專利名稱：一種修飾的小干擾核酸及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種修飾的小干擾核酸及其制備方法。
背景技術(shù)：
RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉同源基因的表達(dá)或使該基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)又被形象地稱為基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing),是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。最早有關(guān)RNA干擾的報道出現(xiàn)在1990年，由兩個不同的研究小組同時報道了轉(zhuǎn)基因植物中的RNA干擾現(xiàn)象，以后又在線蟲、果蠅、斑馬魚和小鼠等幾乎所有真核生物中觀察到了 RNA干擾現(xiàn)象。1999年，Hamilton和Baulcombe在發(fā)生RNA干擾的植物中檢測到了長度為21-25個核苷酸的RNA片段，這些RNA片斷被證明是RNA干擾所必需的，被稱為小分子干擾核酸(siRNA)。雙鏈siRNA與細(xì)胞源性的相關(guān)酶和蛋白質(zhì)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-1nduced silencing complex, RISC)。在 RNA 干擾過程中，雙鏈 siRNA 中的正義鏈被排除出復(fù)合體，反義鏈指導(dǎo)RISC結(jié)合到靶mRNA的同源位點，然后由復(fù)合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，從而關(guān)閉靶基因的表達(dá)。但是，由于小分子干擾核酸(siRNA)的穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)容易被核酸酶降解，因此人們對合成的siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾，以增加siRNA的血清穩(wěn)定性，從而有效地抑制目的基因的表達(dá)。目前，由于人們對s iRNA在血清中的降解過程和機(jī)制缺乏足夠的了解，只能依靠各自的經(jīng)驗隨機(jī)地選擇siRNA分子中的多個核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾。這種修飾策略雖然能很好地提高siRNA分子的血清穩(wěn)定性，但由于缺乏理論的指導(dǎo)，通常在siRNA分子中引入了過量的修飾，增加了修飾后的siRNA的細(xì)胞毒性，并在很多情況下降低了 siRNA的生物學(xué)活性，因而制約了修飾后的siRNA在體內(nèi)的應(yīng)用。另外，在siRNA中盲目地在核苷酸中引入大量修飾的做法，也限制了一些具有較好穩(wěn)定效果，但細(xì)胞毒性相對較大的修飾方法在體內(nèi)研究中的應(yīng)用。因此，設(shè)計具有針對性的修飾方案，通過最少的修飾來實現(xiàn)最優(yōu)的穩(wěn)定性目的是目前迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的siRNA的修飾方案中存在盲目地引入大量的修飾從而導(dǎo)致得到的修飾的小干擾核酸細(xì)胞毒性大問題，提供一種血清穩(wěn)定的、具有良好生物活性的且細(xì)胞毒性較低的修飾的小干擾核酸，以及這種小分子干擾核酸的制備方法。
本發(fā)明提供了一種修飾的小干擾核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能夠形成雙鏈區(qū)域，所述第一片段包含至少一個連續(xù)的UA序列，所述第二片段包含至少一個與所述第一片段的UA序列互補(bǔ)的連續(xù)的UA序列，所述第一片段的UA序列與所述第二片段的UA序列形成UA/UA位點，其特征在于，所述UA/UA位點中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性高于未修飾的小干擾核酸，所述的第一片段為5 ’ -AGCGCUUAAAGGGCGAGAAGAUU-3 ’，第二片段為3， -UUUCGCGAAUUUCCCGCUCUUCU-5，。本發(fā)明通過對UA/UA位點進(jìn)行特異性的修飾，從而在僅引入少量修飾的情況下，即可達(dá)到增加修飾后的小干擾核酸的血清穩(wěn)定性的目的，從而降低了修飾后的小干擾核酸分子的潛在的細(xì)胞毒性，以及修飾對小干擾核酸的生物學(xué)活性的影響。
具體實施例方式本發(fā)明提供的修飾的小干擾核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能夠形成雙鏈區(qū)域，所述第一片段包含至少一個連續(xù)的UA序列，所述第二片段包含至少一個與所述第一片段的UA序列互補(bǔ)的連續(xù)的UA序列，所述第一片段的UA序列與所述第二片段的UA序列形成至少一個UA/UA位點，其中，所述UA/UA位點中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性高于未修飾的小干擾核酸。本發(fā)明的發(fā)明人對小干擾核酸分子在體內(nèi)的降解過程進(jìn)行了細(xì)致的研究，發(fā)現(xiàn)在UA/UA位點中僅引入少量修飾的情況下，即可提高修飾的小干擾核酸分子的穩(wěn)定性，大大降低了由于隨機(jī)地引入大量的修飾而導(dǎo)致的細(xì)胞毒性較高，以及修飾對小干擾核酸的生物學(xué)活性的影響。根據(jù)本發(fā)明，所述的“第一片段”是指具有與基因編碼鏈的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段，所述“第二片段”是指具有與基因編碼鏈的序列互補(bǔ)的序列的核苷酸片段。所述“互補(bǔ)”是指兩個核苷酸在雜交條件下能夠配對，例如，腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)之間能夠配對，以及胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)之間的配對。

