分離精液的冷凍保藏方法
【專利摘要】本發(fā)明涉動(dòng)物繁殖領(lǐng)域，尤其，涉及一種分離精液的冷凍保藏方法，包括以下步驟：將分離精液在第一預(yù)定溫度下冷卻，得到初凍分離精液；在初凍分離精液中加入Tris?B乳化液并在第一預(yù)定溫度下進(jìn)行乳化，混勻后得到乳化分離精液；其中，Tris?B乳化液由體積百分?jǐn)?shù)為88%的Tris?B緩沖液和體積百分?jǐn)?shù)為12%的丙三醇組成；將乳化分離精液在第一預(yù)定溫度下離心，得到分離精液沉淀；將分離精液沉淀在第一預(yù)定溫度下通過懸混、計(jì)數(shù)以及灌裝后得到待冷凍的分離精液；將所述待冷凍的分離精液通過程序冷凍儀進(jìn)行冷凍，得到冷凍分離精液；將所述冷凍分離精液轉(zhuǎn)移至液氮中，冷凍保藏。本發(fā)明提供的冷凍保藏方法降低了整個(gè)保藏過程的成本。
【專利說明】分離精液的冷凍保藏方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉動(dòng)物繁殖領(lǐng)域，具體而言，涉及一種分離精液的冷凍保藏方法。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物的性別控制(sex control)技術(shù)是通過對(duì)動(dòng)物的正常生殖過程進(jìn)行人為干預(yù)，使成年雌性動(dòng)物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門生物技術(shù)。具體的，該技術(shù)是利用動(dòng)物的含有X染色體和含有Y染色體的精液中DNA含量的差異，借助特異性染色劑染色，然后根據(jù)發(fā)出的熒光強(qiáng)度，通過計(jì)算機(jī)預(yù)測精子類別，再通過給精液液滴附加電荷，根據(jù)靜電原理，將含有X染色體的精液和Y染色體的精液分離，得到分離精液，如果得到的分離精液在短期內(nèi)不用，則需要將得到分離精液冷凍保藏，以保證其活力。
[0003]在相關(guān)技術(shù)中，將分離精液冷凍的過程中，需要在其中加入乳化液以防止分離精液受到冷凍打擊；但是常見的乳化液中通常含有大量的Egg yolk (蛋黃)；因此，在配置乳化液的過程中需要將乳化液進(jìn)行離心、過濾等操作；離心的過程需要用到較多的離心管，過濾的過程需要利用特制的過濾膜，而離心管和特制的過濾膜的價(jià)格比較昂貴，進(jìn)而使得整個(gè)配置乳化液過程的成本增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種分離精液的冷凍保藏方法，以解決上述的問題。
[0005]本發(fā)明的實(shí)施例中提供的分離精液的冷凍保藏方法，包括將分離精液在第一預(yù)定溫度下冷卻，得到初凍分離精液；在所述初凍分離精液中加入Tris B乳化液并在第一預(yù)定溫度下進(jìn)行乳化，混勻后得到乳化分離精液；其中所述Tris B乳化液由體積百分?jǐn)?shù)為88%的Tris B緩沖液和體積百分?jǐn)?shù)為12%的丙三醇組成；將所述乳化分離精液在第一預(yù)定溫度下離心，得到分離精液沉淀；將所述分離精液沉淀在第一預(yù)定溫度下通過懸混、計(jì)數(shù)以及灌裝后得到待冷凍的分離精液；將所述待冷凍的分離精液通過程序冷凍儀進(jìn)行冷凍，得到冷凍分離精液；將所述冷凍分離精液轉(zhuǎn)移至液氮中，冷凍保藏。
[0006]本發(fā)明的實(shí)施例提供的分離精液的冷凍保藏方法，在將分離精液保藏的過程中，使用了由體積百分?jǐn)?shù)為88%的Tris B緩沖液和體積百分?jǐn)?shù)為12%的丙三醇組成Tris B乳化液作為乳化劑對(duì)初凍分離精液進(jìn)行了乳化，Tris B乳化液可以對(duì)初凍分離精液起到保護(hù)作用，能夠防止初凍精液在后續(xù)冷凍的過程中受到冷凍打擊，進(jìn)而影響精子的活力；而1^8B乳化液在乳化初凍分離精液的過程中不需要經(jīng)過特制的過濾膜進(jìn)行過濾，并且Tris B乳化液配置成本低，因此，降低了整個(gè)保藏過程的成本。
