本發(fā)明屬于鋅鐵強(qiáng)化方法領(lǐng)域，具體涉及一種谷氨酰硫化物的芽苗菜鋅鐵強(qiáng)化方法。

背景技術(shù)：

芽苗菜，通常指利用植物種子在黑暗或光照條件下經(jīng)萌發(fā)形成直接可供食用的嫩芽、幼苗或幼莖，被譽(yù)為“餐桌上的一抹嫩綠”，深受人們喜愛。芽苗菜在浸泡發(fā)芽的過程中，高分子儲備物轉(zhuǎn)化為可溶性小分子化合物，更利于人體吸收，且種子萌發(fā)使植酸含量大幅度降低，更利于提高礦質(zhì)的生物利用。

鋅鐵是人體必需的微量元素。據(jù)統(tǒng)計，全球20-50％的人口面臨鋅鐵缺乏引起的疾病威脅。在我國，長期的飲食習(xí)慣使得鋅鐵主要通過植物性食物進(jìn)入人體。由于植源性鋅鐵會受到存在于食物中的草酸、多酚、肌醇六磷酸、膳食纖維甚至鈣離子等抑制劑的影響，機(jī)體對鋅鐵的生物利用率極低。目前，解決人體礦質(zhì)元素缺乏問題的途徑通常有以下弊端，常規(guī)植物育種耗時費錢，生物技術(shù)費用高昂且伴有生物安全問題，長期高鋅鐵農(nóng)藝種植也會帶來土壤有效鋅鐵衰竭，傳統(tǒng)補(bǔ)鋅鐵制劑易導(dǎo)致過量，進(jìn)而產(chǎn)生自由基破壞機(jī)體和增加癌癥的風(fēng)險。大量研究表明，對糧食作物礦質(zhì)元素的生物強(qiáng)化是解決人體微量元素缺乏的最有前景途徑之一。因此，找到安全高效的礦質(zhì)元素強(qiáng)化方法提高糧食鋅鐵生物有效性以滿足亟待解決的鋅鐵缺乏問題是十分必要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠提高鋅鐵生物利用率的谷氨酰硫化物的芽苗菜鋅鐵強(qiáng)化方法。

一種谷氨酰硫化物的芽苗菜鋅鐵強(qiáng)化方法，包括以下步驟：將待發(fā)芽芽苗菜試材用蒸餾水清洗陰干，在乙酸鋅溶液(0-100μg/mL，以純鋅計)或硫酸亞鐵溶液(0-50μg/mL，以純鐵計)中浸泡12h，期間以鋅鐵等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)5-7天。

前述谷氨酰硫化物可以為γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸、大蒜提取物、蒜泥中的任意一種。

前述谷氨酰硫化物可以為γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸、大蒜提取物、蒜泥中的任意兩種、三種、四種、五種或六種的混合物。

