專利名稱：成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及病毒轉(zhuǎn)染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)以及對其病毒轉(zhuǎn)染的方法，更具體地涉
及感染有猴泡沫病毒的成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)以及對其病毒轉(zhuǎn)染的方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)是中胚層來源的具有多向分化能力 的干細(xì)胞，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，是具有自 我復(fù)制、多向分化潛能的成體干細(xì)胞。在一定誘導(dǎo)條件下具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成 肌細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞等中胚層細(xì)胞分化的能力；同時，MSC還可以向 外胚層的神經(jīng)元細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝卵圓性細(xì)胞分化。這突破了 MSC僅為中胚層干細(xì)胞的概 念，揭示了 MSC具有更為重要的理論研究意義和更為廣闊的應(yīng)用前景。骨髓MSC體外分離 培養(yǎng)容易獲取，細(xì)胞免疫原性低，易于被外源病毒轉(zhuǎn)染且表達(dá)穩(wěn)定，已成為組織工程、基因 治療和再生醫(yī)學(xué)研究中理想的種子細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用大多是通過細(xì)胞直接自體移 植或細(xì)胞體外擴(kuò)增并自體移植的方式進(jìn)行。 無論是利用骨髓MSC作為移植細(xì)胞或者基因工程的載體細(xì)胞，其治療或使用的方 法以及效果和療效都需要經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。但以病患者為直接研究對象進(jìn)行科學(xué) 研究受到諸多因素的制約，尤其是倫理學(xué)方面的限制。因此，需要首先在實(shí)驗(yàn)動物的身上確 定各種治療方法的療效。 在所有的實(shí)驗(yàn)動物中，普遍認(rèn)為靈長類哺乳動物是與人類最接近的動物。食蟹猴 作為一種近年來大規(guī)模飼養(yǎng)的猴科靈長類哺乳動物，在各種治療方法和藥物的臨床前實(shí)驗(yàn) 中，發(fā)揮著越來越重要的作用。但是在對某些疾病的治療方法的研究中，又必須以成年靈長 類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴為對象，如老年癡呆等一些在成年人和老年人中才發(fā)生的 疾病，只有以成年靈長類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴為研究對象來進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì) 胞移植，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才更有價值。 在以食蟹猴為對象研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用中，我們發(fā)現(xiàn)成年食蟹猴的骨髓 MSC在體外傳代代數(shù)非常有限，細(xì)胞很快融合，在體外食蟹猴的骨髓MSC很難擴(kuò)增到需要的 數(shù)量。成年食蟹猴的骨髓MSC體外培養(yǎng)不過3代就出現(xiàn)大片的細(xì)胞融合。無法進(jìn)行細(xì)胞數(shù) 量的擴(kuò)增以及體外的基因工程改造的實(shí)驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是通過對成年靈長類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)
干細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件的改進(jìn)，大幅地提高成年靈長類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴骨髓
間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)的擴(kuò)增數(shù)量，以使細(xì)胞數(shù)量更易達(dá)到需要的量。 本發(fā)明的另一 目的通過對轉(zhuǎn)染條件的改進(jìn)，從而提高慢病毒對成年靈長類哺乳動
物，尤其是成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。 本發(fā)明提供一種體外培養(yǎng)成年靈長類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干
3細(xì)胞的方法，包括1)對來自成年靈長類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)
胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；11)當(dāng)細(xì)胞生長到70% 80%的匯合度時，進(jìn)行消化，傳代及培養(yǎng)；III)
每當(dāng)所述傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長到70% 80%匯合度時，再次進(jìn)行消化，傳代及培養(yǎng)；所述
