專利名稱：絲膠肽在冷凍干燥或冷凍保藏益生菌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及益生菌的凍藏技術(shù)，具體地涉及一種用于益生菌冷凍干燥或冷凍保藏中的保護劑，屬于食品工程中微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
益生菌是指改善宿主微生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達到提高宿主健康水平和健康狀態(tài)的細(xì)菌，可直接作為食品添加劑服用，以維持腸道菌叢的平衡。益生菌具有豐富的生理功能如:增強人體免疫力；抑制有害菌在腸內(nèi)的繁殖，減少毒素，促進腸道蠕動，改善排便狀況，從而提高腸道機能與腸道消化系統(tǒng)健康；幫助維生素BpByB6等營養(yǎng)成分吸收；降低血清膽固醇等。因此，益生菌是一種重要的保健功能因子，經(jīng)特殊工藝制成微生態(tài)制劑，可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健、飼料和農(nóng)業(yè)等各領(lǐng)域中。益生菌冷凍干燥制劑因為活菌保藏期與貨架期長、活菌數(shù)量高而被廣泛研究和應(yīng)用。冷凍干燥過程一般會造成益生菌的細(xì)胞膜 通透性改變、蛋白質(zhì)變性失活、PH值的動態(tài)平衡被破壞、DNA損傷和膜脂肪酸組成發(fā)生改變等，從而導(dǎo)致凍干產(chǎn)品中益生菌的大量死亡。因此，在益生菌制劑的生產(chǎn)過程中，為了保護益生菌的活性，除了控制工藝外，最關(guān)鍵的是篩選合適的冷凍保護劑。目前常用于益生菌的冷凍保護劑主要有糖類物質(zhì)，包括海藻糖、蔗糖、水蘇糖等，還包括一些蛋白質(zhì)類物質(zhì)。如將水蘇糖作為凍干保護劑的成分之一，應(yīng)用于雙歧桿菌和乳酸菌的冷凍干燥(中國發(fā)明專利申請:200910091973.X)，由質(zhì)量比(W/W)為4:4:3:4的蔗糖、麥芽糖、山梨醇和谷氨酸形成的組合冷凍保護劑應(yīng)用于乳酸菌的冷凍保藏(中國發(fā)明專利申請:200310115572.6)。絲膠肽是以桑蠶繭為原料，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，將包覆在桑蠶絲質(zhì)外層的膠體蛋白定向酶切成小分子多肽，再經(jīng)過干燥制成。絲膠肽具有非常特殊的氨基酸組成，如富含有帶羥基的氨基酸，尤其是絲氨酸含量高達31%。絲膠肽具有豐富的功能作用，主要包括保濕、控油、防曬、抗氧化、激活肌膚細(xì)胞、防衰老等功效。目前，還沒有將絲膠肽直接作為益生菌冷凍干燥保護劑的研究和報道。因此，本發(fā)明研究了絲膠肽作為一種新型的天然冷凍干燥保護劑的效果及其具體應(yīng)用，進一步開拓了絲膠肽在食品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供絲膠肽的一種新用途，即作為一種益生菌冷凍干燥或冷凍保藏的保護劑以及上述保護劑在冷凍干燥制備益生菌菌劑或者冷凍保藏益生菌菌種中的應(yīng)用。發(fā)明人在研究絲膠肽的綜合應(yīng)用過程中，意外的發(fā)現(xiàn)，絲膠肽對微生物的冷凍干燥以及冷凍保藏具有良好的保護作用，能夠有效提高凍干菌劑中菌種的成活率，從而可以用于制備冷凍干燥菌劑。而在益生菌菌劑制備過程中，同樣面臨著如何提高益生菌菌種成活率的問題，應(yīng)用本發(fā)明的方法，能夠有效提高凍干益生菌菌劑中益生菌的成活率，且絲膠肽具有一定的營養(yǎng)保健價值，含有絲膠肽的益生菌菌劑非常適合于開發(fā)益生菌保健品或益生菌藥物。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。絲膠肽在冷凍干燥制備益生菌菌劑或冷凍保藏益生菌菌種中的應(yīng)用，所述益生菌是指能以活菌狀態(tài)達到胃腸道，通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成，對人體或動物健康起促進作用的單一微生物或多種微生物的混合物。所述益生菌為雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌、中介鏈球菌、糞鏈球菌和酵母菌中的一種或多種，優(yōu)選為雙歧桿菌和乳桿菌中的一種或兩種；所述絲膠肽為絲膠蛋白的酶解產(chǎn)物，相對分子量在IOOOODa 300Da范圍內(nèi)。一種用于冷凍干燥制備益生菌菌劑過程中或者冷凍保藏益生菌菌種過程中的保護劑，所述保護劑組分中含有絲膠肽，所述保護劑為單一絲膠肽組分或者為絲膠肽與其它化合物的組合物，所述其它化合物包括海藻糖、甘露醇、蔗糖、低聚半乳糖與谷胱甘肽等。在冷凍干燥制備益生菌菌劑過程中，添加絲膠肽的量為，絲膠肽與發(fā)酵液的質(zhì)量百分比為
