本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種沼澤紅假單胞菌生防菌劑在防控稻瘟病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

稻瘟病是水稻的重要病害之一，該病分布廣泛，全世界約有80余個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生此病，我國(guó)南北稻區(qū)也均有發(fā)生。病害流行地區(qū)，一般減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)40%～50%，特別重的田塊甚至顆粒無(wú)收。對(duì)于稻瘟病的防治，目前還是以化學(xué)防治為主，但由于抗藥性增強(qiáng)及發(fā)現(xiàn)不及時(shí)，農(nóng)藥施用極不科學(xué)合理，農(nóng)藥施用劑量與次數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)，引起環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等重大問(wèn)題。因此，如何減少農(nóng)藥用量以及綠色綜合防控稻瘟病仍然是當(dāng)前我國(guó)水稻生產(chǎn)上面臨的重要問(wèn)題。

生物防治以其無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)污染、不易產(chǎn)生抗藥性和高效等優(yōu)點(diǎn)，在植物病蟲(chóng)害防治中越來(lái)越受到人們的重視。光合細(xì)菌（Photosynthetic Bacteria，PBS）是能在厭氧條件下進(jìn)行不放氧氣的光合作用的一類(lèi)細(xì)菌的總稱(chēng)，是地球上最早出現(xiàn)的具有原始光能合成體系的原核生物。其種類(lèi)繁多、分布廣泛，普遍存在于海洋、江河、湖泊、水田、活性污泥和土壤中，已知的光合細(xì)菌共有綠硫細(xì)菌科（Chlorobiaceae）、紅硫細(xì)菌科（Chromatiaceae）、紅螺菌科（Rhodospirillaceae）3個(gè)科。光合細(xì)菌復(fù)雜的代謝功能和獨(dú)特的生理生態(tài)特性使其在農(nóng)畜業(yè)、飼料、環(huán)保、食品加工、生物能源和醫(yī)藥保健等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，運(yùn)用光合細(xì)菌進(jìn)行種子種苗的處理、作物品質(zhì)改良、土壤修復(fù)與增肥、病蟲(chóng)害防治、廢水處理以及保障農(nóng)產(chǎn)品安全是目前的研究熱點(diǎn)。光合細(xì)菌本身無(wú)毒，具有固氮、固碳、促進(jìn)硫循環(huán)作用，且富含B族維生素、泛酸、葉酸、類(lèi)胡蘿卜素、輔酶Q、脯氨酸、尿嘧啶、胞嘧啶等生理活性物質(zhì)對(duì)提高土壤肥力、刺激植物細(xì)胞活性、促進(jìn)根系發(fā)育、提高作物光合效率和生殖生長(zhǎng)能力具有很強(qiáng)的促進(jìn)功能。雖然，光合細(xì)菌在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用研究得到深入展開(kāi)，并為農(nóng)產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)、安全、衛(wèi)生提供了有力保證。

目前在稻瘟病的生物防治研究方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。在微生物源生物農(nóng)藥中，芽孢桿菌和木霉屬真菌都能有效的抑制稻瘟病菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。目前，光合細(xì)菌沼澤紅假單胞菌菌劑在稻瘟病的防控上還未曾見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種沼澤紅假單胞菌生防菌劑在防控稻瘟病中的應(yīng)用，利用沼澤紅假單胞菌菌株制成的菌劑，生產(chǎn)成本低，對(duì)稻瘟病防控效果顯著。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供了一種沼澤紅假單胞菌生防菌劑在防控稻瘟病的應(yīng)用，所述沼澤紅假單胞菌生防菌劑由沼澤紅假單胞菌LY-6（Rhodopseudomonas palustris LY-6）培養(yǎng)得到。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)方法包括活化、種子培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)、NaCl溶液重懸等步驟。

上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述稻瘟病為水稻葉瘟，所述沼澤紅假單胞菌生防菌劑在防控水稻葉瘟中的應(yīng)用方法為：將所述沼澤紅假單胞菌生防菌劑噴施于分蘗后期的水稻葉片上。

