本發(fā)明屬于寄生雜草與寄主作物互作研究領(lǐng)域，具體涉及一種用于研究寄生雜草與寄主作物互作的共培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

在自然界中，種子植物絕大多數(shù)是自養(yǎng)的。但是少數(shù)種子植物由于缺少足夠葉綠素或因為根系或葉片退化而成為寄生性的，被稱為寄生植物。寄生植物從綠色植物中獲取所需的全部或大部分水分和養(yǎng)分，得以生存。寄生植物的種類很多，主要分為列當科、菟絲子科、桑寄生科、玄參科等等。寄生植物大多寄生在山野植物和樹木上，其中有些是很有價值的藥用植物；而少數(shù)寄生性種子植物寄生于農(nóng)作物上，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上造成較大的危害，被稱為寄生雜草，例如列當?shù)取?/p>

科學家們已經(jīng)做了大量工作來研究寄生雜草的化學、生物以及綜合防治方法。但是，寄生雜草常常會產(chǎn)生數(shù)以十萬計的種子，這些種子在土壤中能夠存活數(shù)十年，從而形成了種子庫，而徹底消滅種子庫幾乎不可能。大田中一旦出現(xiàn)寄生雜草，其危害將會逐年增強。2011年內(nèi)蒙古包頭市九原哈業(yè)胡同鎮(zhèn)明勝村、固陽縣、達茂旗等地區(qū)寄生雜草發(fā)生面積近1.33萬hm²，寄生率達10～35％，黃河沿岸發(fā)生較嚴重地塊寄生率達75％，而到2012年，這些地區(qū)的寄生率已達100％，寄主作物減產(chǎn)35％左右。因此，在大田中進行寄生雜草的研究會在當?shù)匦纬缮锶肭脂F(xiàn)象，引起寄主作物的大面積減產(chǎn)，甚至死亡。為了避免在研究過程中對當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境造成不良影響，同時最大程度地模擬寄生雜草與寄主作物的互作過程，需要一種在實驗室條件下用于研究寄生雜草與寄生作物相互作用，且可以防止寄生雜草擴散的共培養(yǎng)方法。

根寄生雜草的生活史主要包括以下幾個重要的階段：種子的預培養(yǎng)、種子的萌發(fā)、附著寄主根系并形成附著胞、穿透寄主根系組織、吸器形成并與寄主導管連接、瘤狀物形成、莖生長并出土、開花并形成種子。吸器形成之前為自養(yǎng)階段，吸器形成之后則轉(zhuǎn)變?yōu)榧纳A段。寄主作物對寄生雜草的抗性可以劃分為三個階段：寄生植物附著前期(Before attachment)，包括寄生雜草種子萌發(fā)和吸器誘導；寄生建立期(Establishment)，主要為寄生雜草與寄主作物建立物理聯(lián)系的過程；寄生建立后期(After establishment)。然而，由于根寄生雜草寄生在寄主作物的地下部分，難以對整個寄生過程進行實時觀察，不利于對根寄生雜草與寄主作物互作的研究，所以需要發(fā)明一種在無土條件下可以直觀顯示整個互作過程的共培養(yǎng)方法。

綜上所述，為了研究寄生雜草與寄主作物的相互作用，開發(fā)一種在實驗室條件下，能夠準確研究不同階段寄生雜草與寄主作物的相互作用情況，且可以避免寄生雜草擴散的共培養(yǎng)方法，顯得十分重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于現(xiàn)有的技術(shù)不利于對根寄生雜草與寄主作物互作的研究，本發(fā)明提供了一種用于研究寄生雜草與寄主作物互作的共培養(yǎng)方法，可以在實驗室條件下準確研究不同階段寄生雜草與寄主作物的相互作用情況，并且能夠避免寄生雜草的擴散。

一種用于研究寄生雜草與寄主作物互作的共培養(yǎng)方法，具體步驟如下：

步驟1，對寄生雜草種子和寄主作物種子進行表面消毒，對用于發(fā)芽和生長的基質(zhì)、玻璃托盤、培養(yǎng)皿、吸濕濾紙進行滅菌處理；

步驟2，將寄主作物種子播種于基質(zhì)中進行發(fā)芽、生長，將寄生雜草種子接種于吸濕濾紙上進行濕熱預培養(yǎng)；

步驟3，向濕熱預培養(yǎng)后的寄生雜草種子添加種子萌發(fā)刺激物，進行發(fā)芽；

步驟4，將播種后生長7～14天的寄主作物從基質(zhì)中取出，用無菌蒸餾水清洗干凈，同時取玻璃托盤用基質(zhì)鋪滿，覆蓋兩層濾紙，無菌蒸餾水濕潤，將寄主作物根系在濾紙上均勻鋪開；

