一種豬冷凍精液保藏方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬冷凍精液保藏方法，屬于動物生產(chǎn)繁殖學(xué)領(lǐng)域，該方法將采集精液稀釋后降溫到17℃，等溫下加入冷卻保護(hù)液稀釋，進(jìn)一步降溫到4~5℃，再加入冷凍保護(hù)液進(jìn)封裝冷藏；根據(jù)冷凍曲線降溫恒定到-120℃后，儲藏在液氮罐中。本發(fā)明的方法，豬用冷凍精液需在無菌的環(huán)境下操作，每一步都需嚴(yán)格控制，嚴(yán)防出錯，否則會影響最終結(jié)果。每一環(huán)節(jié)和參數(shù)都是經(jīng)過大量試驗進(jìn)行校正和優(yōu)化。本方法制作的冷凍精液合格率達(dá)100%，即冷凍精液解凍后精子活力在0.3以上。
【專利說明】一種豬冷凍精液保藏方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物生產(chǎn)和繁殖領(lǐng)域，具體地說涉及一種豬冷凍精液保藏方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人工授精技術(shù)是動物繁殖中提高雄性動物繁殖力的一個關(guān)鍵技術(shù)。豬人工授精技 術(shù)中的常用精液為常溫保存的液態(tài)精液，其保存時間3-5天，最多不超過10天；如能應(yīng)用冷 凍技術(shù)，那公豬的利用力則能大幅度提高。目前，在牛上，特別是奶牛上，冷凍技術(shù)的研究和 應(yīng)用非常成熟和普遍，并有專門的國家標(biāo)準(zhǔn)，如《牛冷凍精液》（GB4143-2008)、《牛冷凍精液 生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》（NY/T1234-2006)。豬和牛繁殖生理的不同，如精液量、精子密度、精液成分 等，導(dǎo)致冷凍技術(shù)在兩者上應(yīng)用面的差異。目前，豬冷凍精液技術(shù)，缺乏統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)或 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，尚處于研究階段，其制作工藝流程還處在摸索階段，大多研究主要集中在稀釋液 成分、甘油濃度、稀釋方法、劑量等方面。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種對豬新鮮精液進(jìn)行稀釋、抗冷處理、篩選并分 裝冷凍的保藏方法，以獲得100%精液合格率，高精子活力的凍精產(chǎn)品。
[0004] 技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的一種豬冷凍精液保藏方法，包括如下 步驟：對采集精液稀釋后降溫到17°c，測量精子密度，離心后測量上清液精子密度，等溫下 加入冷卻保護(hù)液稀釋，稀釋液計算公式為式（I)所示：
[0005] 稀釋液總量=(稀釋后精子密度-上清液精子密度）X體積/7億 （I)，
[0006] 進(jìn)一步降溫到4?5°C，再加入冷凍保護(hù)液進(jìn)封裝冷藏；根據(jù)冷凍曲線降溫恒定 到-120°C后，儲藏在液氮罐中；所述冷凍曲線的過程是：從4?5°C以2°C /min的降溫速度 降溫至_5°C，再以60°C /min降溫速度降溫至-140°C，然后回到_120°C維持lOmin。
[0007] 采集精液的稀釋步驟為：取IOOOml無菌雙蒸水水浴鍋中加熱至30?38°C，再加 入原精稀釋液粉
[0008] 溶解獲得原精稀釋液，穩(wěn)定1小時待用；采集精液、原精稀釋液按1 : 0. 5的比例 等溫稀釋，放入17°C冰箱中平衡40分鐘。
[0009] 稀釋后精液降溫到17°C后立即進(jìn)行離心，17°C等溫環(huán)境下，800g離心12. 5min，并 吸除上清液。
[0010] 加冷卻保護(hù)液稀釋后的體積為最終體積的一半，加完稀釋液后，于4°C環(huán)境下降溫 平衡，Ih后水杯中加冰塊或周圍加冰袋促使其快速降溫至4-5°C ;0. 5h后等量等溫加入冷 凍保護(hù)液，加入后平衡45分鐘裝管。
[0011] 封裝時利用細(xì)管容納冷藏精液，水平放置，封口后將管內(nèi)氣泡晃動到管中央。
[0012] 冷凍采用將容納有冷凍精液的細(xì)管置于液氮上方的方式，通過控制與液氮液面的 距離，在-80°c?-120°c之間調(diào)節(jié)，Smin后投入液氮獲得凍精。