[0007]此外，本實(shí)施例的這種分離精液的冷凍保藏方法通過初凍、乳化、離心、懸混、計(jì)數(shù)、灌裝以及程序冷凍儀冷凍等流程實(shí)現(xiàn)了將分離精液有效保藏的效果，冷凍保藏后的分離精液可應(yīng)用于動(dòng)物的繁育中，并按照生產(chǎn)需求人為的控制動(dòng)物后代的性別，實(shí)現(xiàn)了快速繁育高產(chǎn)家畜的效果。【專利附圖】

【附圖說明】[0008]圖1示出了本發(fā)明實(shí)施例一提供的分離精液的冷凍保藏方法的流程圖；
[0009]圖2示出了本發(fā)明實(shí)施例二提供的分離精液的冷凍保藏方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面通過具體的實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0011]本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一種分離精液的冷凍保藏方法，包括以下步驟:
[0012]步驟101:將分離精液在第一預(yù)定溫度下冷卻，得到初凍分離精液；
[0013]具體的，在步驟101中，第一預(yù)定溫度為3-5°C，優(yōu)選4°C，冷卻時(shí)間為80分鐘-100分鐘，優(yōu)選90分鐘。
[0014]步驟102:在初凍分離精液中加入Tris B乳化液并在第一預(yù)定溫度下進(jìn)行乳化，混勻后得到乳化分離精液；
[0015]步驟102中，乳化液起到將分離精液保護(hù)的作用，防止其在后續(xù)低溫冷凍過程中受到冷凍打擊，進(jìn)而出現(xiàn)活力降低的缺陷，乳化的過程可以使得精液在處于較低的溫度時(shí)，防止精子受到冷凍損害。因此，在本實(shí)施例中，Tris B乳化液為一種保護(hù)劑，其可以保護(hù)分離精液，使得其在冷凍過程中不受到冷凍打擊。
[0016]其中，Tris B乳化液由體積百分?jǐn)?shù)為88%的Tris B緩沖液和體積百分?jǐn)?shù)為12%的
丙三醇組成；
[0017]在本實(shí)施例中，每1000ml Tris B緩沖液可通過以下方法配置而成:將 Tris (295mM) 35.746g> Citri Acid Monohydrate(95.1mM) 19.980g>D-Fructose (81.7Mm) 14.712g準(zhǔn)確稱量后依次加入盛有需配液總量3/4的超純水中燒杯內(nèi)充分溶解；待完全溶解后用HCl溶液將pH值調(diào)為6.80 ;pH值調(diào)整后的溶液移入體積相對(duì)應(yīng)的容量瓶內(nèi)進(jìn)行定容。用滅菌后板式過濾器(上層0.45 μ m的過濾膜，下層0.22 μ m的過濾膜)進(jìn)行過濾滅菌后然后裝入儲(chǔ)存器皿。
[0018]步驟103:將乳化分離精液在第一預(yù)定溫度下離心，得到分離精液沉淀；
[0019]乳化之后，需要將乳化分離精液進(jìn)行離心，使得乳化液和沉淀分離，進(jìn)而得到分離精液沉淀，以進(jìn)行后續(xù)的操作。
[0020]步驟104:將分離精液沉淀在第一預(yù)定溫度下通過懸混、計(jì)數(shù)以及灌裝后得到待冷凍的分離精液；
[0021]步驟105:將待冷凍的分離精液通過程序冷凍儀進(jìn)行冷凍，得到冷凍分離精液；
[0022]步驟106:將冷凍分離精液轉(zhuǎn)移至液氮中，冷凍保藏。