前述芽苗菜試材可以為綠豆芽、紅豆芽、黃豆芽、玉米芽或大蒜苗。

本發(fā)明的有益之處在于：

(一)研究發(fā)現(xiàn)隨著鋅鐵培養(yǎng)液濃度的升高，添加谷氨酰硫化物的各種芽苗菜中鋅鐵總量均出現(xiàn)增加的情況。但是，過高濃度的鋅鐵培養(yǎng)液可能會導(dǎo)致芽苗菜表現(xiàn)出中毒癥狀，輕者抑制生根發(fā)芽，重者萎蔫死亡，雖然也能測出生長抑制的芽苗菜鋅鐵總含量在增加，但已失去食用和經(jīng)濟(jì)價值。本發(fā)明一種谷氨酰硫化物的芽苗菜鋅鐵強(qiáng)化方法是利用了谷氨酰半胱氨酸硫化物為類植物螯合肽具有羧基和巰基的化學(xué)本質(zhì)，其具備較好的礦質(zhì)元素螯合能力，其不僅僅可以改善環(huán)境鋅鐵的溶解狀態(tài)，輔助鋅鐵跨膜運(yùn)輸，還可以在外界鋅鐵濃度過高時增強(qiáng)植物解毒排毒能力。因此添加谷氨酰硫化物不但可以減弱減緩芽苗中毒癥狀的出現(xiàn)，既不會抑制芽苗菜的生根發(fā)芽，更不會出現(xiàn)萎蔫死亡的現(xiàn)象，相反還會促進(jìn)芽苗的生長，改善芽苗生長狀態(tài)；更重要的是本方法可以不同程度提高芽苗菜對環(huán)境中鋅鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)各個環(huán)節(jié)的效率，從而增加不同部位鋅鐵含量，使得添加谷氨酰硫化物的芽苗菜比直接添加鋅鐵的芽苗菜的不同部位鋅鐵含量增加幅度在0-1074％范圍內(nèi)，該方法還能起到減少芽苗菜生長生產(chǎn)時間，有利于芽苗菜作為鋅鐵強(qiáng)化食材的推廣和應(yīng)用。

(二)本發(fā)明一種谷氨酰硫化物的芽苗菜鋅鐵強(qiáng)化方法具有很強(qiáng)的鋅強(qiáng)化作用：

①采用適宜綠豆芽生長的鋅濃度5μg/mL，強(qiáng)化培養(yǎng)綠豆芽時，使用本發(fā)明的方法添加大蒜提取物可以使胚根的鋅含量提高35.34％(從45.70μg/g鮮重提高到61.85μg/g鮮重)；添加γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸可以使胚軸的鋅含量提高83.44％(從26.14μg/g鮮重提高到47.95μg/g鮮重)；添加γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸可以使子葉的鋅含量提高46.99％(從17.96μg/g鮮重提高到26.40μg/g鮮重)；

②采用適宜紅豆芽生長的鋅濃度10μg/mL，強(qiáng)化培養(yǎng)紅豆芽時，使用本發(fā)明的方法添加大蒜提取物可以使胚根的鋅含量提高83.62％(從86.28μg/g鮮重提高到158.43μg/g鮮重)；胚軸的鋅含量提高19.56％(從48.68μg/g鮮重提高到58.20μg/g鮮重)；

③采用適宜黃豆芽生長的鋅濃度50μg/mL，強(qiáng)化培養(yǎng)黃豆芽時，使用本發(fā)明的方法添加大蒜提取物可以使胚根的鋅含量提高39.71％(從83.73μg/g鮮重提高到116.98μg/g鮮重)；胚軸的鋅含量提高98.70％(從27.83μg/g鮮重提高到55.30μg/g鮮重)；子葉的鋅含量提高126.79％(從19.93μg/g鮮重提高到45.20μg/g鮮重)；

④采用適宜玉米芽生長的鋅濃度10μg/mL，強(qiáng)化培養(yǎng)玉米芽時，使用本發(fā)明的方法添加γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸可以使胚根的鋅含量提高106.64％(從17.33μg/g鮮重提高到35.81μg/g鮮重)；添加γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸可以使胚軸的鋅含量提高98.01％(從13.07μg/g鮮重提高到25.88μg/g鮮重)；添加γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸可以使子葉的鋅含量提高86.90％(從11.83μg/g鮮重提高到22.11μg/g鮮重)；

⑤采用適宜大蒜芽生長的鋅濃度5μg/mL，強(qiáng)化培養(yǎng)大蒜芽時，使用本發(fā)明的方法添加γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸可以使根的鋅含量提高66.76％(從150.38μg/g鮮重提高到250.78μg/g鮮重)；添加γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸可以苗使的鋅含量提高46.46％(從18.08μg/g鮮重提高到26.48μg/g鮮重)；添加γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸可以瓣的鋅含量提高352.41％(從3.11μg/g鮮重提高到14.07μg/g鮮重)。