傳代培養(yǎng)使用的是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有胎牛血清、青霉素和鏈霉素；其
特征在于所述傳代培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還添加有抗病毒藥物。 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗病毒藥物優(yōu)選是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物優(yōu)選是泰諾福韋。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，向所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中優(yōu)選添加FGF-b或者FGF-b與EGF
的混合物。 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述FGF-b或者所述EGF分別優(yōu)選是重組人類FGF-b 或者重組人類EGF。 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還添加GlutaMAX-I 二肽，所述 基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)選是a lpha改進(jìn)型MEM培養(yǎng)基。 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述胎牛血清優(yōu)選是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用胎牛血清。 —種體外培養(yǎng)成年靈長類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和體外 病毒轉(zhuǎn)染的方法，包括1)對來自成年靈長類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；11)當(dāng)細(xì)胞生長到70% 80%的匯合度時，進(jìn)行消化，傳代及培養(yǎng)；
III) 每當(dāng)所述傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長到70% 80%匯合度時，再次進(jìn)行消化，傳代及培養(yǎng)；
IV) 當(dāng)細(xì)胞生長到第3-5代時，對所述成年靈長類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染；所述傳代培養(yǎng)使用的是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有胎 牛血清、青霉素和鏈霉素、以及抗病毒藥物；其特征在于在進(jìn)行步驟IV)的病毒轉(zhuǎn)染前的 第2-6天將添加有胎牛血清、青霉素和鏈霉素、以及抗病毒藥物的所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為 不含抗病毒藥物的添加有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗病毒藥物優(yōu)選是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物優(yōu)選是泰諾福韋。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述病毒優(yōu)選是慢病毒。 應(yīng)用本發(fā)明的方法，所述成年靈長類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，使得細(xì)胞能夠傳代的代數(shù)增多，并使得擴(kuò)增能夠得到的細(xì)胞數(shù)量明顯增多。
應(yīng)用本發(fā)明提供的體外培養(yǎng)成年靈長類哺乳動物，尤其是成年食蟹猴骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞以及對其體外病毒轉(zhuǎn)染的方法，可以明顯提高病毒對成年靈長類哺乳動物，尤其是 成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。


圖1A和圖1B分別為本發(fā)明的實(shí)施例l和對比例1中的細(xì)胞生長到第二代時的照 片，圖1A中顯微鏡的放大倍數(shù)為100倍，圖1B中為200倍。 圖2是本發(fā)明的實(shí)施例1和對比例1中的細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增后的細(xì)胞數(shù)量增長 的折線圖。 圖3是本發(fā)明的實(shí)施例2、3和對比例2中的細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增后的細(xì)胞數(shù)量增長的柱狀對照圖。 圖4是本發(fā)明的實(shí)施例4和對比例3、4、5中的細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增后的細(xì)胞數(shù)量增長的柱狀對照圖。 圖5是本發(fā)明的實(shí)施例5和對比例6和7中的細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增后的細(xì)胞數(shù)量增長的柱狀對照圖。 