一種油菜素內(nèi)酯的快速高效檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物有效成分檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葡萄果實(shí)中油菜素內(nèi)酯的快速高效檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids，BRs)又稱蕓苔素內(nèi)酯、蕓苔素甾醇類(lèi)激素。天然油菜素內(nèi)酯是一種最新植物內(nèi)源激素，1970年，由美國(guó)學(xué)者J.W.米切爾首次從油菜花粉中分離出，主要有效成分為具類(lèi)固醇結(jié)構(gòu)的BR。其生理活性大大超過(guò)現(xiàn)有的五種激素，是國(guó)際上公認(rèn)為活性最高的高效、廣譜、無(wú)毒的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，已被譽(yù)為第六激素。油菜素內(nèi)酯廣泛存在于被子植物、裸子植物和某些低等植物中，從在植物體內(nèi)的分布來(lái)看存在于根、莖、葉、花、粉、雌蕊、果實(shí)和種子中，其中花粉中含有較豐富的蕓苔素內(nèi)酯。油菜素內(nèi)酯促進(jìn)植物伸長(zhǎng)的效果非常顯著，其作用濃度要比生長(zhǎng)素低好幾個(gè)數(shù)量級(jí)。其作用機(jī)理與生長(zhǎng)素相似，YoPP等(1981)發(fā)現(xiàn)油菜素內(nèi)酯與生長(zhǎng)素有正協(xié)同作用。通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞膜系統(tǒng)質(zhì)子栗對(duì)氫離子的栗出，導(dǎo)致自由空間酸化，使細(xì)胞壁松弛從而促進(jìn)生長(zhǎng)。同時(shí)，油菜素內(nèi)酯還能抑制生長(zhǎng)素氧化酶的活性，提高植物內(nèi)源生長(zhǎng)素的含量，所以，當(dāng)油菜素內(nèi)酯與生長(zhǎng)素同時(shí)使用時(shí)，有明顯的加成效果。
[0003]目前，測(cè)定油菜素內(nèi)酯的檢測(cè)方法多為高效液相色譜紫外檢測(cè)、氣相色譜法、液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層色譜等，國(guó)內(nèi)有關(guān)油菜素內(nèi)酯檢測(cè)方法的專(zhuān)利主要有:中國(guó)專(zhuān)利CN201210486507.3公開(kāi)了一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素留醇的定量檢測(cè)方法，在提取過(guò)程中加入同位素內(nèi)標(biāo)2H3油菜素內(nèi)酯和2H3油菜素甾酮，除水后樣品溶液過(guò)活化后的雙層固相萃取小柱，解吸后收集上樣流出液和解吸液，以除去樣品中的溶劑，以乙醚溶解樣品，定容后的樣品進(jìn)入高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜分析；中國(guó)專(zhuān)利201310131422.8公開(kāi)了一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理方法，在提取過(guò)程中加入同位素內(nèi)標(biāo)2H3油菜素內(nèi)酯和2H3油菜素留酮，除水后用活化后的硼親和材料萃取樣品溶液，清洗硼親和材料，再以解吸液解吸硼親和材料上的油菜素留醇，收集解吸液，去除解吸液中的有機(jī)溶劑，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理。提取所用的溶劑為甲醇、乙腈、異丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸中的一種或幾種。除水所用材料是采用由碳材料、親水材料、疏水材料通過(guò)不同方式組合以化學(xué)或物理方式構(gòu)建的硅膠顆粒、磁性材料、無(wú)定型材料、凝膠、填充柱或整體柱。硼親和材料為含有硼酸基團(tuán)的硅膠顆粒、磁性材料、無(wú)定型材料、凝膠、填充柱或整體柱中的一種。檢測(cè)油菜素留醇的儀器包括:液相色譜-光學(xué)檢測(cè)器、液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用、毛細(xì)管電泳-光學(xué)檢測(cè)器聯(lián)用，或者毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜儀聯(lián)用。但上述方法及專(zhuān)利均未涉及有關(guān)葡萄果實(shí)中油菜素內(nèi)酯的測(cè)定方法。