步驟5，將用于寄生雜草種子發(fā)芽的濾紙取出，將表面附著寄生雜草的那一面覆蓋在寄主作物的根系上，托盤用錫紙包裹，垂直置于在無菌培養(yǎng)箱中，進行寄生雜草與寄主作物的共培養(yǎng)。

在步驟1中，所述的寄生雜草為根寄生雜草，包括列當和獨腳金。

在步驟1中，所述的寄主作物為向日葵、煙草、番茄、豌豆或油菜。

在步驟1中，由于寄生雜草種子一般體積較小、重量較輕，所以所述的寄生雜草種子進行表面消毒的具體步驟為：

步驟1-1，用茶葉袋紙包裝寄生雜草種子；

步驟1-2，將裝有寄生雜草種子的茶葉袋紙浸泡在酒精中，浸泡過程中時常攪動；

步驟1-3，將步驟1-2中酒精處理過的茶葉袋紙浸泡到消毒液中；浸泡過程中時常攪動；

步驟1-4，將寄生雜草種子用無菌蒸餾水漂洗6～10次，然后用無菌干燥濾紙吸干水分，放在超凈工作臺上晾干。

步驟1-1中利用茶葉袋紙包裝寄生雜草種子一方面可以防止種子漂浮于液面上，保證消毒徹底；另一方面也便于表面消毒后寄生雜草種子的收集。

在步驟1-2中，作為優(yōu)選，所述的酒精的濃度為50～80％，消毒時間為1～5min；

在步驟1-2中，進一步優(yōu)選，所述的酒精的濃度為70％，消毒時間為2min；

在步驟1-3中，作為優(yōu)選，所述的消毒液由1～5％的次氯酸鈉溶液和0.1～0.3％的Tween-20溶液等體積混合而成，消毒時間為5～12min。

在步驟1-3中，進一步優(yōu)選，所述的消毒液由2％的次氯酸鈉溶液和0.2％的Tween-20溶液等體積混合而成，消毒時間為10min。

利用消毒液進行表面消毒時，當消毒液顏色由黑色變?yōu)楹稚蛘咦厣珪r，預示寄生雜草種子表面附著的物質(zhì)被清除，消毒完成。

在步驟1中，所述的寄主作物種子進行表面消毒是將寄主作物種子浸泡在次氯酸鈉溶液中，作為優(yōu)選，次氯酸鈉溶液濃度為2～5％，消毒時間為20～30min，作為進一步優(yōu)選，次氯酸鈉溶液濃度為5％，消毒時間為25min。

在步驟1中，所述的滅菌處理是在溫度為105～126℃，壓力為0.1～0.2MPa下將這些實驗用品置于高壓滅菌鍋中進行處理，處理時間為15～25min。作為進一步優(yōu)選，溫度為121℃，壓力為0.15MPa，時間為20min。

由于某些真菌的存在會抑制寄生雜草種子的萌發(fā)，降低寄生的效率，為了避免這一狀況的發(fā)生，整個共培養(yǎng)過程都需要在無菌的條件下進行。

在步驟1中，所述的基質(zhì)可以為珍珠巖、蛭石或泥炭土；所述的基質(zhì)用于寄主作物種子的發(fā)芽生長。

在步驟1中，所述的基質(zhì)優(yōu)選為珍珠巖；與其他基質(zhì)相比，珍珠巖疏松透氣，便于寄主作物根系的生長，且在后續(xù)的清洗過程中比較方便。

在步驟1中，所述的吸濕濾紙可選用玻纖濾紙、其他普通的定量濾紙或定性濾紙，所述的吸濕濾紙用于寄生雜草種子的濕熱預培養(yǎng)。

在步驟1中，所述的吸濕濾紙優(yōu)選為玻纖濾紙；玻纖濾紙具有較好的各同向性，孔徑分布均勻，且具有較強的耐水性，使寄生雜草種子可以更好地吸附，且長久保持濕潤。

在步驟2中，寄主作物種子的萌發(fā)及生長條件：晝/夜溫度為15～25/10～20℃，光照時間12～16hr，光照強度200～400μmol m^-2s^-1，培養(yǎng)時間為5～10天；作為優(yōu)選，晝/夜溫度為20/15℃，光照時間14hr，光照強度300μmol m^-2s^-1，培養(yǎng)7天。