[0023]本發(fā)明上述實(shí)施例的分離精液的冷凍保藏方法，在將分離精液保藏的過程中，使用了由體積百分?jǐn)?shù)為88%的Tris B緩沖液和體積百分?jǐn)?shù)為12%的丙三醇組成Tris B乳化液作為乳化劑對(duì)初凍分離精液進(jìn)行了乳化，Tris B乳化液可以對(duì)初凍分離精液起到保護(hù)作用，能夠防止初凍精液在后續(xù)冷凍的過程中受到冷凍打擊，進(jìn)而影響精子的活力；而1^8 B乳化液在乳化初凍分離精液的過程中不需要經(jīng)過特制的過濾膜進(jìn)行過濾，并且Tris B乳化液配置成本低，因此，降低了整個(gè)保藏過程的成本。
[0024]此外，本實(shí)施例的這種分離精液的冷凍保藏方法通過初凍、乳化、離心、懸混、計(jì)數(shù)、灌裝以及程序冷凍儀冷凍等流程實(shí)現(xiàn)了將分離精液有效保藏的效果，冷凍保藏后的分離精液可以應(yīng)用于動(dòng)物的繁育中，可以按照生產(chǎn)需求人為的控制動(dòng)物后代的性別，快速繁
育高產(chǎn)家畜。
[0025]為了使得本發(fā)明實(shí)施例一的浮選方法得到更好的應(yīng)用，更加有效應(yīng)用到分離精液的冷凍保藏中，本發(fā)明還在上述實(shí)施例一的基礎(chǔ)之上提供了實(shí)施例二，實(shí)施例二是對(duì)實(shí)施例一的基礎(chǔ)上做出的進(jìn)一步的限定和增加，現(xiàn)做詳細(xì)的闡述和解釋，請參考圖2:
[0026]實(shí)施例二
[0027]步驟201:將分離精液在第一預(yù)定溫度下冷卻，得到初凍分離精液；
[0028]具體的，步驟201的操作過程與步驟101 —致，在此不做贅述。
[0029]步驟202:在初凍分離精液中加入Tris B乳化液并在第一預(yù)定溫度下進(jìn)行乳化，混勻后得到乳化分離精液；
[0030]優(yōu)選的，為了實(shí)現(xiàn)更好的乳化效果，使得初凍分離精液實(shí)現(xiàn)較大程度的乳化，將Tris B乳化液分兩次加入至初凍分離精液中，且每次加入的Tris B乳化液的體積相等，兩次加入的間隔時(shí)間為10-20分鐘。
[0031]步驟203:將乳化分離精液在第一預(yù)定溫度下離心，得到上清液和沉淀；
[0032]具體的，乳化完成之后，需要將乳化分離精液進(jìn)行離心，離心之后得到上清液和沉淀；其中，在步驟203中，離心的轉(zhuǎn)速為:2000-3000轉(zhuǎn)/分鐘；離心的時(shí)間為:15-20分鐘。
[0033]步驟204:通過移液槍將上清液去除，得到分離精液沉淀；
`[0034]得到上清液和沉淀之后需要將上清液去除，在去除上清液的過程中，優(yōu)選的，通過移液槍將上清液通過去除，并且在吸取的過程中，需要謹(jǐn)慎操作，以防止將上清液和分離精液沉淀之間的精子吸除。
[0035]步驟205:將分離精液沉淀在第一預(yù)定溫度下通過懸混、計(jì)數(shù)以及灌裝后得到待冷凍的分離精液；
[0036]在步驟205中，通過懸混、計(jì)數(shù)以及灌裝后得到待冷凍的分離精液；優(yōu)選的，在本實(shí)施例中懸混具體操作為:將分離精液沉淀通過混懸器懸混10-20秒，得到懸浮狀的分離精液，懸混的過程中，劇烈的震蕩使得精子受到物理損害，進(jìn)而導(dǎo)致精子失去活力，因此，應(yīng)避免距離震蕩，通過調(diào)節(jié)懸混器的頻率，輕微操作，此外，在懸混的過程中，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
[0037]本實(shí)施例中，優(yōu)選的，利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)懸浮狀的分離精液進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到計(jì)數(shù)后的分離精液；計(jì)數(shù)完成之后，優(yōu)選的，將計(jì)數(shù)后的分離精液加入Tris A冷凍液以及Tris B冷凍液稀釋，得到待灌裝的分離精液；
