本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)單倍體育種技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種促進茄子花粉胚增殖的方法。
背景技術(shù):
人工產(chǎn)生單倍體主要由花藥培養(yǎng)和小孢子(花粉)培養(yǎng)來實現(xiàn)。經(jīng)自發(fā)加倍或人工誘發(fā)加倍,獲得純合可育的二倍體植株,使育種者可以選擇滿意的基因組合,為進一步的育種和遺傳研究提供有用材料。愈傷誘導和胚狀體誘導是花藥和小孢子培養(yǎng)的兩種主要誘導途徑。愈傷誘導途徑是通過組培技術(shù)將處于一定發(fā)育階段的花粉誘導形成細胞團,進一步形成無分化的薄壁組織即愈傷組織,再分化形成完整的植株。胚狀體誘導途徑是由花粉直接誘導分化形成胚狀體,胚狀體再直接分化形成的植株。愈傷誘導相對容易,可獲得再生率較高的再生植株。但由于花絲和包裹花粉的花藥壁屬于二倍體組織,因此通過愈傷誘導形成的再生植株的其倍性容易混雜,需要后期經(jīng)過大量的細胞學鑒定確認植株的倍性后才能在實際應用中得到應用。在現(xiàn)有專利權(quán)的茄子花藥、小孢子培養(yǎng)操作中主要利用愈傷誘導實現(xiàn)?;ǚ叟哒T導可直接產(chǎn)生單倍體植株,省卻對其倍性進行鑒定的步驟,節(jié)約大量的時間和精力?;ㄋ幣囵B(yǎng)和小孢子培養(yǎng)均可以誘導花粉的胚狀體。小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導效率雖高于花藥培養(yǎng),但其技術(shù)難度、操作要求和應用成本均高于花藥培養(yǎng),并且植株的再生率要低于花藥培養(yǎng)。
綜上所述,現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是:利用花藥培養(yǎng)誘導花粉胚獲得單倍體植株的操作難度、應用成本更低,但胚狀體的誘導效率低。在傳統(tǒng)的花藥培養(yǎng)過程中,導致花粉胚狀體誘導效率低的主要原因涉及營養(yǎng)條件、激素配比、培養(yǎng)條件等各個方面。而提高花藥培養(yǎng)的胚狀體誘導率需要大量的取樣、設(shè)計、試驗比較,對多因素進行調(diào)整以及篩選,并從花粉胚產(chǎn)生開始全過程跟蹤記錄每一個胚分化生長的情況。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題,本發(fā)明提供了一種促進茄子花粉胚增殖的方法。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的,通過在茄子花粉胚萌動時調(diào)整外源激素的配比達到刺激多胚萌發(fā)的效果。試驗證明調(diào)整胚分化培養(yǎng)基中的生長素和細胞分裂素的配比濃度,可以提高花粉胚狀體的誘導頻率,由此獲得一種促進茄子花粉胚增殖的方法,所述促進茄子花粉胚增殖的方法采用胚增殖培養(yǎng);
所述胚增殖將茄子花藥培養(yǎng)出胚狀體,待胚狀體肉眼可見,取出帶有胚狀體的單個花藥,移至胚增殖培養(yǎng)基中。胚增殖培養(yǎng)基:ms+0.01~0.05mg·l-1naa+1~2mg·l-1kt+2%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8;將單個胚狀體移至到再生培養(yǎng)基上再生植株;再生培養(yǎng)基:ms+3%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8。
進一步,所述胚增殖之前需要進行:
(1)茄子花蕾選擇二薹花以上,發(fā)育正常,無表面損傷、花萼包裹緊密的花蕾,花冠或低或高于花萼裂基部1-2mm時;
(2)將采集到的適宜大小的花蕾用封口袋封閉,冰盒運輸,并放入4℃冷藏室保存24-48h備用;
(3)茄子花蕾表面用70%酒精進行消毒30s、無菌水清洗3次、1g·l-1的hgcl2加吐溫1滴浸泡7min、無菌水清洗5次,后用無菌紙吸干花蕾;從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?,接種于裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中;
(4)將接種好的花藥放到暗培養(yǎng)箱中進行36℃,6~7d的熱激處理;
