本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及外源24-表油菜素內(nèi)酯處理對(duì)重金屬鎘逆境脅迫下玉米幼苗生長(zhǎng)的緩解方法。

背景技術(shù)：

鎘（Cd）是植物非必需元素，具有較高的移動(dòng)性和毒性，對(duì)各種生物有機(jī)體具有潛在的危害，能引起人類(lèi)很多的疾病，被視為是對(duì)人類(lèi)最具威脅的重金屬之一。隨著采礦、冶煉和鎘處理工業(yè)的發(fā)展及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上含重金屬的有機(jī)肥、化肥等的大量使用，土壤鎘污染日益嚴(yán)重。研究表明，鎘在土壤中的積累對(duì)植物的危害很大，鎘進(jìn)入植物體后累積到一定含量會(huì)破壞植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能，造成植株氧化脅迫，葉綠素、糖及蛋白質(zhì)合成受阻、抑制光合及呼吸過(guò)程，降低酶的活性以及其他一些生理代謝物紊亂最終會(huì)導(dǎo)致生物量和產(chǎn)量的下降。

而且，鎘還可導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量下降，可以通過(guò)食物鏈危害人類(lèi)的健康。因此，研究植物鎘毒害的保護(hù)措施對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

玉米是在重金屬污染土壤上種植最廣泛的糧食作物之一，對(duì)玉米重金屬毒害的緩解方法現(xiàn)有關(guān)于一些激素緩解的報(bào)道，如水楊酸和一氧化氮，而關(guān)于油菜素內(nèi)酯緩解重金屬逆境脅迫的方法鮮有報(bào)道，在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用少見(jiàn)。油菜素內(nèi)酯是第一個(gè)被分離出的具有活性的油菜素甾族化合物（Brassinosteroids，BRs），是國(guó)際上公認(rèn)為活性最高的廣譜、無(wú)毒的植物生長(zhǎng)激素，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育十分重要。植物生理學(xué)家認(rèn)為，它能最大程度上激發(fā)植物內(nèi)在潛能，具有促進(jìn)作物生長(zhǎng)、提高含糖量、增加產(chǎn)量和增強(qiáng)對(duì)寒、旱、澇、鹽等多種逆境的抵抗能力,在生產(chǎn)上已廣泛應(yīng)用，人工合成的高活性油菜素內(nèi)酯類(lèi)似物為24-表油菜素內(nèi)酯(EBR)。因此探討外源EBR 對(duì)重金屬鎘脅迫下玉米幼苗生長(zhǎng)的影響，明確EBR誘導(dǎo)玉米幼苗抗重金屬鎘脅迫的可能生理機(jī)制是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種通過(guò)外源油菜素內(nèi)酯處理緩解玉米幼苗鎘逆境脅迫傷害的方法；該方法簡(jiǎn)便易行，不受季節(jié)限制，不僅可以縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，還可以提高玉米幼苗抗重金屬鎘的耐受力，能夠緩解重金屬鎘對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的脅迫傷害。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：一種外源油菜素內(nèi)酯處理緩解玉米幼苗鎘逆境脅迫傷害的方法，包括如下步驟：

1、材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備玉米種子；配置不同濃度的24-表油菜素內(nèi)酯水溶液和硝酸鎘溶液。

2、種子處理：選取色澤正常、籽粒飽滿、整齊一致的玉米種子，用0.5% 的次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗3～5次，用濾紙吸干附著水，得玉米消毒種子。

3、試材培育：將玉米消毒種子播種到墊有兩層濾紙的的發(fā)芽盒中，每發(fā)芽盒50粒，發(fā)芽盒長(zhǎng)×寬×高為13 cm×19 cm×12 cm；置于25℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽；玉米出苗后，選取生長(zhǎng)一致的三葉一心期的幼苗轉(zhuǎn)移到直徑8 cm×高為25 cm、內(nèi)裝蛭石的塑料花盆中，每盆植苗8株，于人工氣候室內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每2d用1/5 濃度的Hoaglands 營(yíng)養(yǎng)液澆灌，待第4片葉長(zhǎng)出后，選取長(zhǎng)勢(shì)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米幼苗120株進(jìn)行鎘脅迫試驗(yàn)。

