調(diào)控4對(duì)棉花DELLA蛋白基因GhGAIs表達(dá)的植物表達(dá)載體及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及調(diào)控4對(duì)棉花DELLA蛋白基因 GhGAIs表達(dá)的植物表達(dá)載體及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花是最重要的天然纖維作物，我國(guó)是世界上最大的產(chǎn)棉國(guó)和紡織品出口國(guó)，棉 花在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。
[0003] 棉花纖維是由棉花外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)起始、伸長(zhǎng)、次生壁合成和成熟四個(gè)時(shí)期發(fā) 育而成的單細(xì)胞纖維。植物激素對(duì)棉花纖維的發(fā)育起著非常重要的調(diào)控作用。在棉花纖維 和胚珠中上調(diào)赤霉素（GA)、生長(zhǎng)素（IAA)和油菜素內(nèi)酯（BR)合成酶基因，提高胚珠和纖維 中相關(guān)激素的水平，可以促進(jìn)棉花纖維的起始或生長(zhǎng)、定向改良棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)性狀， 表明植物激素對(duì)棉花纖維的發(fā)育起著非常重要的調(diào)控作用。關(guān)于靶標(biāo)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元 件從而調(diào)控植物激素在纖維發(fā)育中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究目前還很少。
[0004] DELLA蛋白是GA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中一個(gè)關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子。GA通過(guò)誘導(dǎo)DELLA蛋 白的泛素化和降解，解除DELLA蛋白的抑制，促進(jìn)GA反應(yīng)基因的表達(dá)。此外，多種激素和 環(huán)境信號(hào)都能直接或間接調(diào)控DELLA蛋白的降解，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)環(huán)境的反 應(yīng)。迄今為止還未見通過(guò)調(diào)控棉花DELLA基因來(lái)改良棉花纖維的報(bào)道。根據(jù)棉花基因組 測(cè)序的結(jié)果，棉花中DELLA蛋白由1個(gè)基因家族編碼，單個(gè)棉花基因組含有4個(gè)編碼基因， 而異源四倍體的陸地棉中含有4對(duì)編碼基因，分別命名為GhGAIlA和GhGAI ID、GhGAI2A和 GhGAI2D、GhGAI3A和GhGAI3D、GhGAI4A和GhGAMD (表1)。每對(duì)基因?yàn)椴煌瑏喕蚪M（A和 D亞基因組）上的直系同源基因，相同核苷酸序列>95%。前人通過(guò)克隆及異源表達(dá)等手段 分析了部分棉花DELLA蛋白基因的功能，但目前還沒(méi)有棉花DELLA蛋白基因在棉花纖維發(fā) 育中功能的報(bào)道，也沒(méi)有通過(guò)調(diào)控DELLA蛋白基因改良棉花纖維產(chǎn)量品質(zhì)的報(bào)道。
[0005] 表1棉花DELLA蛋白基因及其在已測(cè)序的基因組中的編碼序列
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是為提高棉花產(chǎn)量提供一種新選擇。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是調(diào)控4對(duì)棉花DELLA基因 GhGAIs表達(dá)的植物表達(dá)載和 GhGAI3D、GhGAMA 和 GhGAI4D。
[0009] 具體的，所述載體包含串聯(lián)了革El向所述4對(duì)基因的RNAi元件，該RNAi元件具有如 SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列。
[0010] 具體的，調(diào)控所述RNAi元件的啟動(dòng)子為纖維次生壁合成期特異性啟動(dòng)子。
[0011] 優(yōu)選的，所述的啟動(dòng)子為棉花FbLate-2基因啟動(dòng)子（pFbl2)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 6 所示。
[0012] 具體的，所述的植物表達(dá)載體具有如SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列。
[0013] 本發(fā)明還提供了含有所述載體的宿主細(xì)胞。
[0014] 具體的，所述的宿主細(xì)胞為根癌農(nóng)桿菌。
[0015] 本發(fā)明還提高棉花纖維產(chǎn)量的物質(zhì)，其主要活性成分為所述植物表達(dá)載體，或者 含有所述植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述的載體在提高棉花纖維產(chǎn)量中的用途。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述的宿主細(xì)胞在提高棉花纖維產(chǎn)量中的用途。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過(guò)研究和分析，證明DELLA蛋白在棉花纖維生長(zhǎng)發(fā) 育中具有重要作用。并通過(guò)在棉花纖維次生壁合成時(shí)期全面下調(diào)8個(gè)DELLA基因 GhGAIs的 表達(dá)，獲得了衣分（棉花纖維占種子重量的百分比）和衣指（百粒棉籽上纖維的重量）明 顯提高的轉(zhuǎn)基因棉花。試驗(yàn)結(jié)果證明，經(jīng)本發(fā)明載體對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行調(diào)控后，改良的棉花衣 分和衣指明顯提高，纖維產(chǎn)量明顯增加。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便易行，效果顯著，有產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì) 效益的潛力。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖I =GAIsRNAi的表達(dá)載體T-DNA區(qū)的基因結(jié)構(gòu)圖