(5)經(jīng)高溫熱激處理后的花藥放置在25℃±1℃,光照強度1500-2500lx,光照時間12-16h,濕度60%下培養(yǎng)5d,然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上,之后每隔15-20d繼代一次;
進一步,所述接種培養(yǎng)基:ms+0.2mg·l-12,4-d+1mg·l-1kt+8mg·l-1vc+4mg·l-1agno3+3%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8。
進一步,所述分化培養(yǎng)基:ms+0.1mg·l-1kt+8mg·l-1vc+3%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8。
本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為:利用花藥培養(yǎng)技術(shù)直接誘導胚狀體的形成,避免了愈傷組織的產(chǎn)生,誘胚率提高至15%(誘胚率=產(chǎn)生胚狀體數(shù)目/接種花藥數(shù)×100%),同時又不需要如小孢子培養(yǎng)中復雜的培養(yǎng)基和繁瑣的操作步驟,成本降低50%以上,更利于實際應用。未經(jīng)過胚增殖培養(yǎng)的花粉胚,出胚數(shù)平均為1-3個。通過胚增殖技術(shù),可以將70%已出胚的單個花藥的出胚數(shù)平均增殖至5個以上,最多可增殖至45個,極大的提高了獲得花培植株的效率。
本發(fā)明利用在常規(guī)花藥培養(yǎng)過程中增加胚增殖培養(yǎng)步驟,在茄子花藥出胚時期,利用出胚花藥的胚型分化條件,調(diào)整激素配比、營養(yǎng)條件,促進多個花粉細胞的胚分化,從而使出胚花藥表現(xiàn)出多胚的萌發(fā)。茄子出胚花藥的出胚數(shù)可顯著增加2倍以上,可將花藥培養(yǎng)的誘胚率提高至15%。
附圖說明
圖1是本發(fā)明實施例提供的促進茄子花粉胚增殖的方法流程圖。
圖2是本發(fā)明實施例提供的不同茄子材料在不同培養(yǎng)基中單個出胚花藥的平均出胚數(shù)示意圖。
圖3是本發(fā)明實施例提供的花粉胚增殖培養(yǎng)植株的倍性鑒定示意圖;
圖中:a:對照二倍體植株;b:混倍體植株;c、d:單倍體植株。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白,以下結(jié)合實施例,對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解,此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。
如圖1所示,本發(fā)明實施例提供的促進茄子花粉胚增殖的方法包括以下步驟:
s101:茄子花蕾選擇二薹花以上,發(fā)育正常,無表面損傷、花萼包裹緊密的花蕾,花冠或低或高于花萼裂基部1-2mm時,此時花藥一般為黃綠色;
s102:將采集到的適宜大小的花蕾用封口袋封閉,冰盒運輸,并放入4℃冷藏室保存24-48h備用;
s103:茄子花蕾表面用70%酒精進行消毒30s、無菌水清洗3次、1g·l-1的hgcl2加吐溫1滴浸泡7min、無菌水清洗5次,后用無菌紙吸干花蕾。從花蕾中剝?nèi)』ㄋ帲臃N于裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中;接種培養(yǎng)基:ms+0.2mg·l-12,4-d+1mg·l-1kt+8mg·l-1vc+4mg·l-1agno3+3%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8;
s104:將接種好的花藥放到暗培養(yǎng)箱中進行36℃,6~7d的熱激處理;
s105:經(jīng)高溫熱激處理后的花藥放置在(25±1)℃,光照強度1500-2500lx,光照時間12-16h,濕度60%下培養(yǎng)5d,然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上:ms+0.1mg·l-1kt+8mg·l-1vc+3%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8,之后每隔15-20d繼代一次;
s106:茄子花藥培養(yǎng)一般30-40d左右出現(xiàn)胚狀體,待胚狀體肉眼可見,取出帶有胚狀體的單個花藥,移至胚增殖培養(yǎng)基中,胚增殖培養(yǎng)基:ms+0.01~0.05mg·l-1naa+1~2mg·l-1kt+2%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8,對照培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基;