[0004]因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種快速有效的、基線穩(wěn)定、分離良好的葡萄果實(shí)中油菜素內(nèi)酯的HPLC方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的狀況，提供了一種快速有效的、基線穩(wěn)定、分離良好的葡萄果實(shí)中油菜素內(nèi)酯的檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
[0007]—種油菜素內(nèi)酯的快速高效檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟:
[0008](I)以新鮮的葡萄果實(shí)為材料，用液氮快速研磨成粉末狀，以葡萄果實(shí)的重量為計(jì)算基準(zhǔn)按4-5mL/g的量比加入80-95%甲醇作為浸提液，并同時(shí)加入同位素內(nèi)標(biāo)2H3油菜素內(nèi)酯3-5ng/g和2H3油菜素留酮3-5ng/g，低溫超聲提取30_60min，接著4°C冰箱靜置2_5h，然后過(guò)濾，取濾渣以葡萄果實(shí)的重量為計(jì)算基準(zhǔn)按0.3-0.5mL/g的量比加80-95%甲醇浸提液，浸提l_2h，然后過(guò)濾，合并兩次過(guò)濾的濾液；
[0009](2)除水:對(duì)步驟(I)得到的濾液進(jìn)行物理吸附除水，得到上柱液；
[0010](3)上柱液過(guò)C18柱，進(jìn)行樣品吸附，使用40mmol/L的醋酸銨緩沖液(pH值6.5)作為洗脫液洗脫得到吸附液，吸附液過(guò)sephadex LH-20柱進(jìn)行除雜，使用甲醇作為洗脫液得到洗脫產(chǎn)物后，再過(guò)silica柱，甲醇洗脫得到富集的樣品液；
[0011 ] (4)按0.5mg/mL的量比在樣品液中加入苯硼酸，于60-80 °C水浴衍生反應(yīng)20-40min，冷卻后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干；
[0012](5)使用乙腈進(jìn)行復(fù)溶，得到濃度為0.5-5 μ g/mL的上樣液，供液相色譜測(cè)定；
[0013](6)液相色譜測(cè)定:選用乙腈和水作為流動(dòng)相，乙腈和水的體積比為(6: 4)?(9: 1)，選擇的激發(fā)波長(zhǎng)為280nm、發(fā)射波長(zhǎng)為700nm或激發(fā)波長(zhǎng)為310nm、發(fā)射波長(zhǎng)為375nm，選擇的檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器，洗脫方式為等度洗脫，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液圖譜收集目的峰。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0015](I)優(yōu)化了目標(biāo)產(chǎn)物的提取工藝，增加了目標(biāo)產(chǎn)物的提取率、縮短了目標(biāo)產(chǎn)物的提取時(shí)間；
[0016](2)優(yōu)化了檢測(cè)方法，使產(chǎn)峰的理論塔板數(shù)大大提高，且出峰時(shí)間也大大縮短，與雜質(zhì)峰分離的很好，試劑用量和人力得到了大大的節(jié)省，真正達(dá)到了 HPLC快速、高效的、準(zhǔn)確的目的。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1所示的是本發(fā)明實(shí)施例3中的HPLC圖譜，其中A標(biāo)樣圖、B樣品圖；
[0018]圖2所示的是本發(fā)明實(shí)施例4中的HPLC圖譜，其中A標(biāo)樣圖、B樣品圖；
[0019]圖3所示的是本發(fā)明實(shí)施例5中的HPLC圖譜，其中A標(biāo)樣圖、B樣品圖；
[0020]圖4所示的是本發(fā)明實(shí)施例6中的HPLC圖譜，其中A標(biāo)樣圖、B樣品圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說(shuō)明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。下列實(shí)例中未標(biāo)明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照規(guī)定條件或者按照制造廠商所建議的條件。
[0022]實(shí)施例1:
[0023]準(zhǔn)確稱取10.0Og葡萄果實(shí)，液氮迅速研磨至粉末狀，加入40ml 80%甲醇后加同位素內(nèi)標(biāo)2H3油菜素內(nèi)酯40ng和2H3油菜素甾酮40ng，低溫下超聲萃取60min后于4°C冰箱靜置2h，過(guò)濾后濾渣重新加4ml甲醇(80% )浸提液浸提lh，過(guò)濾，合并提取液。利用氮吹除去浸提液中的水分，上柱液過(guò)C18柱，進(jìn)行樣品吸附，使用40mmol/L的醋酸銨緩沖液(pH值6.5)作為洗脫液洗脫得到吸附液，吸附液過(guò)s印hadex LH-20柱進(jìn)行除雜，使用甲醇作為洗