[0020] CaMV35S-P，花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；CaMV35S-T，花椰菜花葉病毒35S終止子； D1-D4,棉花GAI1-4基因的DELLA和VHYNP結(jié)構(gòu)域的編碼序列，兩個(gè)反向重復(fù)的D1-D4串聯(lián) 序列及間隔序列構(gòu)成GAIsRNAi元件；GUS:NPTII，β -葡萄糖酸苷酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶融 合基因；LB，T-DNA左邊界；Nos-T，農(nóng)桿菌冠癭堿合成酶基因終止子；pFbl2,棉花FbLate-2 基因啟動(dòng)子；RB, T-DNA右邊界。
[0021] 圖2 :P5-pFbl2-GAIRNAi表達(dá)載體構(gòu)建流程
[0022] 具體實(shí)驗(yàn)方法見實(shí)施例2。CaMV35S_P，花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；CaMV35S_T， 花椰菜花葉病毒355終止子；64^^〇^，4個(gè)棉花641片段的串聯(lián)序列；《^ :即111，0-葡 萄糖酸苷酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶融合基因；LB，T-DNA左邊界；Nos-T，農(nóng)桿菌冠癭堿合成酶 基因終止子；pFbl2,棉花FbLate-2基因啟動(dòng)子；RB, T-DNA右邊界；REP origin，質(zhì)粒復(fù)制原 點(diǎn)。相關(guān)酶切位點(diǎn)及位置在各個(gè)載體上標(biāo)出。
[0023] 圖3 :4對(duì)棉花DELLA蛋白基因 和GhGAI3D、GhGAMA和GhGAMD)在GAIsRNAi轉(zhuǎn)基因棉花開花后18天纖維中的表達(dá)水平
[0024] WT代表非轉(zhuǎn)基因棉花。FGi為GAIsRNAi轉(zhuǎn)基因棉花，其后的數(shù)字顯示不同的轉(zhuǎn)化 子和純合株系。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下述實(shí)施例中所用到的常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作：
[0026] I. DNA 的提取
[0027] 基因組DNA采用植物基因組DNA快速提取試劑盒（Aidlab)提取，詳細(xì)步驟見說(shuō)明 書。
[0028] 2. RNA 的提取
[0029] RNA采用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（Aidlab)提取，詳細(xì)步驟見說(shuō)明書。
[0030] 3. DNA片段的PCR擴(kuò)增
[0031] 擴(kuò)增體系如下：10XEx PCR buffer(Mg2+free)2. 5 yL，2. 5mmol/L dNTPs 2 yL， 25mmol/LMgCl22μL，引物l(5μmol/L)lμL，引物2(5μmol/L)lμL，ExTaqDNA聚合酶 1U，基因組DNA約60ng，加入ddH 20至25 μ L。
[0032] 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C，5min ;94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，I. 5min，35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin。
[0033] 4. DNA片段的回收、連接和克隆
[0034] 使用BioFlux膠回收試劑盒回收DNA片段。使用T4 DNA Iigase進(jìn)行DNA片段 連接。回收的片段與PUCm-T (上海生工）載體建立如下連接體系：IOX T4 DNA連接緩沖液 1 μ L，載體DNA片段1 μ L，外源連接產(chǎn)物DNA片段1 μ L，T4 DNA連接酶1 μ L，用雙蒸水補(bǔ)足 體積至10 μ L。載體DNA片段與外源連接產(chǎn)物DNA片段摩爾比為1 : 3,16°C連接12h。之 后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。獲得的抗性克隆經(jīng)液體培養(yǎng)過(guò)夜，用BioFlux質(zhì)粒提取 試劑盒提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證后，在Invitrogen公司測(cè)序。
[0035] 5.⑶S組織化學(xué)染色
[0036] 由于實(shí)驗(yàn)室采用的表達(dá)載體具有⑶S報(bào)告基因，一般用⑶S組織化學(xué)染色檢測(cè) 跟蹤轉(zhuǎn)基因。具體方法：取少量轉(zhuǎn)基因棉花葉片（有傷口）置于96孔板中，加入GUS染 液[O.lmol/L K3Fe(CN)6,0.1mol/L K4Fe(CN)6,0.01mol/L Na2EDTA，500mg/L X-Gluc，l % Triton X-100 (v/v)，0. 14mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7. 0)]，在37°C恒溫條件下放置2h左右， 充分染液后再用75%乙醇脫色。植株葉片可被⑶S染液染成特異藍(lán)色的植株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng) 性。
[0037] 實(shí)施例1調(diào)控棉花DELLA基因的RNAi元件GAIsRNAi的獲得
[0038] DELLA蛋白屬于一個(gè)大的GARS蛋白家族，除在C端含有家族共有的GARS結(jié)構(gòu)域 外，在N端具有DELLA蛋白特有約100個(gè)氨基酸的DELLA和VHYNP結(jié)構(gòu)域。如前所述，陸地 棉含有4對(duì)DELLA蛋白的直系同源基因，成對(duì)共生同源基因的核苷酸序列相似性很高（相 同核苷酸>95 % )，而非直系同源基因的核苷酸序列相似性較低。為全面調(diào)控棉花DELLA蛋 白基因的表達(dá)，我們根據(jù)4對(duì)直系同源的DELLA蛋白基因，選取了編碼4種DELLA蛋白的 DELLA和VHYNP結(jié)構(gòu)域的D基因組序列（SEQ ID No. 1~4)。通過(guò)PCR方法將4個(gè)序列串 聯(lián)，并最終擴(kuò)增成含間隔序列的反向重復(fù)序列，即GAIsRNAi元件（SEQ ID No. No. 5)。該序 列在棉花中轉(zhuǎn)錄后，可以形成靶定4對(duì)DELLA蛋白基因的雙鏈RNA序列，從而通過(guò)RNAi機(jī) 制下調(diào)這些基因的表達(dá)水平。同時(shí)，DELLA和VHYNP結(jié)構(gòu)域的編碼序列是DELLA蛋白基因 特有的，GAIsR