0.5^5% (W/W)，優(yōu)選所述發(fā)酵液的菌含量>108CFU/mL，在冷凍保藏益生菌菌種過程中，絲膠肽添加到菌懸液中的濃度為0.f 10mg/mL。含有絲膠肽的保護劑在冷凍干燥制備益生菌菌劑中的應(yīng)用，包括如下步驟，(I)益生菌發(fā)酵選定一種或者兩種以上的益生菌菌種，在食品級培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵；(2)添加保護劑益生菌發(fā)酵完成后，將絲膠肽添加至步驟(I)所得的發(fā)酵液中，混合均勻；(3)冷凍干燥；

將步驟(2)獲得的混合物經(jīng)冷凍干燥制得富含益生菌的菌劑。含有絲膠肽的的保護劑在冷凍保藏益生菌菌種中的應(yīng)用，包括如下步驟，(I)制備菌泥；選定一種或者兩種以上的益生菌菌種接種至培養(yǎng)基中發(fā)酵,發(fā)酵后離心收集菌泥；(2)添加保護劑；將菌泥用滅菌去離子水懸浮，將絲膠肽加入至菌懸液中，混勻得混合液；(3)冷凍保藏；將步驟(2)所得混合液分裝于冷凍管中，置于一 20°C條件下凍藏。本發(fā)明中所用的絲膠肽，具有如下特征:(I)絲膠肽為絲膠蛋白的酶水解產(chǎn)物，是一種天然生物活性物質(zhì)；(2)絲膠肽相對分子量在10000Da 300Da范圍廣泛分布，其中冷凍干燥保護作用較優(yōu)的絲膠肽分布在3000Da以下；(3)絲膠肽主要氨基酸組成為:18%天冬氨酸，8%蘇氨酸，31%絲氨酸，8%谷氨酸，10%甘氨酸，4%丙氨酸。其中帶羥基的氨基酸絲氨酸與蘇氨酸的含量高達39%。將絲膠肽用于益生菌的冷凍干燥，指的是將含絲膠肽的保護劑應(yīng)用在益生菌的冷凍干燥(或冷凍保藏)過程中，能大幅抑制菌種死亡，從而提高凍干(或凍藏)益生菌存活率及貯藏的穩(wěn)定性。所述的絲膠肽在益生菌冷凍干燥過程中的應(yīng)用，具體地指，選定一種或者兩種以上的混合菌種，在食品級培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，優(yōu)選10(T200g/L脫脂乳培養(yǎng)基，然后添加一定質(zhì)量百分比濃度的絲膠肽至發(fā)酵乳中，混合均勻后，分裝在無菌培養(yǎng)皿中，在-20°C凍藏12h，然后在溫度<-50°C，真空度<20pa條件下冷凍干燥16 24h，制得具有良好存活率的益生菌粉末。優(yōu)選絲膠肽與發(fā)酵乳的質(zhì)量百分比為0.5 5% (W/W)。所述的絲膠肽在益生菌冷凍保藏過程的應(yīng)用，具體地指，選定一種或者兩種以上混合菌種，接入M17肉湯培養(yǎng)液中37°C，180rpm過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期，所述穩(wěn)定期是指菌懸液在600nm處吸光值達到1.2 1.4，再以10% (V/V)比例接種于M17肉湯中培養(yǎng)4h，然后4°C下6000rpm離心IOmin,收集菌泥；將菌泥以原培養(yǎng)液相同體積的無菌去離子水懸浮,按體積比1:1取菌懸液與濃度為0.2^20mg/mL的絲膠肽溶液混和均勻，混合液中，絲膠肽的最終含量為0.riOmg/mL然后將混合液分裝于冷凍管中，置于_20°C進行凍藏，凍藏的益生菌具有良好的存活率。所述的益生菌存活率主要采用如下檢測方法進行分析:將含有益生菌的樣品，用無菌去離子水梯度稀釋到一定濃度；預(yù)先分裝在試管中的M17半固體培養(yǎng)基(瓊脂濃度為0.3% (g/mL))，每管9mL，121°C滅菌15min后，置于45°C水浴搖床中，避免瓊脂冷凝沉降。然后取益生菌樣品稀釋液ImL加入到盛有9mL無菌M17半固體培養(yǎng)基的試管中，小心混合，避免產(chǎn)生氣泡。接菌的試管放在恒溫培養(yǎng)箱中37°C靜置培養(yǎng)24h 48h后，統(tǒng)計菌落數(shù)(CFU)，菌落數(shù)控制在30 300之間。檢測樣品凍干或凍藏前后
的活菌數(shù)，存活率按下列公式計算得到:
權(quán)利要求
