專利名稱：一種用于馬鹿冷凍精液保藏的稀釋液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鹿人工授精技術(shù)改良中精液的稀釋液，特別涉及一種用于鹿精液冷凍保藏的稀釋液。
背景技術(shù)：
茸鹿是我國(guó)重要的特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其主要產(chǎn)品鹿茸有著極高的藥用價(jià)值。長(zhǎng)期人工馴養(yǎng)的茸鹿養(yǎng)殖管理方法致使近親繁殖，鹿群質(zhì)量下降，而人工授精技術(shù)可以極大的提高了優(yōu)秀種公鹿配種效能，打破公鹿使用的時(shí)間性和地域性，有效地解決了種公鹿不足地區(qū)的母畜配種問(wèn)題，應(yīng)用人工授精與特別是冷凍精液進(jìn)行鹿的品種培育和改良，可有效遏制這種退化趨勢(shì)。自1961年趙世臻等人首次用假陰道采得梅花鹿精液，輸給馬鹿，受胎率33％，貝什奧等人(1968)由鹿科動(dòng)物采得精液，1976年廣東動(dòng)物園和廣東省科技試驗(yàn)工場(chǎng)取得鹿電刺激采精成功，1988年黑龍江特產(chǎn)研究所對(duì)馬鹿的人工授精獲得60％以上的受胎率。常規(guī)牛凍精生產(chǎn)稀釋液不能獲得達(dá)標(biāo)的鹿冷凍精液，目前國(guó)內(nèi)也還沒(méi)完全自主成功的研制出用于鹿冷凍精液保藏的專用稀釋液，所以國(guó)內(nèi)現(xiàn)在多使用法國(guó)卡蘇公司和德國(guó)米尼圖公司的冷凍稀釋液，其價(jià)格高而且冷凍效果一般，制約了我國(guó)鹿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種冷凍效果好、生產(chǎn)成體低、方法簡(jiǎn)單的用于鹿冷凍精液保藏的稀釋液。
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種用于鹿冷凍精液保藏的稀釋液，它主要是由下列物質(zhì)按比例制成雙蒸水 100ml果糖0.5-3g三羥基氨基甲烷(Tris)2-7g檸檬酸 1-5g谷胱甘肽(GSH) 5-100mg牛血清白蛋白(BSA) 50-300mg三磷酸腺苷(ATP) 5-100mg維生素C(VC) 100-1000mg青霉素 10-100萬(wàn)鏈霉素 5-50萬(wàn)卵黃15-30ml甘油3-30ml為了使本發(fā)明的稀釋液用于精液冷凍保存達(dá)到最佳效果，還可以加入甘油3-30ml。
本發(fā)明用于馬鹿冷凍精液保藏的稀釋液的制備方法很簡(jiǎn)單，將所述的原料直接攪拌混合均勻即可。
本發(fā)明用于馬鹿冷凍精液保藏的稀釋液有兩個(gè)用途，一是用于精液低溫保存，另一用途是用于精液冷凍保存。
本發(fā)明以TRIS為基礎(chǔ)液，偏堿性且有較強(qiáng)的緩沖能力，有利于提高精子活力卵黃和甘油作為凍精稀釋液的通用成分主要為精子降溫和冷凍過(guò)程中提供保護(hù)，提高精子的穩(wěn)定性和復(fù)蘇后的活力，添加了ATP、BSA、VC、CP成分后作為鹿凍精生產(chǎn)稀釋液可以獲得理想且穩(wěn)定的結(jié)果，而且價(jià)格便宜，受胎效果穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合發(fā)明給出的具體制備實(shí)施例、細(xì)管凍精的制作實(shí)施例及產(chǎn)品效果試驗(yàn)例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。
實(shí)施例1本發(fā)明鹿冷凍精液保藏的稀釋液制備將雙蒸水100ml和果糖0.5g、Tris5g、檸檬酸3g、GSH 100mg、BSA 200mg、ATP 20mg、VC500mg、青霉素40萬(wàn)、鏈霉素40萬(wàn)、卵黃25ml混合均勻即得。
實(shí)施例2本發(fā)明鹿12％甘油稀釋液制備將雙蒸水100ml和果糖2g、Tris7g、檸檬酸2g、GSH30mg、BSA150mg、ATP50mg、Vc200mg青霉素60萬(wàn)、鏈霉素60萬(wàn)、卵黃25ml混合均勻，取混合稀釋液88ml加12ml甘油制備12％甘油冷凍稀釋液。
實(shí)施例3精液的低溫保存將采集好的精液送往實(shí)驗(yàn)室，觀察并測(cè)定活率、密度，以0.7和0.6為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)不同環(huán)境溫度下達(dá)優(yōu)、良標(biāo)準(zhǔn)的精子活力的精液份數(shù)占的百分?jǐn)?shù)。挑選活率≥0.8的精液，確定稀釋倍數(shù)，用20％卵黃稀釋液將精液稀釋到預(yù)定稀釋倍數(shù)冰箱水浴1.5h降溫到0℃，0℃環(huán)境保存7-10d，35℃的水浴鍋中解凍20s，鏡檢，活率0.5以上的精液用于輸精。
實(shí)施例4細(xì)管凍精的制作將采集好的精液送往實(shí)驗(yàn)室，觀察并測(cè)定活率、密度，以0.7和0.6為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)不同環(huán)境溫度下達(dá)優(yōu)、良標(biāo)準(zhǔn)的精子活力的精液份數(shù)占的百分?jǐn)?shù)。挑選活率≥0.8的精液，確定稀釋倍數(shù)，用20％卵黃稀釋液將精液稀釋到預(yù)定稀釋倍數(shù)的一倍，將與稀釋精液等量、等溫的12％甘油稀釋液平衡前1次沿試管壁緩緩加入，混勻，使甘油終濃度達(dá)到6％。冰箱水浴1.5h降溫到0℃。在0℃冰箱中水浴降溫平衡3h。在冰箱中將平衡好的精液吸入0.25ml細(xì)管，聚乙烯醇粉封口，置于液氮面2cm的冷凍架上，蓋好容器蓋，冷凍5min，投入液氮中。抽樣并在35℃的水浴鍋中解凍20s，鏡檢，活率0.35以上的精液標(biāo)記裝入紗布袋液氮保存。
試驗(yàn)例1不同冷凍稀釋液對(duì)凍精活力的影響表1不同冷凍稀釋液對(duì)凍精活力的影響