[0038]其中，TrisA 冷凍液的配置方法包括:Tris(291.7mM)24.23g、Citric AcidMonohydrate (81.9mM) 13.70g、D-Fructose (70.2mM) 10.07g 混勻后用超純水定容至 796ml ；再通過加入Egg yolk液定容至1000ml ;用封口膜封口后充分混勻，再將溶液倒入燒杯用磁力攪拌器攪拌30分鐘。5°C靜置過夜(不低于12小時(shí))；靜置后的溶液吸去上層5-10毫升液廢棄，然后將上清液倒入燒杯；再將上清液分裝到離心管后兩兩平衡。放入離心機(jī)內(nèi)離心(8°C >10000-12000轉(zhuǎn)/分鐘、60分鐘)，離心結(jié)束后吸去離心管上層油狀物；將上清液倒入試劑瓶內(nèi)用裝有兩層膜濾器進(jìn)行過濾。過濾程序依次為:1.2 μ m-0.8 μ m、0.8 μ m-0.45 μ m、
0.45 μ m-0.22 μ m ;過濾后的溶液按每1000毫升加入體積為11_13毫升的抗生素溶液(泰勒霉素溶液、慶大霉素溶液等)。[0039]Tris B冷凍液的配置方法包括:每1000毫升的Tris B冷凍液由880毫升的23%Egg yolk Tris-B液和120毫升的丙三醇混合配置而成；其中，每1000毫升的239f)Eggyolk Tris-B液由770ml的Tris B緩沖液和230毫升的Egg Yolk配置而成。
[0040]通過計(jì)數(shù)結(jié)果，確定稀釋過程中需要添加的Tris A冷凍液以及Tris B冷凍液。
[0041]具體的，在懸混和計(jì)數(shù)之后，得到待灌裝的分離精液，進(jìn)一步的，需要將待灌裝的分離精液使用單頭分裝機(jī)罐裝至冷凍管中，得到待冷凍的分離精液。
[0042]在進(jìn)入程序冷凍儀之前，需要先將待灌裝的分離精液使用單頭分裝機(jī)灌裝至冷凍管中，以做好冷凍的準(zhǔn)備。具體的，冷凍管以0.25ml冷凍細(xì)管為優(yōu)選。[0043]步驟206:將待冷凍的分離精液通過程序冷凍儀進(jìn)行冷凍，得到冷凍分離精液；
[0044]步驟207:將冷凍分離精液轉(zhuǎn)移至盛滿液氮的液氮罐中，冷凍保藏。
[0045]并且，為了保證冷藏效果，將冷凍分離精液轉(zhuǎn)移至盛滿液氮的液氮罐中，并每隔一年更換液氣te中的液氣。
[0046]優(yōu)選的，在上述實(shí)施例中，第一預(yù)定溫度為3_5°C，優(yōu)選為4°C。
[0047]綜上，本實(shí)施例的這種分離精液的冷凍保藏方法通過初凍、乳化、離心、懸混、計(jì)數(shù)、灌裝以及程序冷凍儀冷凍等流程實(shí)現(xiàn)了將分離精液有效保藏的效果，冷凍保藏后的分離精液可應(yīng)用于動(dòng)物的繁育中，并按照生產(chǎn)需求人為的控制動(dòng)物后代的性別，實(shí)現(xiàn)了快速繁育高產(chǎn)家畜的效果。
[0048]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.分離精液的冷凍保藏方法，其特征在于，包括以下步驟: 將分離精液在第一預(yù)定溫度下冷卻，得到初凍分離精液； 在所述初凍分離精液中加入TriS B乳化液并在第一預(yù)定溫度下進(jìn)行乳化，混勻后得到乳化分離精液；其中，所述Tris B乳化液由體積百分?jǐn)?shù)為88%的Tris B緩沖液和體積百分?jǐn)?shù)為12%的丙三醇組成； 將所述乳化分離精液在第一預(yù)定溫度下離心，得到分離精液沉淀； 將所述分離精液沉淀在第一預(yù)定溫度下通過懸混、計(jì)數(shù)以及灌裝后得到待冷凍的分離精液； 將所述待冷凍的分離精液通過程序冷凍儀進(jìn)行冷凍，得到冷凍分離精液； 將所述冷凍分離精液轉(zhuǎn)移至液氮中，冷凍保藏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離精液的冷凍保藏方法，其特征在于，在所述初凍分離精液中加入Tris