上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述稻瘟病為水稻穗瘟，所述沼澤紅假單胞菌生防菌劑在防控水稻穗瘟中的應(yīng)用方法為：將所述沼澤紅假單胞菌生防菌劑噴施于抽穗期的水稻葉片。

上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述沼澤紅假單胞菌生防菌劑的濃度為5×10⁹ cfu/mL～5×10¹⁰ cfu/mL，噴施量為15 L/畝～20 L/畝，每隔10 d～15 d噴施一次。

上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述沼澤紅假單胞菌生防菌劑的制備方法具體包括以下步驟：

（1）活化：將沼澤紅假單胞菌LY-6的菌株按雙層平板培養(yǎng)法培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；

（2）種子培養(yǎng)：將步驟（1）培養(yǎng)的紅色單菌落接入至接入至血清瓶中，用光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期得到菌液；

（3）生產(chǎn)培養(yǎng)：將步驟（2）種子培養(yǎng)后得到的菌液接種到生產(chǎn)瓶中，用光合細(xì)菌生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即為生防菌劑。

上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述步驟（2）中，種子培養(yǎng)在溫度為30℃～32℃、光照條件為2500 Lx～4000 Lx、pH為7.0條件下進(jìn)行。

上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述步驟（3）中，生產(chǎn)培養(yǎng)在溫度為30℃～32℃、光照條件為2500 Lx～4000 Lx、pH=7.0條件下進(jìn)行。

上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述步驟（3）中所述菌液的接種量為所述光合細(xì)菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的5 %～10 %。

本申請(qǐng)所采用的沼澤紅假單胞菌LY-6 (Rhodopseudomonas palustris LY-6)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO∶M 2014525（沼澤紅假單胞菌LY-6 已申請(qǐng)專(zhuān)利保護(hù)，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?01410750073.2），保藏單位地址位于中國(guó)武漢大學(xué)，保藏日期為2014年11月5日，該菌株被命名為沼澤紅假單胞菌LY-6 (Rhodopseudomonas palustris LY-6)。

所述沼澤紅假單胞菌菌株LY-6，具有以下主要特征：革蘭氏陰性，經(jīng)生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定為沼澤紅假單胞菌，主要生物學(xué)特征有：雙層固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d～8 d，形成紅色的圓形菌落，菌落邊緣整齊光滑、菌落直徑0.2 mm～0.60 mm；液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d呈深紅色；在厭氧和微氧條件下生長(zhǎng)良好；生理化特性為V-P反應(yīng)與甲基紅反應(yīng)陰性、H₂S反應(yīng)、明膠液化、脲酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)均陽(yáng)性，最適生長(zhǎng)溫度30℃～32℃，pH=7。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

（1）本發(fā)明提供了一種沼澤紅假單胞菌LY-6在防控稻瘟病的應(yīng)用，沼澤紅假單胞菌LY-6的生防菌劑中含有外泌蛋白和代謝產(chǎn)物，可有效防治稻瘟病，如水稻葉瘟、水稻穗瘟；具有環(huán)境友好、對(duì)人畜無(wú)毒、對(duì)作物無(wú)藥害、施用簡(jiǎn)單方便等特點(diǎn)。

（2）本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌LY-6的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、培養(yǎng)時(shí)間短、成本低，且該菌株可通過(guò)簡(jiǎn)單、快捷、低成本的操作方法制備得到用于稻瘟病防控的生防菌劑。

附圖說(shuō)明

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。

圖1為本發(fā)明實(shí)例2中生防菌劑在大田對(duì)水稻葉瘟的防治效果對(duì)比圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)例3中生防菌劑在大田對(duì)水稻穗瘟的防治效果對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌LY-6 （Rhodopseudomonas palustris LY-6），保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2014525，保藏單位地址位于中國(guó)武漢大學(xué)，保藏日期為2014年11月5日。