圖6是本發(fā)明的實(shí)施例6和對比例8中的細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增后的細(xì)胞數(shù)量增長的折線圖，令代表實(shí)施例6中的細(xì)胞在體外擴(kuò)增的數(shù)量，A代表對比例8中的細(xì)胞在體外擴(kuò)增的數(shù)量。 圖7示出了本發(fā)明的實(shí)施例7和對比例9中的細(xì)胞在以慢病毒為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，表達(dá)GFP蛋白的陽性細(xì)胞百分比。 圖8示出了本發(fā)明的實(shí)施例7和對比例9中的細(xì)胞在以慢病毒為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，在熒光顯微鏡下所觀察到的細(xì)胞，在圖8B和8G中顯微鏡的放大倍數(shù)為200倍，在圖8D和81中放大倍數(shù)為100倍。 圖9示出了本發(fā)明中使用的包裝質(zhì)粒CMVA8.91的基因構(gòu)建圖(9A)，包裝質(zhì)粒PMD. G的基因構(gòu)建圖(9B)，載體質(zhì)粒Duetl01的基因構(gòu)建圖(9C)。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中使用了 6只8-10歲的成年食蟹猴，其猴泡沫病毒的感染率為100%。這些成年食蟹猴均來自廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司，該公司的動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施已獲得國際實(shí)驗(yàn)動物管理評估及認(rèn)證協(xié)會(Association for Assessment andAccreditationof Laboratory Animal Care，AAAUVC)的資質(zhì)認(rèn)證。在本發(fā)明中，成年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來自成年食蟹猴，這些成年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以是如下步驟所述而取自活的成年食蟹猴，當(dāng)然也可以是取自剛剛處死的動物體。取成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的過程如下 1)將骨穿剌針、紗布、手術(shù)鋪巾消毒滅菌；
2)氯胺酮(15mg/kg)肌注，動物麻醉；
3)阿托品(0. 04mg/kg)肌注，減少分泌物； 4)備皮、消毒、鋪手術(shù)巾、確定髂后上棘、用利多卡因(2-3ml)局部麻醉； 5)調(diào)節(jié)骨穿剌針，骨穿剌針與骨面垂直穿剌，固定穿剌針在髂骨內(nèi)； 6)拔出針芯，用含肝素化生理鹽水的注射器抽取5-10ml骨髓，混勻； 7)拔出穿剌針，無菌紗布局部按壓3-5min后，用紗布加壓固定。術(shù)后使用頭孢唑
啉(25mg/kg)靜脈滴注，預(yù)防感染； 8)根據(jù)取出骨髓的量，用體積為骨髓體積兩倍的DPBS稀釋，混勻； 9)在15ml離心管中加入3ml密度為1. 073的Ficoll-PaqueTMPlus分離液(Stem
Cell公司)； 10)用巴斯德管緩慢加入6ml稀釋后的骨髓，輕輕疊加到Ficoll-PaqueTMPlus分離液上； 11)2500rpm離心30分鐘，離心管內(nèi)分成4層，從上到下分別是血清、單核細(xì)胞、Ficoll-PaqueTMPlus分離液和紅細(xì)胞；
12)用巴斯德管吸取離心管中間的單核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的15ml離心管； 13)根據(jù)吸取的單核細(xì)胞懸液體積，按照1 : 3 1 : 5的體積比加入DPBS，混勻，
1500rpm離心10min，棄去上層的液體，如此洗細(xì)胞兩次； 14)將獲得的單核細(xì)胞懸液接種，在含5% (A，37t:孵箱中培養(yǎng)3天后更換培養(yǎng)基； 15)培養(yǎng)7-10天，當(dāng)細(xì)胞長到70% 80%時，用0. 25% Trypsin(胰酶)-EDTA消化，傳代培養(yǎng)。 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外傳代培養(yǎng)的過程中，不超過3代就會出現(xiàn)大片融合細(xì)胞的現(xiàn)象，這是因?yàn)槌赡晔承泛锏墓撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞大多感染了猴泡沫病毒(SimianFoamy Virus, SFV)(通常幼年食蟹猴SFV的感染率明顯低于成年食蟹猴)。因此，向本發(fā)明成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)基中添加抗病毒藥物，可以抑制細(xì)胞融合的現(xiàn)象發(fā)生，由于猴泡沫病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此，添加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的效果更佳。在本發(fā)明的實(shí)施例中，通過向成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外傳代培養(yǎng)基中添加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥物，如泰諾福韋，使上述現(xiàn)象消失。 本發(fā)明人還通過向傳代培養(yǎng)基中添加FGF-b或者FGF-b與EGF的混合物，使細(xì)胞在體外擴(kuò)增的數(shù)量增加。