4、試驗(yàn)處理：

4.1設(shè)系列Cd²⁺脅迫濃度梯度，進(jìn)行Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理玉米幼苗，培養(yǎng)10d后根據(jù)幼苗相對(duì)生長(zhǎng)速率，篩選出最佳Cd²⁺脅迫濃度；本發(fā)明采取0 mg?L^-1 Cd²⁺、25 mg?L^-1 Cd²⁺、50 mg?L^-1 Cd²⁺、100 mg?L^-1 Cd²⁺、150 mg?L^-1 Cd²⁺與200mg?L^-1 Cd²⁺ 六個(gè)Cd²⁺脅迫濃度。

4.2根據(jù)步驟4.1的試驗(yàn)結(jié)果，選取100mg?L^-1 Cd²⁺作為脅迫條件，油菜素內(nèi)酯溶液的濃度設(shè)定為五個(gè)濃度：0、0.004%、0.008%、0.012%與0.016%；油菜素內(nèi)酯對(duì)Cd²⁺毒害緩解效應(yīng)試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理溶液：

a.CK對(duì)照，Hoagland溶液；

b.含100 mg?L^-1 Cd²⁺的Hoagland溶液；

c.含100 mg?L^-1 Cd²⁺和0.004%油菜素內(nèi)酯的Hoagland溶液；

d.含100 mg?L^-1 Cd²⁺和0.008%的油菜素內(nèi)酯Hoagland溶液；

e.含100 mg?L^-1 Cd²⁺和0.012%的油菜素內(nèi)酯Hoagland溶液；

f.含100 mg?L^-1 Cd²⁺和0.016%的油菜素內(nèi)酯Hoagland溶液；

將步驟3所得玉米幼苗每盆留5株，每個(gè)處理4盆，隔日向種植了玉米幼苗的塑料花盆里澆灌相應(yīng)的6個(gè)處理溶液，澆灌至花盆底部略有處理液滲出；處理7d后將玉米幼苗進(jìn)入步驟5。

5、各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定：將步驟4所得玉米幼苗用去離子水沖洗干凈，測(cè)量株高、根長(zhǎng)與植株鮮重后，置于烘箱中105℃殺青30min，再置于80℃烘箱中烘干至恒重，測(cè)量植株干重；取玉米幼苗第二片功能葉進(jìn)行葉片相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量 、超氧化物歧化酶（POD）、過(guò)氧化物酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量與葉綠素含量的測(cè)定。

6、結(jié)果分析與最適EBR 濃度篩選：對(duì)步驟5測(cè)得的鎘脅迫處理幼苗的每個(gè)樣品中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，采用Microsoft Excel 2003 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析SPSS16.0 進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD) 表示，采用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，對(duì)各處理進(jìn)行顯著性差異分析；根據(jù)測(cè)定的相關(guān)指標(biāo)篩選最佳EBR濃度，并分析EBR對(duì)重金屬鎘脅迫下玉米幼苗生長(zhǎng)的影響。

在上述脅迫處理中，步驟3發(fā)芽盒用酒精消毒，濾紙進(jìn)行高壓滅菌后使用；為了得到更好的脅迫效果，種子經(jīng)步驟2消毒后，應(yīng)立即進(jìn)入步驟3。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道：步驟4.1中的Cd²⁺脅迫濃度梯度的設(shè)置，可以自行設(shè)計(jì)調(diào)整，為了清楚地表述本發(fā)明，步驟4.1寫(xiě)明了Cd²⁺脅迫濃度梯度；步驟4.2中的EBR濃度可隨處理中鎘濃度的變化做適當(dāng)調(diào)整，也可隨玉米品種的變化調(diào)整，為了清楚地表述本發(fā)明，步驟4.2中寫(xiě)明了EBR溶液的不同濃度。

本發(fā)明通過(guò)探討外源油菜素內(nèi)酯對(duì)重金屬鎘脅迫下玉米幼苗生長(zhǎng)的影響，反映出EBR對(duì)逆境下幼苗生長(zhǎng)的脅迫傷害具有緩解作用。該方法簡(jiǎn)便易行，不受季節(jié)限制，不僅可以縮短試驗(yàn)時(shí)間，還可以提高玉米幼苗抗重金屬鎘的耐受力，能夠緩解重金屬鎘對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的脅迫傷害。