B乳化液并在第一預(yù)定溫度下進(jìn)行乳化，混勻后得到乳化分離精液的步驟中: 所述Tris B乳化液分兩次加入至所述初凍分離精液中，且每次加入的Tris B乳化液的體積相等，兩次加入的間隔時(shí)間為10-20分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離精液的冷凍保藏方法，其特征在于，在所述的將所述乳化分離精液在第一預(yù)定溫度下離心，得到分離精液沉淀的步驟中，具體包括: 將所述乳化分離精液在第一預(yù)定溫度下離心，得到上清液和沉淀； 通過移液槍將所述上清液去除，得到所述分離精液沉淀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述分離精液的冷凍保藏方法，其特征在于，在所述將所述乳化分離精液在第一預(yù)定溫度下離心，得到分離精液沉淀的步驟中: 所述離心的轉(zhuǎn)速為:2000-3000轉(zhuǎn)/分鐘； 所述離心的時(shí)間為:15-20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離精液的冷凍保藏方法，其特征在于，在所述將所述分離精液沉淀在第一預(yù)定溫度下通過懸混、計(jì)數(shù)以及灌裝后得到待冷凍的分離精液的步驟中，所述懸混具體為: 將所述分離精液沉淀通過混懸器懸混10-20秒，得到懸浮狀的分離精液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離精液的冷凍保藏方法，其特征在于，在所述將所述分離精液沉淀在第一預(yù)定溫度下通過懸混、計(jì)數(shù)以及灌裝后得到待冷凍的分離精液的步驟中，所述計(jì)數(shù)具體包括: 利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)所述懸浮狀的分離精液進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到計(jì)數(shù)后的分離精液； 將計(jì)數(shù)后的分離精液加入Tris A冷凍液以及Tris B冷凍液進(jìn)行稀釋，得到待灌裝的分離精液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離精液的冷凍保藏方法，其特征在于，在所述將所述分離精液沉淀在第一預(yù)定溫度下通過懸混、計(jì)數(shù)以及灌裝后得到待冷凍的分離精液的步驟中，所述灌裝具體包括: 將所述待灌裝的分離精液使用單頭分裝機(jī)灌裝至冷凍管中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的分離精液的冷凍保藏方法，其特征在于，在所述將所述冷凍分離精液轉(zhuǎn)移至液氮中，冷凍保藏的步驟中，具體包括:將所述冷凍分離精液轉(zhuǎn)移至盛滿液氮的液氮罐中，冷凍保藏。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離精液的冷凍保藏方法，其特征在于，在所述將所述冷凍分離精液轉(zhuǎn)移至盛滿液氮的液氮罐中，冷凍保藏的步驟中，具體包括: 將所述冷凍分離精液轉(zhuǎn)移至盛滿液氮的液氮罐中，并每隔一年更換所述液氮罐中的液氮。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離精液的冷凍保藏方法，其特征在于，所述第一預(yù)定溫度為 3-5℃。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK103493800SQ201310456055
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】帥志強(qiáng), 蘇冠宇 申請人:大連金弘基種畜有限公司