodochrous)TH-2，該菌株能高表達(dá)腈水合酶，并且酶活水平高，熱穩(wěn)定性好，對(duì)丙烯腈和丙烯酰胺耐受性好；此外本發(fā)明還公開(kāi)了利用該基因工程菌株生產(chǎn)丙烯酰胺的方法，用該方法生產(chǎn)所得丙烯酰胺質(zhì)量高。
文檔編號(hào)C12P13/02GK101709286SQ20091021017
公開(kāi)日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2007年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月20日
發(fā)明者于慧敏, 劉昌春, 沈忠耀 申請(qǐng)人:清華大學(xué)