(三)本發(fā)明一種谷氨酰硫化物的芽苗菜鋅鐵強(qiáng)化方法具有很強(qiáng)的鐵強(qiáng)化作用：

①采用適宜綠豆芽生長的鐵濃度5μg/mL，強(qiáng)化培養(yǎng)綠豆芽時，使用本發(fā)明的方法添加γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸可以使胚根的鐵含量提高29.55％(從15.67μg/g鮮重提高到20.30μg/g鮮重)；

②采用適宜紅豆芽生長的鐵濃度10μg/mL，強(qiáng)化培養(yǎng)紅豆芽時，使用本發(fā)明的方法添加γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸可以使胚根的鐵含量提高1074.44％(從3.60μg/g鮮重提高到42.28μg/g鮮重)；添加蒜泥可以使胚軸的鐵含量提高292.45％(從7.95μg/g鮮重提高到31.20μg/g鮮重)；子葉的鐵含量提高113.70％(從3.65μg/g鮮重提高到7.80μg/g鮮重)

③采用適宜黃豆芽生長的鐵濃度10μg/mL，強(qiáng)化培養(yǎng)黃豆芽時，使用本發(fā)明的方法添加γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸可以使胚根的鐵含量提高149.48％(從4.85μg/g鮮重提高到12.10μg/g鮮重)；胚軸的鐵含量提高47.57％(從6.58μg/g鮮重提高到9.71μg/g鮮重)；

④采用適宜玉米芽生長的鐵濃度5μg/mL，強(qiáng)化培養(yǎng)玉米芽時，使用本發(fā)明的方法添加γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸可以使胚根的鐵含量提高194.93％(從4.34μg/g鮮重提高到12.80μg/g鮮重)；胚軸的鐵含量提高221.39％(從3.46μg/g鮮重提高到11.12μg/g鮮重)；子葉的鐵含量提高37.90％(從2.19μg/g鮮重提高到3.02μg/g鮮重)；

⑤采用適宜大蒜芽生長的鐵濃度2.5μg/mL，強(qiáng)化培養(yǎng)大蒜芽時，使用本發(fā)明的方法添加γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸可以使根的鐵含量提高50.32％(從36.47μg/g鮮重提高到54.82μg/g鮮重)；添加蒜泥可以使苗的鐵含量提高37.09％(從12.16μg/g鮮重提高到16.67μg/g鮮重)。

附圖說明

圖1：添加谷氨酰硫化物對鐵強(qiáng)化前后綠豆芽生長狀態(tài)對比圖。其中，a，蒸餾水；b，GSAC+5μg/mL Fe；c，GSAC+10μg/mL Fe；d，GSAC+50μg/mL Fe；e，5μg/mL Fe；f，10μg/mL Fe；g，50μg/mL Fe。

具體實施方式

1.大蒜提取物制備

鮮蒜1kg去皮洗凈切塊，加入1L乙醇，經(jīng)滅酶、勻漿、過濾后，將粗提液濃縮至300mL，調(diào)至pH 2.0，上Dowex 50×4-400柱(5.0cm×60cm)，依次用去離子水和氨水(1mol/L)淋洗，目標(biāo)組分濃縮，調(diào)至pH 7.0，上Dowex 2×8-200柱(5.0cm×40cm)，依次用去離子水和10％冰乙酸淋洗，含有大蒜提取物的組分凍干，主要為γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丙烯基-L-半胱氨酸等混合物，存于-80℃冰箱備用，進(jìn)一步制備液相分離。

2.富鋅鐵芽苗菜培育

將待發(fā)芽試材用蒸餾水清洗陰干，每組30g，在乙酸鋅溶液(0-100μg/mL，以純鋅計)或硫酸亞鐵溶液(0-50μg/mL，以純鐵計)中浸泡12h，期間以鋅鐵等摩爾添加γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸、大蒜提取物、蒜泥的一種或任意幾種的混合物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)。綠豆培養(yǎng)5d，其它7d。