所述FGF-b或者所述EGF分別可以是重組人類FGF-b或者重組人類EGF。 本發(fā)明人還通過使用a lpha改進(jìn)型MEM培養(yǎng)基(a MEM)作為成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并向a lpha改進(jìn)型MEM培養(yǎng)基(a MEM)中添加GlutaMAX-I 二肽，結(jié)果使得細(xì)胞在體外擴(kuò)增的數(shù)量進(jìn)一步增加。 本發(fā)明人還通過選用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用胎牛血清代替普通的胎牛血清添加到成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)基中，使得細(xì)胞在體外擴(kuò)增的數(shù)量進(jìn)一步增加。 實(shí)施例1和對比例1 :在傳代培養(yǎng)基中添加或未添加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物泰諾福韋
將來自成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在實(shí)施例1中向以下的包含其它成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基而成的傳代培養(yǎng)基中添加泰諾福韋(LGM pharmaceuticals),100ml的傳代培養(yǎng)基中加入lOiiM ;在比較例1中則不添加泰諾福韋。 100ml的傳代培養(yǎng)基中包括的各成分(1)88 % (體積百分比)的
DMEM(invitrogen)，此為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(2)其它成分10%的優(yōu)等胎牛血清(GIBC0)、1X的
L-谷氨酰胺液體(invitrogen) 、 1 %的青霉素_鏈霉素液體(invitrogen)。 細(xì)胞第一次傳代的接種數(shù)量為1 X 105，細(xì)胞接種的密度為1000/cm2。 結(jié)果實(shí)施例1中的細(xì)胞沒有很快出現(xiàn)大片融合的現(xiàn)象，可以傳IO代以上。而在
對比例1中的細(xì)胞在第2代中就出現(xiàn)了細(xì)胞的大片融合現(xiàn)象，不能繼續(xù)傳代?？蓞⒁妶D1
中的細(xì)胞照片，以及圖2中的折線圖。 在以上實(shí)驗(yàn)中還可以使用抗病毒藥物恩曲他濱和施多寧，其他條件與實(shí)施例1相同，同樣可以達(dá)到實(shí)施例1中的效果。 實(shí)施例2、3和對比例2 :在傳代培養(yǎng)基中添加不同的生長因子 將來自成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在實(shí)施例2和3以及對比
例2中分別向傳代培養(yǎng)基中添加不同的生長因子，在實(shí)施例2中添加FGF-b (Invitrogen)，濃度為20ng/ml ;在實(shí)施例3中添加FGF-b (Invitrogen)與EGF(Invitrogen)的混合物，濃度各為10ng/ml，兩種生長因子的總濃度為20ng/ml ;在對比例2中添加EGF (Invitrogen)，濃度為20ng/ml。 100ml的傳代培養(yǎng)基的各成分為(1)88% (體積百分比)的a MEM (Invitrogen)，此為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(2)其它成分1% GlutaMAX-I (Invitrogen) 、1%青霉素_鏈霉素液體(Invitrogen) 、 10 iiM泰諾福韋(LGM pharmaceuticals) 、 10%骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用胎牛血清(GIBC0， AUS)。 細(xì)胞第一次傳代的接種數(shù)量為1X1()S，細(xì)胞接種的密度為1000/cm2。 GlutaMAX-I是一種L-谷氨酰胺的二肽衍生物，將其不穩(wěn)定的a -氨基用L-丙氨酸保護(hù)，該二肽衍生物非常穩(wěn)定，在高溫下裂解較少，肽酶可以將其裂解。 結(jié)果實(shí)施例2和3中的細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量和速度明顯大于對比例2中的細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量和速度。具體參見圖3中的柱狀圖。 實(shí)施例4和對比例3、4、5 :不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和/或不同的添加因子
將來自成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在實(shí)施例4中使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基a MEM (Invitrogen)(體積百分比為88% )和添加因子Gluta恵-I (Invitrogen)(體積百分比為1%);在對比例3中使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基aMEM(Invitrogen)(體積百分比為88%)和L-谷氨酰胺(Invitrogen)(體積百分比為1%);在對比例4中使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM(體積百分比為88% )和Gluta恵-I (Invitrogen)(體積百分比為1% );在對比例5中使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM(體積百分比為88% )和L-谷氨酰胺(Invitrogen)(體積百分比為1% )。