1.絲膠肽在冷凍干燥制備益生菌菌劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述益生菌是指能以活菌狀態(tài)達到胃腸道，通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成，對人體或動物健康起促進作用的單一微生物或多種微生物的混合物。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述益生菌為雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌、中介鏈球菌、糞鏈球菌和酵母菌中的一種或多種；所述絲膠肽為絲膠蛋白的酶解產(chǎn)物，相對分子量在IOOOODa 300Da范圍內(nèi)。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述益生菌為雙歧桿菌和乳桿菌中的一種或兩種。
5.含有絲膠肽的保護劑在冷凍干燥制備益生菌菌劑過程中或者冷凍保藏益生菌菌種過程中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，包括如下步驟， (1)益生菌發(fā)酵 選定一種或者兩種以上的益生菌菌種，在食品級培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵； (2)添加保護劑 益生菌發(fā)酵完成后，將含絲膠肽的保護劑添加至步驟(I)所得的發(fā)酵液中，混合均勻； (3)冷凍干燥； 將步驟(2)獲得的混合物經(jīng)冷凍干燥制得富含益生菌的菌劑。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于， 所述步驟(I)中，所述益生菌為雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌、中介鏈球菌、糞鏈球菌和酵母菌中的一種或多種；所述食品級培養(yǎng)基為10(T200g/L的脫脂乳培養(yǎng)基； 所述步驟(2)中，添加含絲膠肽的保護劑的量為，絲膠肽與所述發(fā)酵液的質(zhì)量百分比為0.5 5% ； 所述步驟(3)，冷凍干燥的步驟為，將步驟(2)所得的混合物置于-20°C凍藏12h，然后在溫度<-50°C，真空度<20pa條件下冷凍干燥16 24h。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于， 所述步驟(2)中，添加含絲膠肽的保護劑的量為，絲膠肽與所述發(fā)酵液的質(zhì)量百分比為1.2%。
9.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，包括如下步驟， (1)制備菌泥 ； 選定一種或者多種益生菌菌種接種至培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵后離心收集菌泥； (2)添加保護劑； 將菌泥用滅菌去離子水懸浮，將含絲膠肽的保護劑加入至菌懸液中，混勻得混合液； (3)冷凍保藏； 將步驟(2)所得混合液分裝于冷凍管中，置于-20°C條件下凍藏。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于， 所述步驟(I)中，所述益生菌為雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌、中介鏈球菌、 糞鏈球菌和酵母菌中的一種或多種，所述培養(yǎng)基為M17肉湯培養(yǎng)基； 所述步驟(2)中，所述混合液中絲膠肽的含量為0.f 10mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型益生菌冷凍干燥保護劑絲膠肽及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的絲膠肽是由絲膠蛋白通過酶水解制備得到的產(chǎn)物，相對分子量在10000Da~300Da范圍廣泛分布，活性較優(yōu)的組分主要分布在3000Da以下，其氨基酸組成特點是帶羥基的氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸含量高達39%。絲膠肽對冷凍干燥或冷凍保藏兩歧雙歧桿菌和保加利亞乳酸桿菌等益生菌具有較高的凍干或凍藏保護率且保護效果穩(wěn)定。本發(fā)明優(yōu)點是將絲膠肽用作益生菌的冷凍干燥或冷凍保藏保護劑，拓寬了絲膠肽作為一種具有營養(yǎng)和保健功能的天然冷凍干燥保護劑的應(yīng)用。
文檔編號C12N1/04GK103103124SQ20131005262
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月18日
發(fā)明者吳金鴻, 周炎富, 王正武, 何亞雯, 姚芳懿, 榮玉芝 申請人:上海交通大學(xué)