實(shí)施例1：

一種本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌LY-6生防菌劑的制備方法，包括以下步驟：

（1） 活化：將沼澤紅假單胞菌LY-6菌株的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；采用的培養(yǎng)基為光合細(xì)菌固體培養(yǎng)基，配方為：（NH₄）₂SO₄ 0.1 wt%、Mg SO₄ 0.02 wt%、NaHCO₃ 0.5 wt%、K₂HPO₄ 0.05 wt%、NaCl 0.02 wt%、酵母膏0.15 wt%和瓊脂1.5 wt%，pH=7.0。

（2）種子培養(yǎng)：將步驟（1）培養(yǎng)出得紅色單菌落接入至120 mL血清瓶中，在溫度為30℃～32℃、光照條件為2500 Lx～4000 Lx、pH=7.0條件下，用光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；采用的培養(yǎng)基為光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基，配方為：（NH₄）₂SO₄ 0.1 wt%、MgSO₄ 0.02 wt%、NaHCO₃ 0.5 wt%、K₂HPO₄ 0.05 wt%、NaCl 0.02 wt%、酵母膏0.15 wt%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），pH=7.0。

（3）生產(chǎn)培養(yǎng)：將步驟（2）種子培養(yǎng)后得到的菌液接種到生產(chǎn)瓶中，用光合細(xì)菌生產(chǎn)培養(yǎng)基（培養(yǎng)基成分與上述光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基一致）進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)，菌液的接種量為所述光合細(xì)菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的5%，在溫度為30℃～32℃、光照條件為2500 Lx～4000 Lx、pH=7.0條件下，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即制得生防菌劑。

對(duì)比例1：

將實(shí)施例1中獲得的生防菌劑放入滅菌鍋中，121℃下滅活30 min即獲得失活的生防菌劑。

實(shí)施例2：沼澤紅假單胞菌LY-6生防菌劑田間對(duì)葉瘟的防控

分別將實(shí)施例1制得的生防菌劑（濃度5×10⁹ cfu/mL）、對(duì)比例1中制得的失活的生防菌劑、化學(xué)農(nóng)藥（稻瘟靈，120 mL/畝）噴施于分蘗后期的水稻葉片，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每畝20 L，每隔15 d噴施一次，共施用3次。最后一次施藥15 d后，按5點(diǎn)法取樣計(jì)算水稻葉片病情指數(shù)，并計(jì)算各自的防治效果。

圖1為對(duì)比例1的失活的生防菌劑、實(shí)施例1的生防菌劑以及化學(xué)農(nóng)藥對(duì)水稻葉瘟的防治效果對(duì)比圖，A、B代表顯著性差異（P<0.01）。從圖1中可知：施用失活的生防菌劑、生防菌劑以及農(nóng)藥各自的防治效果為8.7%、30.9%和44.4%，并且通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，噴施生防菌劑和化學(xué)農(nóng)藥的防治效果沒(méi)有顯著性差異。

實(shí)施例3：沼澤紅假單胞菌LY-6生防菌劑田間對(duì)穗瘟的防控

分別將實(shí)施例1制得的生防菌劑（濃度5×10⁹ cfu/mL）、對(duì)比例1中制得的失活的生防菌劑和化學(xué)農(nóng)藥（稻瘟靈，120 mL/畝）噴施于抽穗期的水稻葉片，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每畝20 L，每隔15 d噴施一次，共施用2次。15 d后，按5點(diǎn)法取樣計(jì)算水稻穗子病情指數(shù)，并計(jì)算各自的防治效果。

圖2為對(duì)比例1的失活的生防菌劑、實(shí)施例1的生防菌劑以及化學(xué)農(nóng)藥對(duì)水稻穗瘟的防治效果對(duì)比圖，A、B代表顯著性差異（P<0.01）。施用失活的生防菌劑、生防菌劑以及農(nóng)藥各自的防治效果、為11.4%、34.4%和46.3%，并且通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，噴施生防菌劑和化學(xué)農(nóng)藥的防治效果沒(méi)有顯著性差異。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。