100ml的傳代培養(yǎng)基的其他成分為1 %青霉素_鏈霉素液體(Invitrogen) 、 10 ii M泰諾福韋(LGM pharmaceuticals) 、10%骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用胎牛血清(GIBC0， AUS)、濃度為20ng/ml的FGF_b (Invitrogen)。 細(xì)胞第一次傳代的接種數(shù)量為1 X 105，細(xì)胞接種的密度為1000/cm2。 結(jié)果實(shí)施例4中的細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量和速度明顯大于對比例3、4、5中的細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)
量和速度。具體參見圖4中的柱狀圖。 實(shí)施例5和對比例6和7 :在傳代培養(yǎng)基中不同的血清 將來自成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在實(shí)施例5中使用MSC專用胎牛血清(GIBC0， AUS);在對比例6中使用USA產(chǎn)的優(yōu)等胎牛血清(invitrogen, USA);在對比例7中使用AUS產(chǎn)的優(yōu)等胎牛血清(invitrogen, AUS)。 100ml的傳代培養(yǎng)基的各成分為(l)基礎(chǔ)培養(yǎng)基88% (體積百分比)的a MEM (Invitrogen) ; (2)其他成分1 % GlutaMAX-I (Invitrogen) 、 1 %青霉素_鏈霉素液體(Invitrogen) 、10 u M泰諾福韋(LGM pharmaceuticals)、濃度為20ng/ml的FGF_b(Invitrogen)。 細(xì)胞第一次傳代的接種數(shù)量為1 X 105，細(xì)胞接種的密度為1000/cm2。 結(jié)果實(shí)施例5中的細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量和速度明顯大于對比例6和7中的細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)
量和速度。具體參見圖5中的柱狀圖。 實(shí)施例6和對比例8 :在傳代培養(yǎng)基中不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及其他成分 將來自成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在實(shí)施例6中使用的培養(yǎng)
基成分為:88% (體積百分比)的a MEM (Invitrogen) (a MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、MSC專用胎牛血清(GIBC0，AUS) 、1% Gluta恵-I (Invitrogen) 、 1 %青霉素-鏈霉素液體(Invitrogen)、10uM泰諾福韋(LGM pharmaceuticals)、濃度為20ng/ml的FGF-b (Invitrogen);在對比例8中使用的培養(yǎng)基成分為88% (體積百分比)的DMEM(invitrogen)(此為基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、1 %的L-谷氨酰胺液體(invitrogen) 、 1 %的青霉素_鏈霉素液體(invitrogen) 、 10 y M泰諾福韋(LGM pharmaceuticals)。 細(xì)胞第一次傳代的接種數(shù)量為1 X 105，細(xì)胞接種的密度為1000/cm2。 結(jié)果實(shí)施例6中的細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量明顯大于對比例8中的細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量。具體參
見圖6中的折線圖。 通過向感染成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)基中添加抗逆轉(zhuǎn)錄病毒
藥物如泰諾福韋、FGF-b或者FGF-b與EGF的混合物等，并且通過用本發(fā)明中的使細(xì)胞擴(kuò)增
數(shù)量和速度增加的培養(yǎng)基成分，使得第一代1 X 105個細(xì)胞可以擴(kuò)增到6 8X 107。使成年
食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增可以滿足試驗(yàn)對細(xì)胞數(shù)量的需要，對于各種療法或藥物的
臨床前實(shí)驗(yàn)的發(fā)展具有重要的意義。 實(shí)施例7和對比例9 :慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 在該實(shí)驗(yàn)中，在實(shí)施例7中我們采用以實(shí)施例6中的條件傳代培養(yǎng)的成年食蟹猴
的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，即88% (體積百分比)的aMEM(Invitrogen)、MSC專用胎牛血清
(GIBCO， AUS) 、 1 % Gluta恵-I (Invitrogen) 、 1 %青霉素-鏈霉素液體(Invitrogen) 、 10 ii M