3.鋅鐵含量測定

芽苗菜胚根(根)、胚軸(瓣)、子葉(苗)60℃干燥后磨粉并炭化，300℃預(yù)灰化1h，550℃灰化11h。0.5％硝酸將灰分定容至25mL，0.45μm膜過濾，火焰原子吸收分光光度計測定鋅鐵含量。

4.實驗結(jié)果

4.1鋅鐵濃度對芽苗菜中鋅鐵總含量的影響

表1鋅鐵濃度對芽苗菜鋅鐵總含量影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

隨著培養(yǎng)液中鋅鐵濃度的升高，各種芽苗菜中鋅鐵總量均出現(xiàn)增加的情況，并且添加谷氨酰硫化物后還會促進(jìn)芽苗的生長，以綠豆芽為例，如圖1a-d；但在不添加谷氨酰硫化物的條件下，當(dāng)鐵濃度超過10μg/mL多數(shù)芽苗會出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，導(dǎo)致萎蔫甚至枯死，如圖1f-g；而添加谷氨酰硫化物會減輕或減緩這一中毒現(xiàn)象，如圖1c-d；若鋅鐵濃度進(jìn)一步升高(＞50μg/mL)，具體情況請參考圖1：添加谷氨酰硫化物對鐵強(qiáng)化前后綠豆芽生長狀態(tài)對比圖。其中，a，蒸餾水；b，GSAC+5μg/mL Fe；c，GSAC+10μg/mL Fe；d，GSAC+50μg/mL Fe；e，5μg/mL Fe；f，10μg/mL Fe；g，50μg/mL Fe。

谷氨酰硫化物仍有助于芽苗菜對鋅鐵的富集，但過高濃度的鋅鐵會影響芽苗的生長，不利于其感官及商品價值。對于試驗中的豆芽、玉米芽和大蒜苗來說，由于自身性質(zhì)不同，它們耐受鋅的最高濃度也不同，根據(jù)其生長狀態(tài)可以看出，對于綠豆芽、紅豆芽和大蒜苗，低于50μg/mL的鋅溶液促進(jìn)芽的生長，但當(dāng)鋅濃度高于50μg/mL時，它們生長明顯受到抑制；而對于黃豆芽和玉米芽，0-100μg/mL濃度的鋅溶液對其生長均表現(xiàn)為促進(jìn)作用；根據(jù)其生長狀態(tài)可以看出，對于綠豆芽、紅豆芽、玉米芽、黃豆芽，低于50μg/mL的鐵溶液促進(jìn)芽的生長，但當(dāng)鐵濃度高于50μg/mL時，它們生長明顯受到抑制。

4.2鋅鐵濃度對芽苗菜各部位鋅鐵含量的影響

表2鋅鐵濃度對芽苗菜各部位鋅鐵含量的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

4.3谷氨酰硫化物對芽苗菜各部位鋅分布的影響

4.3.1不同硫化物對綠豆芽各部位中鋅的分布規(guī)律的影響

將待發(fā)芽綠豆試材用蒸餾水清洗陰干，在適宜綠豆生長的鋅濃度中，選取5μg/mL乙酸鋅溶液(以純鋅計)中浸泡12h，期間以鋅等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)5天。檢測鋅含量，結(jié)果見表3。

表3不同硫化物對綠豆芽各部位中鋅的分布規(guī)律的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

4.3.2不同硫化物對紅豆芽各部位中鋅分布的影響

將待發(fā)芽紅豆試材用蒸餾水清洗陰干，在適宜紅豆生長的鋅濃度中，選取10μg/mL乙酸鋅溶液(以純鋅計)中浸泡12h，期間以鋅等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)7天。檢測鋅含量，結(jié)果見表4。