在步驟2中，將寄生雜草種子均勻分散在吸濕濾紙上，然后把吸濕濾紙放到培養(yǎng)皿中，用封口膜封閉，培養(yǎng)皿外部用錫箔紙包住以保持完全黑暗，進行預培養(yǎng)。

在步驟2中，寄生雜草種子濕熱預培養(yǎng)的條件：溫度為15～25℃，培養(yǎng)時間為3～14天；作為優(yōu)選，溫度為20℃，培養(yǎng)時間為7天。預培養(yǎng)溫度過低或者過高都會抑制種子的發(fā)芽，培養(yǎng)時間過短或者過長則會降低發(fā)芽率。

在步驟3中，所述的種子萌發(fā)刺激物可以為獨腳金內(nèi)酯、GR24、GR7或GR3；種子萌發(fā)刺激物的濃度為10^-6～10^-12M的；

在步驟3中，所述的種子萌發(fā)刺激物優(yōu)選為GR24，GR24的濃度為10^-6M。

獨腳金內(nèi)酯是植物中普遍存在的植物激素，但獨腳金內(nèi)酯在植物中含量極低，難以提取作為大規(guī)模應用。GR24、GR7、GR3均是人工合成的獨腳金內(nèi)酯類似物，其中GR24的活性最高，應用最多，便于獲取。

在步驟3中，所述發(fā)芽條件：溫度為15～25℃，培養(yǎng)時間為3～14天，作為優(yōu)選，溫度為20℃，培養(yǎng)時間為7天。

在步驟4中，所述的一定程度為播種后7～14天，優(yōu)選為10天，確保寄主作物具有足夠壯的根系來分泌化學信號物質(zhì)，供寄生雜草識別，從而啟動寄生過程。

在步驟5中，一般情況下，寄生雜草種子發(fā)芽后7天內(nèi)未能成功寄生到寄主根系上便會死亡；將表面附著寄生雜草的那一面濾紙覆蓋在寄主作物的根系上，使萌發(fā)的寄生雜草種子與寄主作物根系直接接觸，縮短了兩者的物理距離，從而可以提高寄生的效率。

在步驟5中，托盤用錫紙包裹，垂直置于在無菌培養(yǎng)箱中，使根系在黑暗條件下垂直生長，從而最大程度上模擬了土壤中寄生雜草與寄主作物相互作用的過程。

本發(fā)明以寄生雜草種子和寄主作物幼苗為實驗材料，在實驗室環(huán)境下進行無土培養(yǎng)，來模擬這兩種植物在田間的互作過程，將寄生雜草與寄主作物在土壤中不可視的互作過程實現(xiàn)了可視化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)對寄生雜草種子的預培養(yǎng)以及萌發(fā)刺激物的直接使用促進寄生雜草種子的萌發(fā)，同時將萌發(fā)的寄生雜草種子與寄主作物根系直接接觸，省去了在土壤中寄生雜草種子感受寄主作物根系分泌的化學信號物質(zhì)的過程，從而大大縮短了寄生雜草對寄主作物的識別過程，大幅減少研究所需的時間，同時也提高了寄生的效率；

(2)由于是在無土條件下進行的實驗，整個培養(yǎng)過程實現(xiàn)了可視化，能夠準確把握和觀察寄生雜草在寄生作物根系上寄生的各個階段，以便在確切的時間點針對不同階段的互作過程進行不同的研究；整個培養(yǎng)過程在實驗室條件下進行，可以確保在研究過程中防止寄生雜草的擴散。

附圖說明

圖1是向日葵列當與向日葵互作的不同時期：(A)向日葵列當種子萌發(fā)；(B)向日葵列當附著于向日葵根系；(C)瘤狀物發(fā)育；(D)幼苗的地下部分生長。

圖2是向日葵列當寄生后期的石蠟切片：(A)甲苯胺藍染色；(B)番紅-固綠染色；p：向日葵列當；ha，向日葵列當吸器；cc，向日葵中柱；ctx，向日葵皮層。

具體實施方式

為了更為具體地描述本發(fā)明，下面結(jié)合附圖及具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。

實施例1

該共培養(yǎng)方法用于向日葵列當(Orobanche cumana Wallr)與向日葵互作的不同時期觀察。

1)種子消毒：將向日葵列當種子用2層茶袋紙包好密封，然后浸泡在70％的酒精2min和含有0.2％Tween-20和2％次氯酸鈉消毒液中10min進行表面消毒，浸泡過程中經(jīng)常攪動，當消毒液顏色從黑色變?yōu)楹稚蜃厣珪r消毒完成；消毒后的種子用無菌蒸餾水漂洗10次；將向日葵種子在5％的次氯酸鈉溶液中表面消毒20min，然后用無菌蒸餾水漂洗5次。