泰諾福韋(LGM pharmaceuticals)、濃度為20ng/ml的FGF-b (Invitrogen);當(dāng)細(xì)胞生長到
第四代時，將培養(yǎng)基換成不包含泰諾福韋的培養(yǎng)基，其余成分與上述培養(yǎng)基相同。當(dāng)在不包
含泰諾福韋的培養(yǎng)基中生長6天后進(jìn)行以慢病毒為載體的病毒轉(zhuǎn)染，20小時后檢測細(xì)胞被
病毒轉(zhuǎn)染的效率。在對比例9中，使用與實(shí)施例7中相同的條件，只是在細(xì)胞培養(yǎng)和病毒轉(zhuǎn)
染的過程中一直都使用泰諾福韋。以下是慢病毒制備以及轉(zhuǎn)染的過程 第一步慢病毒的制備(即在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒的擴(kuò)增) 1)傳代培養(yǎng)293T細(xì)胞，保持細(xì)胞在較高的密度，按1 : 4 1 : 5分傳； 2)在轉(zhuǎn)染病毒前一天，用100 g/ml的多聚-右旋-賴氨酸溶液包被100mm培養(yǎng)
皿(使細(xì)胞貼壁更牢)，室溫作用60min，使用前用無菌PBS洗兩次； 3)使293T細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前可以達(dá)到70 80%匯片；4)取400ii1 OPTI-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)置于5ml聚苯乙烯管中，將載體質(zhì)粒
DNA按照DUETIOI : CMV8. 91 : PMD. G = 3 : 4 : 1比例溶于其中，這三種載體質(zhì)粒DNA來
自霍普金其j 大學(xué)禾呈臨釗實(shí)驗(yàn)室(http://www.addgene.org/pgvecl f = c & identifier
=17629 & cmd = f indpl& attag = c)。三個質(zhì)粒DNA總量為16 y g，混勻，室溫放置5min ; 5)同樣取Lipof ectamine2000脂質(zhì)體(GIBCO) 32 ii 1加入另 一 盛有400 ii 1
OPTI-MEM(Invitrogen)的聚苯乙烯管中，輕柔混勻，室溫放置5min ; 6)再將步驟4)和5)得到的兩種液體混合，室溫放置20min ; 7)將質(zhì)粒DNA與Lipof ectamine2000脂質(zhì)體的混合液加入含有8ml新鮮培養(yǎng)基的
293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，混勻，37"C，5X C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 8)轉(zhuǎn)染后12h，棄去轉(zhuǎn)染液，加入8ml ITS培養(yǎng)液收集病毒上清；9)繼續(xù)培養(yǎng)24hr、48hr后收集病毒上清，500rpm離心去除細(xì)胞碎片，用0.45iim
濾器過濾到無菌離心管中，在濃縮前在4t:下進(jìn)行保存。
第二步慢病毒的濃縮 1)取4ml無菌DPBS加到Ultra-Plus 20濾膜(Millipore)上，2500rpm離心5分鐘，濕潤濾膜。棄去管底DPBS溶液。 2)將經(jīng)過0. 45 ii m濾器過濾的病毒上清加入濾膜套管內(nèi)，4°C ， 4000g離心20min。
3)吸取濾膜插件上的上清，分裝于1. 5ml EP管中，滴度鑒定后儲存于-S(TC冰箱中，備用。 第三步慢病毒滴度的鑒定 1)用100 g/ml的多聚-右旋-賴氨酸溶液包被六孔板，以每孔2 X 105個細(xì)胞的密度將293T細(xì)胞接種于六孔板。 2)將病毒上清加入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，以8 y g/ml的濃度加入聚凝胺。
3)熒光顯微鏡下計算綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞數(shù)，以下面公式計算病毒上清滴度。病毒滴度=綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞百分比X293細(xì)胞總數(shù)/加入病毒上清的體積。
第四步慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 1)根據(jù)綠色熒光蛋白(GFP)病毒滴度和細(xì)胞數(shù)量，按照MOI值等于IO加入病毒上清(MOI =病毒數(shù)/細(xì)胞數(shù)，即相當(dāng)于IO個病毒一個細(xì)胞)，以lOyg/ml的濃度加入聚凝胺。孵育20小時后棄去轉(zhuǎn)染液，加入新鮮培養(yǎng)基； 2)培養(yǎng)1周后，熒光顯微鏡下觀察，同時在不同時間點(diǎn)計算轉(zhuǎn)染效率。
結(jié)果在實(shí)施例7中慢病毒轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到55%，而對比例9中的慢病毒轉(zhuǎn)染效率只有10%左右?？梢娎帽景l(fā)明的方法可以大大地提高成年食蟹猴MSC細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率?？梢詤⒁妶D7和圖8。 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