表1結(jié)果顯示，對(duì)天山馬鹿應(yīng)用牛的常規(guī)凍精生產(chǎn)稀釋液，不能獲得達(dá)標(biāo)的冷凍精液，應(yīng)用TRIS基礎(chǔ)液(5％甘油)作為馬鹿凍精生產(chǎn)稀釋液可以獲得較好的結(jié)果，以TRIS為基礎(chǔ)液改良的本發(fā)明的稀釋液(5％甘油)作為馬鹿凍精生產(chǎn)稀釋液可以獲得理想且穩(wěn)定的結(jié)果。
試驗(yàn)例2本發(fā)明的稀釋液甘油濃度的篩選表2本發(fā)明的稀釋液甘油濃度的篩選

甘油是應(yīng)用最廣泛的滲透性抗凍保護(hù)劑，甘油的濃度和稀釋降溫過(guò)程中的添加時(shí)機(jī)直接決定冷凍效果。它可以滲入細(xì)胞減輕冷凍和復(fù)溫過(guò)程中細(xì)胞滲透性腫脹，減緩細(xì)胞皺縮速度，減輕皺縮程度，減少冰晶的形成，但是，甘油較高的滲透性又易造成精細(xì)胞的損傷，甘油濃度越高，細(xì)胞越易被傷害，各種動(dòng)物精細(xì)胞冷凍時(shí)對(duì)甘油濃度的要求是不一樣的，馬鹿精液冷凍的甘油最佳濃度需要大量的試驗(yàn)進(jìn)行篩選確定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，6種甘油濃度中5％和6％組的凍精達(dá)到0.45，較其他各濃度組有更高的活率，6％組的所有凍精活率均在0.3以上，其冷凍效果最好，5％組凍精活率也基本達(dá)標(biāo)，但變異較大，其他各濃度組不能獲得活率達(dá)標(biāo)的凍精。6％甘油終濃度的稀釋液可以獲得最理想的活率。
試驗(yàn)例3本發(fā)明的稀釋液(6％甘油)稀釋液加入時(shí)間的篩選表3含6％甘油稀釋液加入時(shí)間的篩選


甘油在0℃擴(kuò)散入細(xì)胞較為困難，甘油液的加入最好在降溫完成前加入使甘油在細(xì)胞內(nèi)外平衡。表3結(jié)果顯示，降溫前一次組加入與降溫前和平衡前分兩次加入組的凍精活率均達(dá)標(biāo)，兩組的冷凍效果理想且差異不顯著，平衡前一次加入組的冷凍效果不如前兩組。這個(gè)結(jié)果提示，馬鹿精子對(duì)較高濃度的甘油有較強(qiáng)耐受，甘油滲透達(dá)到平衡需要的時(shí)間較長(zhǎng)，甘油在降溫前一次加入達(dá)到6％終濃度既簡(jiǎn)化了操作步驟又可以獲得最佳的冷凍效果。
權(quán)利要求
1.一種用于馬鹿冷凍精液保藏的稀釋液，其特征在于它主要是由下列物質(zhì)按比例制成雙蒸水100ml果糖 0.5-3g三羥基氨基甲烷2-7g檸檬酸1-5g谷胱甘肽 5-100mg牛血清白蛋白 50-300mg三磷酸腺苷5-100mg維生素C 100-1000mg青霉素10-100萬(wàn)鏈霉素 5-50萬(wàn)卵黃15-30ml
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于馬鹿冷凍精液保藏的稀釋液，其特征在于還可以加入甘油3-30ml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種用于馬鹿冷凍精液保藏的稀釋液，它是由雙蒸水80－150ml、果糖0.5－3g、Tris2－7g、檸檬酸1－5g、GSH5－100mg、BSA50－300mg、ATP5－100mg、V
文檔編號(hào)A01N1/02GK101084926SQ20071001816
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月2日
發(fā)明者高慶華 申請(qǐng)人:高慶華