[0013] 有益效果：本發(fā)明所述方法中，豬用冷凍精液需在無菌的環(huán)境下操作，每一步都需 嚴(yán)格控制，嚴(yán)防出錯，否則會影響最終結(jié)果。本工藝中的每一環(huán)節(jié)和參數(shù)都是經(jīng)過大量試驗 進(jìn)行校正和優(yōu)化。本工藝制作的冷凍精液合格率達(dá)100%，即冷凍精液解凍后精子活力在 0. 3以上。

【具體實施方式】
[0014] 實施例1
[0015] (一）準(zhǔn)備工作：
[0016] 原精稀釋液：取IOOOml無菌雙蒸水置30?38°C水浴鍋中調(diào)至30?38°C，溶解原 精稀釋液粉47g，然后穩(wěn)定1小時待用。原精稀釋液粉來自Minitube公司下的產(chǎn)品Androhep PRO Plus Extender，產(chǎn)品批號 13533/3009 ;
[0017] 冷卻保護(hù)液：用400ml30?38°C雙蒸水溶解44g藥品A ;使用時，加入IOOg新鮮蛋 黃，用磁力攪拌器攪拌30min ;然后冷卻到17°C備用。
[0018] 冷凍保護(hù)液：用370ml32?38°C雙蒸水溶解40. 7g藥品B。使用時，加入IOOg新 鮮蛋黃，加入30ml甘油，用磁力攪拌器攪拌30min。然后冷卻到5°C備用?；蛉±鋮s保護(hù)液 185ml加入15ml甘油，用磁力攪拌器攪拌30min。然后冷卻到5°C備用。
[0019] 配制冷卻保護(hù)液中藥品A的和冷凍保護(hù)液中的藥品B來自Minitube公司下產(chǎn)品 Androhep CryoGuard Cooling&Freezing Extender，產(chǎn)品批號 13533/2006。
[0020] (二）具體操作：
[0021] 步驟1 :精液采集和處理
[0022] 精液采集：按規(guī)范操作。注意各個體間不要混雜。多個體使用同一集精杯時，用完 后要先用蒸餾水沖洗再用38°C生理鹽水沖洗干凈。或在集精杯中套入一保鮮袋，每頭豬換 一個。
[0023] 原精液稀釋：采集精液、原精稀釋液按1 : 0. 5的比例等溫（一般30_35°C，根據(jù) 不同季節(jié)采集到的原精溫度而定）稀釋。放入17°C冰箱中平衡40分鐘。
[0024] 測量精子密度：按計數(shù)板法或密度測定儀法測定稀釋后的精子密度。
[0025] 步驟2:離心處理
[0026] 原精稀釋后40分鐘左右，溫度降到17°C后立即進(jìn)行離心。用50或IOOml離心管 在17°C環(huán)境下，800g離心12. 5min，吸去上清液。并測量上清液精子密度。（注意：離心機(jī) 要提前預(yù)冷至17°C。）
[0027] 步驟3:加冷卻保護(hù)液
[0028] 用加冷卻保護(hù)液等溫稀釋，稀釋后的體積為最終體積的一半。加完稀釋液后，用水 杯盛適量的17°C水，把稀釋管放入后送4°C低溫柜內(nèi)降溫平衡，Ih后水杯中加冰塊或周圍 加冰袋促使其快速降溫至4_5°C (0. 5h后進(jìn)行下一步）。
[0029] 稀釋液計算公式為式（I)所示：
[0030] 稀釋液總量=(稀釋后精子密度-上清液精子密度）X體積/7億 （I)，
[0031] 步驟4 :加冷卻保護(hù)液II
[0032] 等量等溫加入冷凍保護(hù)液，加入后平衡45分鐘裝管。（注意：這時在水杯加大量 的4_5°C水，以便防止在加冷卻保護(hù)液II和下面的分裝過程中溫度變化。）
[0033] 步驟5:裝管和封口
[0034] 在4_5°C的冷藏室或平衡柜中進(jìn)行裝管和封口，封口后將管內(nèi)氣泡晃動到管的中 央。
[0035] 步驟6 :冷凍
[0036] 利用Minitube全自動冷凍儀設(shè)置冷凍曲線：從4?5°C以2°C /min的降溫速度降 溫至-5°C，再以60°C /min降溫速度降溫至-140°C，然后回到_120°C維持lOmin。程序凍精 完成后將凍精管迅速取出并迅速投入到裝有液氮的泡沫盒中。后裝入紗布袋中快速放入液 氣罐中。
[0037] 利用大口徑液氮罐冷凍，應(yīng)符合GB/T5458的規(guī)定。冷凍采用將容納有冷凍精液的 細(xì)管置于液氮上方的方式，通過控制與液氮液面的距離，在_80°C?_120°C之間調(diào)節(jié)，Smin 后投入液氮獲得凍精。
[0038] 實施例2
[0039] 將實施例1獲得的凍精進(jìn)行解凍，解凍采取濕解法解，即先將60ml解凍液加入試 管，26°C水浴預(yù)熱，然后1-2支凍精放入38°C水中，30秒鐘后取出，用吸水紙或紗布擦干水 珠，再用細(xì)管剪剪去封口端后注入試管中（26°C)，然后用26°C解凍液I : 1稀釋，3?4秒 后再緩慢加入更多的解凍液，邊加變搖晃。獲得解凍后精液。鏡檢精子活率，達(dá)0.3以上者 包裝。批量生產(chǎn)。隨機(jī)抽查不合格，則全部棄之。
[0040] 實施例3
[0041] 本發(fā)明的方法就工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)效果。