s107:隨著胚狀體一端顏色逐漸轉(zhuǎn)綠出現(xiàn)綠色小芽時,將單個胚狀體移至到再生培養(yǎng)基上再生植株;再生培養(yǎng)基:ms+3%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8;
s108:取葉樣采用流式細胞儀檢測倍性。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步的描述。
實施例1:
一、本發(fā)明的實施例的具體步驟為:
1、材料的選擇
茄子花蕾選擇二薹花以上,發(fā)育正常,無表面損傷、花萼包裹緊密的花蕾,花冠或低或高于花萼裂基部1-2mm時,此時花藥一般為黃綠色。
2、低溫預處理
將采集到的適宜大小的花蕾用封口袋封閉,冰盒運輸,并放入4℃冷藏室保存24-48h備用。
3、接種
茄子花蕾表面用70%酒精進行消毒30s、無菌水清洗3次、1g·l-1的hgcl2加吐溫1滴浸泡7min、無菌水清洗5次,后用無菌紙吸干花蕾。從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?,接種于裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。接種培養(yǎng)基:ms+0.2mg·l-12,4-d+1mg·l-1kt+8mg·l-1vc+4mg·l-1agno3+3%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8。
4、高溫熱激處理
將接種好的花藥放到暗培養(yǎng)箱中進行36℃,6~7d的熱激處理。
5、花藥培養(yǎng)
經(jīng)高溫熱激處理后的花藥放置在(25±1)℃,光照強度1500-2500lx,光照時間12-16h,濕度60%下培養(yǎng)5d,然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上:ms+0.1mg·l-1kt+8mg·l-1vc+3%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8,之后每隔15-20d繼代一次。
6、多胚誘導
茄子花藥培養(yǎng)一般30-40d左右出現(xiàn)胚狀體,待胚狀體肉眼可見,取出帶有胚狀體的單個花藥,移至胚增殖培養(yǎng)基中,胚增殖培養(yǎng)基:ms+0.01~0.05mg·l-1naa+1~2mg·l-1kt+2%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8,對照培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基。
對照為未經(jīng)多胚誘導,待胚狀體肉眼可見,取出帶有胚狀體的單個花藥,直接移至再生培養(yǎng)基上。
7、胚狀體再生植株
隨著胚狀體一端顏色逐漸轉(zhuǎn)綠出現(xiàn)綠色小芽時,將單個胚狀體移至到再生培養(yǎng)基上再生植株。再生培養(yǎng)基:ms+3%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8。
8、倍性鑒定
取葉樣采用流式細胞儀檢測倍性。
二、結(jié)果分析:
1、茄子花粉胚增殖誘導過程
茄子花藥培養(yǎng)采用的接種培養(yǎng)基為:ms+0.2mg·l-12,4-d+1mg·l-1kt+8mg·l-1vc+4mg·l-1agno3+3%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8。經(jīng)高溫熱激處理后的花藥放置在25-28℃,光照強度在1500-2000lx、光照12-16h·d-1下培養(yǎng),視培養(yǎng)情況,每隔15-20d更新培養(yǎng)基一次。一般情況下30d左右會出現(xiàn)胚狀體。待胚狀體肉眼可見,取出帶有胚狀體的單個花藥,移至胚增殖培養(yǎng)基中,胚增殖培養(yǎng)基:ms+0.01~0.05mg·l-1naa+1~2mg·l-1kt+2%蔗糖+7g·l-1瓊脂,ph5.8。隨著胚狀體一端顏色逐漸轉(zhuǎn)綠出現(xiàn)綠色小芽時,將單個胚狀體移至到再生培養(yǎng)基上再生植株。
2、多胚誘導效率