2)寄生雜草種子預培養(yǎng)：在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中放入玻纖濾紙，并用5ml無菌蒸餾水潤濕，然后在濾紙上均勻撒上向日葵列當種子，封口膜(美國parafilm公司)封口，以防水分喪失，外部用錫箔紙包住以保持完全黑暗，最后將向日葵列當種子在20℃黑暗條件下預培養(yǎng)7天；

3)寄生雜草種子發(fā)芽：將預培養(yǎng)后列當種子所在的玻纖濾紙上的水分吸干，加入5ml 10^-6M的人工合成萌發(fā)刺激物GR24溶液潤濕玻纖濾紙；用封口膜將培養(yǎng)皿密封并包裹錫箔紙以保持完全黑暗，最后將培養(yǎng)皿置于20℃黑暗條件下進行發(fā)芽；

4)寄生作物種子萌發(fā)、生長：在發(fā)芽盒中裝滿滅過菌的珍珠巖，將向日葵種子置于珍珠巖上，再在上面覆蓋1cm左右的珍珠巖，用無菌蒸餾水澆透，將發(fā)芽盒培養(yǎng)置于晝/夜20/15℃,光照時間14hr,光照強度300μmol m^-2s^-1條件下培養(yǎng)7天。

觀察結(jié)果如圖1所示：向日葵列當種子萌發(fā)(圖1A)，7天以后，成功附著到了向日葵的根系上(圖1B)，進一步發(fā)育(種子萌發(fā)10天以后)后形成瘤狀物(圖1C)，15天以后，向日葵列當幼苗開始生長發(fā)育(圖1D)。

實施例2

該共培養(yǎng)方法用于向日葵列當寄生后期的石蠟切片的材料準備。

(1)材料準備

1)種子消毒：將向日葵列當種子用2層茶袋紙包好密封，然后浸泡在70％的酒精2min和含有0.2％Tween-20和2％次氯酸鈉消毒液中10min進行表面消毒，浸泡過程中經(jīng)常攪動，當消毒液顏色從黑色變?yōu)楹稚蜃厣珪r消毒完成；消毒后的種子用無菌蒸餾水漂洗6次；將向日葵種子在5％的次氯酸鈉溶液中表面消毒20min，然后用無菌蒸餾水漂洗3次。

2)寄生雜草種子預培養(yǎng)：在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中放入玻纖濾紙，并用5ml無菌蒸餾水潤濕，然后在濾紙上均勻撒上向日葵列當種子，封口膜(美國parafilm公司)封口，以防水分喪失，外部用錫箔紙包住以保持完全黑暗，最后將向日葵列當種子在20℃黑暗條件下預培養(yǎng)7天；

3)寄生雜草種子發(fā)芽：將預培養(yǎng)后列當種子所在的玻纖濾紙上的水分吸干，加入5ml10^-6M的人工合成萌發(fā)刺激物GR24溶液潤濕玻纖濾紙；用封口膜將培養(yǎng)皿密封并包裹錫箔紙以保持完全黑暗，最后將培養(yǎng)皿置于20℃黑暗條件下進行發(fā)芽；

4)寄生作物種子萌發(fā)、生長：在發(fā)芽盒中裝滿滅過菌的珍珠巖，將向日葵種子置于珍珠巖上，再在上面覆蓋1cm左右的珍珠巖，用無菌蒸餾水澆透，將發(fā)芽盒培養(yǎng)置于晝/夜20/15℃,光照時間14hr,光照強度300μmol m^-2s^-1條件下培養(yǎng)7天。

(2)石蠟切片

切取5mm左右被向日葵列當寄生著的向日葵根部，用FAA固定液固定24hr，然后用50～100％的酒精梯度脫水，二甲苯透明，在58℃石蠟中浸蠟然后包埋，切片后用二甲苯和酒精脫蠟，然后分別用甲苯胺藍和番紅-固綠染色。

觀察結(jié)果如圖2所示：向日葵列當突破向日葵皮層(ctx)，通過吸器(ha)與向日葵中柱(cc)成功連接，從而從向日葵根部攫取水分和養(yǎng)分，來供應自己生長所需的營養(yǎng)。

以上所述的具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果進行了詳細說明，應理解的是以上所述僅為本發(fā)明的最優(yōu)選實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補充和等同替換等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。