本發(fā)明主要通過(guò)設(shè)計(jì)多個(gè)EBR 濃度，進(jìn)行重金屬鎘脅迫下EBR對(duì)玉米幼苗的POD、SOD、CAT、MDA、相對(duì)電導(dǎo)率等指標(biāo)的測(cè)定，探討外源EBR對(duì)重金屬鎘脅迫下玉米幼苗生長(zhǎng)生理生化特性的影響，明確EBR誘導(dǎo)玉米幼苗抗重金屬鎘可能生理機(jī)制，對(duì)緩解逆境對(duì)植株的傷害，具有很高的應(yīng)用價(jià)值，本發(fā)明表明采用外源物EBR 處理有望成為實(shí)踐中改善玉米在重金屬鎘脅迫下耐性的好方法，應(yīng)用潛力很大。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明下述實(shí)施例中所用的方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用器材、試劑均為試劑公司購(gòu)買(mǎi)的常規(guī)試劑、器材。

實(shí)驗(yàn)例，24-表油菜素內(nèi)酯處理對(duì)重金屬鎘脅迫下最適EBR濃度的篩選方法，按以下步驟進(jìn)行：

1、材料準(zhǔn)備：玉米雜交種“鄭單958”種子，24-表油菜素類(lèi)內(nèi)酯和硝酸鎘溶液配置。

2、種子處理：選取色澤正常、籽粒飽滿、整齊一致的玉米種子，玉米種子用0.5% 的次氯酸鈉消毒10 min，用蒸餾水沖洗4 次，用無(wú)菌濾紙吸干附著水，得玉米消毒種子。

3、試材培育：將處理后的玉米種子播種到墊有兩層濾紙的直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，置于25℃培養(yǎng)箱中暗發(fā)芽。玉米出苗后，選取生長(zhǎng)一致的三葉一心期的幼苗轉(zhuǎn)移到塑料花盆中，每盆植苗8株，于人工氣候室內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每2d用1/5 濃度的Hoaglands 營(yíng)養(yǎng)液澆灌，待第4片葉長(zhǎng)出后，選取長(zhǎng)勢(shì)良好和長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米幼苗進(jìn)行鎘脅迫試驗(yàn)。

4、試驗(yàn)處理：

4.1試驗(yàn)首先設(shè)系列Cd²⁺(0、25、50、100、150、200mg?L^-1)脅迫濃度梯度，進(jìn)行Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理玉米幼苗，培養(yǎng)10d后根據(jù)幼苗相對(duì)生長(zhǎng)速率，篩選出最佳Cd²⁺脅迫濃度；本試驗(yàn)例采取0 mg?L^-1 Cd²⁺、25 mg?L^-1 Cd²⁺、50 mg?L^-1 Cd²⁺、100 mg?L^-1 Cd²⁺、150 mg?L^-1 Cd²⁺與200mg?L^-1 Cd²⁺ 六個(gè)Cd²⁺脅迫濃度。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知：用不同濃度（25、50、100、150、200 mg·L^-1）的Cd處理玉米幼苗，其株高、地上部和地下部鮮重和干重均呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照相比，當(dāng)Cd濃度為100 mg·L^-1，株高、地上鮮重、地上干重、地下鮮重和地下干重均顯著下降，分別下降了54.75%、57.52%、30.0%、47.92%和31.43%。

表中：不同小寫(xiě)字母代表不同處理間在0. 05水平差異顯著，下同。

4.2 根據(jù)步驟1的試驗(yàn)結(jié)果可以得知：當(dāng)Cd濃度為100 mg·L^-1，玉米幼苗株高、地上鮮重、地上干重、地下鮮重和地下干重均明顯下降，與對(duì)照相比，均達(dá)到顯著水平；

故選擇100 mg·L^-1的Cd²⁺脅迫濃度，油菜素內(nèi)酯溶液的濃度設(shè)定為5個(gè)：0、0.004%、0.008%、0.012%與0.016%；油菜素內(nèi)酯對(duì)Cd²⁺毒害緩解效應(yīng)試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理溶液：