[0042] 試驗動物：國家級小梅山豬保種場的12頭成年、體質(zhì)健康、性欲旺盛、采精頻率正 常的公豬（大約克豬2頭、巴克夏豬2頭、梅山豬4頭、楓涇豬4頭）。
[0043] 試驗設(shè)計：依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇稀釋比例在1 : 0.5?1 : 1.5下進(jìn)行的實驗，在 此范圍內(nèi)進(jìn)行分組稀釋，研究冷凍后精子活力的大小。將采集來的精液測量其活力和密度 然后將其分成5份每份精液6mL，并按照每份理論密度一次是2. 4億/mL、2億/mL、1. 6億/ mL、l. 2億/mL、0. 8億/mL的順序稀釋精液。并測量每份密度的活力和密度，然后進(jìn)行豬精 冷凍試驗，冷凍后分別解凍，測量每份精液的密度和活力，并在室溫下兩小時后再次側(cè)量它 們的活力和密度并記錄以上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
[0044] 試驗方法如本發(fā)明實施例1所述。
[0045] 試驗結(jié)果：隨著稀釋倍數(shù)的增大，解凍后精子的活力也有所增大的。解凍兩小時后 的精子活力也有所增大，當(dāng)稀釋密度處于〇. 8億/mL?1. 6億/mL時顯示的解凍后精子活 力比較高。建議進(jìn)行精液冷凍前將精液稀釋至〇. 8億/mL?1. 6億/mL，對解凍后精子的活 力會比較高。
[0046] 實施例4
[0047] 本試驗是針對2中稀釋劑證明本發(fā)明采用的稀釋劑應(yīng)用于冷凍精液上可獲得更 商活力和質(zhì)量的精子。
[0048] 試驗動物：楓涇種公豬五頭。公豬3-5歲、體重IOOkg左右、體質(zhì)健康，強(qiáng)壯，性欲 旺盛。
[0049] 試驗設(shè)計：2種稀釋液 [0050] 表1 :精液稀釋液的制作
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬冷凍精液保藏方法，其特征在于包括如下步驟： 對采集精液稀釋后降溫到17°c，測量精子密度，離心后測量上清液精子密度，等溫下加 入冷卻保護(hù)液稀釋，稀釋液計算公式為式（I)所示： 稀釋液總量=(稀釋后精子密度一上清液精子密度）X體積/7億 (I)， 進(jìn)一步降溫到4~5°C，再加入冷凍保護(hù)液進(jìn)封裝冷藏；根據(jù)冷凍曲線降溫恒定 到-120°C后，儲藏在液氮罐中； 所述冷凍曲線的過程是：從4~5°C以2°C /min的降溫速度降溫至-5°C，再以60°C /min 降溫速度降溫至_140°C，然后回到_120°C維持lOmin。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬冷凍精液保藏方法，其特征在于：采集精液的稀釋步 驟為： 取1000ml無菌雙蒸水水浴鍋中加熱至3(T38°C，再加入原精稀釋液粉溶解獲得原精稀 釋液，穩(wěn)定1小時待用；采集精液、原精稀釋液按1 :〇. 5的比例等溫稀釋，放入17°C冰箱中 平衡40分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種豬冷凍精液保藏方法，其特征在于：將稀釋后精液 降溫到17°C后立即進(jìn)行離心，17°C等溫環(huán)境下，800g離心12. 5min，并吸除上清液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬冷凍精液保藏方法，其特征在于：加冷卻保護(hù)液稀釋 后的體積為最終體積的一半，加完稀釋液后，于4°C環(huán)境下降溫平衡，lh后水杯中加冰塊或 周圍加冰袋促使其快速降溫至4-5°C ;0. 5h后等量等溫加入冷凍保護(hù)液，加入后平衡45分 鐘裝管。
5. 根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬冷凍精液保藏方法，其特征在于：封裝時利用細(xì) 管容納冷藏精液，水平放置，封口后將管內(nèi)氣泡晃動到管中央。
6. 根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬冷凍精液保藏方法，其特征在于：冷凍采用將容 納有冷凍精液的細(xì)管置于液氮上方的方式，通過控制與液氮液面的距離，在_8〇°C ~-120°C 之間調(diào)節(jié)，8min后投入液氮獲得凍精。
【文檔編號】A01N1/02GK104255704SQ201410526704
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月8日
【發(fā)明者】吳井生, 楊劍波, 肖安磊, 邢軍 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院