表4不同硫化物對紅豆芽各部位中鋅的分布規(guī)律的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

4.3.3不同硫化物對黃豆芽各部位中鋅的分布的影響

將待發(fā)芽黃豆試材用蒸餾水清洗陰干，在適宜黃豆生長的鋅濃度中，選取50μg/mL乙酸鋅溶液(以純鋅計)中浸泡12h，期間以鋅等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)7天。檢測鋅含量，結(jié)果見表5。

表5不同硫化物對黃豆芽各部位中鋅的分布規(guī)律的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

4.3.4不同硫化物對玉米芽各部位中鋅的分布的影響

將待發(fā)芽玉米試材用蒸餾水清洗陰干，在適宜玉米生長的鋅濃度中，選取10μg/mL乙酸鋅溶液(以純鋅計)中浸泡12h，期間以鋅等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)7天。檢測鋅含量，結(jié)果見表6。

表6不同硫化物對玉米芽各部位中鋅的分布規(guī)律的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

4.3.5不同硫化物對大蒜苗各部位中鋅的分布的影響

將待發(fā)芽大蒜試材用蒸餾水清洗陰干，在適宜大蒜生長的鋅濃度中，選取5μg/mL乙酸鋅溶液(以純鋅計)中浸泡12h，期間以鋅等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)7天。檢測鋅含量，結(jié)果見表7。

表7不同硫化物對大蒜苗各部位中鋅的分布規(guī)律的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

4.4谷氨酰硫化物對芽苗菜各部位鐵分布的影響

4.4.1不同硫化物對綠豆芽各部位中鐵的分布的影響

將待發(fā)芽綠豆試材用蒸餾水清洗陰干，在適宜綠豆生長的鋅濃度中，選取5μg/mL硫酸亞鐵溶液(以純鐵計)中浸泡12h，期間以鐵等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)5天。檢測鐵含量，結(jié)果見表8。

表8不同硫化物對綠豆芽中鐵的分布規(guī)律的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

4.4.2不同硫化物對紅豆芽各部位中鐵的分布的影響

將待發(fā)芽紅豆試材用蒸餾水清洗陰干，在適宜紅豆生長的鋅濃度中，選取10μg/mL硫酸亞鐵溶液(以純鐵計)中浸泡12h，期間以鐵等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)7天。檢測鐵含量，結(jié)果見表9。

表9不同硫化物對紅豆芽中鐵的分布規(guī)律的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

4.4.3不同硫化物對黃豆芽各部位中鐵的分布的影響

將待發(fā)芽黃豆試材用蒸餾水清洗陰干，在適宜黃豆生長的鋅濃度中，選取10μg/mL硫酸亞鐵溶液(以純鐵計)中浸泡12h，期間以鐵等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)7天。檢測鐵含量，結(jié)果見表10。

表10不同硫化物對黃豆芽中鐵的分布規(guī)律的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

4.4.4不同硫化物對玉米芽各部位中鐵的分布的影響

將待發(fā)芽玉米試材用蒸餾水清洗陰干，在適宜玉米生長的鋅濃度中，選取5μg/mL硫酸亞鐵溶液(以純鐵計)中浸泡12h，期間以鐵等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)7天。檢測鐵含量，結(jié)果見表11。

表11不同硫化物對玉米芽中鐵的分布規(guī)律的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

4.4.5不同硫化物對大蒜苗各部位中鐵的分布的影響

將待發(fā)芽大蒜試材用蒸餾水清洗陰干，在適宜大蒜生長的鋅濃度中，選取2.5μg/mL硫酸亞鐵溶液(以純鐵計)中浸泡12h，期間以鐵等摩爾添加谷氨酰硫化物，之后將試材轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕培養(yǎng)盒中，23℃培養(yǎng)7天。檢測鐵含量，結(jié)果見表12。

表12不同硫化物對大蒜苗中鐵的分布規(guī)律的影響

a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝3，*和**表示顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01

應(yīng)當(dāng)理解，以上所描述的具體實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。由本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。