（1）CK對(duì)照，Hoagland溶液；

（2）含100 mg?L^-1 Cd²⁺的Hoagland溶液；

（3）含100 mg?L^-1 Cd²⁺和0.004%油菜素內(nèi)酯的Hoagland溶液；

（4）含100 mg?L^-1 Cd²⁺和0.008%的油菜素內(nèi)酯Hoagland溶液；

（5）含100 mg?L^-1 Cd²⁺和0.012%的油菜素內(nèi)酯Hoagland溶液；

（6）含100 mg?L^-1 Cd²⁺和0.016%的油菜素內(nèi)酯Hoagland溶液。

將步驟3所得玉米幼苗每盆留5株，每個(gè)處理溶液4盆，隔日向種植了玉米幼苗的塑料花盆里澆灌相應(yīng)的6個(gè)處理溶液，澆灌至花盆底部略有處理液滲出；處理7d后將玉米幼苗進(jìn)入步驟5。

為了保證處理期間培養(yǎng)液中的離子濃度相對(duì)恒定，每次處理時(shí)用相當(dāng)于盆中蛭石最大持水量2 倍的處理液澆灌塑料花盆中蛭石，讓多余的溶液從滲水孔流出，減少試驗(yàn)處理誤差。

5.各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定：將步驟4中所得的處理玉米幼苗用去離子水沖洗干凈，測(cè)量株高、根長(zhǎng)、植株鮮重后，置烘箱中105℃殺青30min，再于80℃烘箱中烘干至恒重，測(cè)量植株干重；取玉米幼苗第二片功能葉進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，各項(xiàng)指標(biāo)包括葉片相對(duì)電導(dǎo)率、MDA；POD、SOD、CAT活性；可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和葉綠素含量。測(cè)定結(jié)果如下：

（1）油菜素內(nèi)酯處理對(duì)鎘脅迫下玉米幼苗生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表2；由表2可以得出：與對(duì)照相比，單獨(dú)鎘脅迫處理后幼苗生物量均有顯著性下降，添加不同濃度的油菜素內(nèi)酯后，各處理均較單獨(dú)鎘脅迫處理有所上升，表明油菜素內(nèi)酯可以緩解鎘毒害對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響，由不同處理顯著性差異看來(lái)，0.012%為油菜素內(nèi)酯緩解的最適濃度。

（2）油菜素內(nèi)酯處理對(duì)鎘脅迫下玉米幼苗生理特性的影響見(jiàn)表3；由表3 可以看出：重金屬鎘單獨(dú)處理時(shí)，MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率均顯著高于未經(jīng)鎘脅迫處理的(CK)；POD、CAT、SOD活性；脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和葉綠素含量均顯著低于未經(jīng)鎘脅迫處理的(CK)，Cd²⁺+EBR可以降低MDA 和相對(duì)電導(dǎo)率的含量，且可以進(jìn)一步提高POD、CAT、SOD活性；增加脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和葉綠素含量，其中以0.012% EBR處理效果最好，與重金屬鎘單獨(dú)脅迫處理相比，MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率降低了29.89%和39.39%；POD、CAT和SOD的活性分別增加了9.43%、13.33 %和67.21%，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和葉綠素含量分別增加了79.45%、127.27%、86.78和49.37 %。

6.結(jié)果分析與最適EBR 濃度篩選：對(duì)步驟5測(cè)得的鎘脅迫處理幼苗的每個(gè)樣品中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，采用Microsoft Excel 2003 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析SPSS16.0 進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD) 表示，采用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，對(duì)各處理進(jìn)行顯著性差異分析。

從以上實(shí)例可以看出，外源24-表油菜素內(nèi)酯可有效地促進(jìn)重金屬鎘脅迫下玉米幼苗的生長(zhǎng)，增加玉米幼苗生物量的積累，提高重金屬鎘脅迫下玉米葉片中的抗氧化酶活性，降低其體內(nèi)活性氧含量，減少脅迫下電解質(zhì)外滲，從而減輕重金屬鎘脅迫對(duì)植株的傷害。采用外源物EBR處理在實(shí)踐中易操作，有實(shí)效，有望成為實(shí)踐中有效提高玉米種子發(fā)芽率，并改善玉米在重金屬鎘脅迫下耐性的好方法，應(yīng)用潛力很大。