本實驗選用了5個不同類型的茄子材料用以比較胚增殖培養(yǎng)基的多胚誘導效果,每種茄子材料在不同培養(yǎng)基中接種100個花藥,分別統(tǒng)計各個材料單個出胚花藥的平均出胚數(shù)。比較常規(guī)培養(yǎng)和經(jīng)過胚增殖培養(yǎng)單個出胚花藥的平均出胚數(shù)差異。
表1常規(guī)培養(yǎng)和經(jīng)過胚增殖培養(yǎng)單個出胚花藥的平均出胚數(shù)多重比較
各個材料單個出胚花藥的平均出胚數(shù)見圖2,單個出胚花藥出胚數(shù)經(jīng)多重比較分析(見表1)。16-243,16-278,16-291三個材料及總平均數(shù)在不同培養(yǎng)條件下差異達到極顯著水平。由此說明經(jīng)過胚增殖培養(yǎng),可刺激單個出胚花藥中多個花粉細胞的胚分化,顯著增加茄子出胚花藥的出胚數(shù),因此提高花藥培養(yǎng)的誘胚率。
3、花粉胚增殖培養(yǎng)植株倍性鑒定
采用倍性檢測儀parteccyflowspace對15份茄子花粉胚培養(yǎng)材料進行檢測,確定茄子花藥培養(yǎng)植株的倍性,由樣本的熒光強度mean判斷倍性,將茄子二倍體峰設(shè)在200,則單倍體峰在100。15份花藥培養(yǎng)植株中除2株檢測為混倍體,1株未檢測出倍性不做統(tǒng)計,其余12株材料均為單倍體植株,茄子單倍體植株獲得效率為85.7%。
本發(fā)明利用在常規(guī)花藥培養(yǎng)過程中增加胚增殖培養(yǎng)步驟,在茄子花藥出胚時期,利用出胚花藥的胚型分化條件,調(diào)整激素配比、營養(yǎng)條件,促進多個花粉細胞的胚分化,從而使出胚花藥表現(xiàn)出多胚的萌發(fā),顯著增加茄子出胚花藥的出胚數(shù),提高花藥培養(yǎng)的誘胚率?;ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)直接誘導胚狀體的形成,避免了愈傷組織的產(chǎn)生,提高了單倍體植株產(chǎn)生的效率,同時又不需要如小孢子培養(yǎng)中復雜的培養(yǎng)基和繁瑣的操作步驟,成本更低,更利于實際應用。
茄子的孢子體為二倍體(2n),其配子體(花粉、卵細胞)只含有一套染色體。在滿足特定的生理條件后,配子體未經(jīng)受精可直接發(fā)育成植株,但這樣的植株只含有一套染色體,屬于單倍體植株。單倍體植株在有性生殖過程中,不能進行正常的減數(shù)分裂,因而高度不育。但單倍體植株經(jīng)染色體加倍,可成為加倍單倍體或雙單倍體(dh系),屬于純合二倍體,育性得到恢復。單倍體自然發(fā)生的頻率很低,人工誘發(fā)單倍體的性細胞發(fā)育是獲得單倍體植株的重要方法。單倍體育種,主要是指通過花藥培養(yǎng)或游離小孢子培養(yǎng)的方式得到單倍體植株,然后經(jīng)秋水仙素等處理加倍為雙單倍體,從而直接獲得純化的品系或?qū)⑵渥鳛橛N過程中的中間材料或親本的育種方式。
單倍體育種可以直接獲得純合的二倍體,避免進行多代自交,縮短了育種年限。雜合二倍體中顯性性狀會掩蓋隱形性狀的表現(xiàn),然而在純合二倍體中可以排除這一干擾,隱形性狀得以在當代表現(xiàn),即表現(xiàn)型與基因型一致,提高了選擇的準確性和可靠性。在同一選擇周期中,單倍體選擇效率要比二倍體高很多。由于該技術(shù)能快速純化育種材料,縮短育種周期,提高育種效率,創(chuàng)制商業(yè)品種而受到農(nóng)業(yè)育種者的青睞。
花藥培養(yǎng)是目前在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域廣泛應用的一項單倍體育種技術(shù)。該技術(shù)把花粉發(fā)育到一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上,改變花粉粒的發(fā)育途徑,形成花粉胚或花粉愈傷組織。隨后由胚狀體直接發(fā)育為植株或誘導愈傷組織分化成植株。實踐證明,經(jīng)花藥培養(yǎng)得到的花粉株系系間性狀變異幅度大,超親現(xiàn)象和出現(xiàn)特殊優(yōu)良性狀的頻率要顯著高于常規(guī)育種;株系內(nèi)性狀整齊,世代間穩(wěn)定性強;通過花藥培養(yǎng)選出的自交系具有高度的純合性,以此配制的雜交組合往往具有更強的雜種優(yōu)勢。提高花藥培養(yǎng)中胚狀體的產(chǎn)生效率,將會增加獲得的單倍體植株的幾率,進而增加單倍體育種選擇的群體,有利于提高單倍體育種的效率。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等,均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。