一種體外培養(yǎng)成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括I)對來自所述成年食蟹猴的所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；II)當(dāng)所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長到70％～80％的匯合度時，進(jìn)行消化，傳代及培養(yǎng)；III)每當(dāng)所述傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長到70％～80％匯合度時，再次進(jìn)行消化，傳代及培養(yǎng)；所述傳代培養(yǎng)使用的是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有胎牛血清、青霉素和鏈霉素；其特征在于向所述傳代培養(yǎng)的添加有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有抗病毒藥物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述抗病毒藥物是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物是泰諾福韋。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于向所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加FGF-b或者 FGF-b與EGF的混合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述FGF-b或者所述EGF分別是重組人 類FGF-b或者重組人類EGF。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還添加有 GlutaMAX-I 二肽，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是a lpha改進(jìn)型MEM培養(yǎng)基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述胎牛血清是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用 胎牛血清。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于傳代培養(yǎng)的1 X 105個第一代細(xì)胞能夠擴(kuò) 增到6X107 8X107個細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠 傳代10代以上。
10. —種體外培養(yǎng)成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及對其進(jìn)行體外病毒轉(zhuǎn)染的方法， 包括I) 對來自成年食蟹猴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；II) 當(dāng)細(xì)胞生長到70% 80%的匯合度時，進(jìn)行消化，傳代及培養(yǎng)；III) 每當(dāng)所述傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長到70% 80%匯合度時，再次進(jìn)行消化，傳代及培養(yǎng)；IV) 當(dāng)細(xì)胞生長到第3-5代時，對所述成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染； 所述傳代培養(yǎng)使用的是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有胎牛血清、青霉素和鏈霉素、以及抗病毒藥物；其特征在于在進(jìn)行步驟IV)的所述病毒轉(zhuǎn)染前的第2-6天將添加有胎牛血清、青霉素 和鏈霉素、以及抗病毒藥物的所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為不含所述抗病毒藥物的添加有胎牛血 清、青霉素和鏈霉素的所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述抗病毒藥物是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物是泰諾福韋。
全文摘要
本發(fā)明涉及成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)以及對其體外病毒轉(zhuǎn)染的方法。在本發(fā)明提供的方法中，向成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)基中添加抗病毒藥物使成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外傳代的代數(shù)增加，細(xì)胞擴(kuò)增的數(shù)量增加。在本發(fā)明中，進(jìn)一步通過對培養(yǎng)條件的改進(jìn)使細(xì)胞擴(kuò)增的數(shù)量大幅增加。通過對病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法進(jìn)行改進(jìn)，提高了體外培養(yǎng)的成年食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染效率。
文檔編號C12N5/0775GK101698830SQ20091020968
公開日2010年4月28日 申請日期2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者任振華, 岳峰, 張愚, 王淑艷, 鄒春林 申請人:廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司