根據(jù)本發(fā)明，所述小干擾核酸分子的標(biāo)靶可以為各種基因，例如，可以將在細(xì)胞內(nèi)的功能有待分析的基因作為標(biāo)靶，也可以將需要抑制其表達(dá)的基因作為標(biāo)靶，例如，可以以與疾病或紊亂相關(guān)的基因作為標(biāo)靶，如癌基因、病毒基因、細(xì)胞膜表面受體基因、細(xì)胞核受體基因或細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路上的基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)其標(biāo)靶基因，能夠設(shè)計得到小干擾核酸分子(siRNA)，例如，將目的基因的靶標(biāo)序列或目的基因在NCBIGenbank中的序列號輸入各種小干擾核酸設(shè)計程序,如Insert Design Tool for the shRNAVectors (Ambion)、shRNA Explorer (Gene Link)> siDirect (Yuki Naito et al.Universityof Tokyo)、 SiRNA at Whitehead(Whitehead Institute for Biomedical Research),BLOCK-1T RNAi Designer(invitrogen)、RNAi Design(IDT), RNAi Explorer(Gene Link)、siRNA Target Finder (Ambion)、或 siSearch(Stockholm Bioinformatics Center)等，該設(shè)計程序?qū)鶕?jù)設(shè)計者的要求和siRNA的設(shè)計原則，針對所提供的基因或序列設(shè)計siRNA。并且，有些程序能夠?qū)υO(shè)計好的siRNA做全基因組或mRNA轉(zhuǎn)錄組的同源性分析，從而設(shè)計出對靶基因或靶序列特異的siRNA。上述提及的siRNA設(shè)計程序及其涉及的原則為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，其全部內(nèi)容在此一并引入作為參考。
根據(jù)本發(fā)明，所述修飾的小干擾核酸可以包含多個UA/UA位點，并且該多個UA/UA位點中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的。此外，所述修飾的小干擾核酸中，除了所述UA/UA位點中的核苷酸以外，其它核苷酸是未經(jīng)過修飾的。在這種情況下，不但能夠提高所述修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性、維持其生物活性，還可以使在修飾的小干擾核酸分子中引入的修飾數(shù)量最小化，從而進(jìn)一步地降低修飾引起的小分子干擾核酸的細(xì)胞毒性。優(yōu)選情況下，所述修飾的小干擾核酸的UA/UA位點中，只有一個尿嘧啶核苷酸是經(jīng)過修飾的。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，只要對所述UA/UA位點中的一個尿嘧啶核苷酸進(jìn)行修飾，就可以提高修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性，并維持其生物活性，這種情況下，可以使在修飾的小干擾核酸中引入的修飾數(shù)量最小化，從而更進(jìn)一步地降低修飾引起的小分子干擾核酸的細(xì)胞毒性。根據(jù)本發(fā)明，所述修飾的小干擾核酸可以為單鏈分子也可以為雙鏈分子。當(dāng)所述修飾的小干擾核酸為單鏈分子時，所述第一片段和第二片段之間的互補(bǔ)區(qū)域形成雙鏈區(qū)域。當(dāng)所述修飾的小干擾核酸為雙鏈分子時，該修飾的小干擾核酸包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈可以為連續(xù)的核苷酸鏈，也可以為不連續(xù)的核苷酸鏈；所述反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供的修飾的小干擾核酸包括正義鏈和反義鏈，且所述正義鏈和反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈，所述第一片段位于正義鏈，所述第二片段位于反義鏈。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供的修飾的小干擾核酸包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈?zhǔn)前▋蓚€或兩個以上的正義鏈部分的不連續(xù)的核苷酸鏈；所述反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈；所述第一片段位于一個或多個正義鏈部分，所述第二片段位于反義鏈。本發(fā)明中，術(shù)語“正義鏈”是指當(dāng)所述修飾的小干擾核酸為雙鏈分子時，具有與基因編碼鏈的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段，所述“反義鏈”是指當(dāng)所述修飾的小干擾核酸為雙鏈分子時，具有與基因編碼鏈的序列互補(bǔ)的序列的核苷酸片段。并且，當(dāng)所述修飾的小干擾核酸為雙鏈分子且所述正義鏈和反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈時，術(shù)語“正義鏈”和“第一片段”可以互換使用，術(shù)語“反義鏈”和“第二片段”可以互換使用。本發(fā)明中，術(shù)語“正義鏈部分”是指當(dāng)所述正義鏈為不連續(xù)的核苷酸時，用于組成正義鏈的一部分核苷酸鏈；在所述正義鏈中，該正義鏈的所有正義鏈部分的總長度與所述正義鏈的長度相等，并且，當(dāng)所述正義鏈部分中包含UA/UA位點時，術(shù)語“正義鏈部分”與“第一片段”可以互換使用。根據(jù)本發(fā)明，所述修飾的小干擾核酸可以由核糖核苷酸組成，也可以為包括核糖核苷酸和至少一個脫氧核糖核苷酸的雜合分子。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“細(xì)胞毒性”是指由于對核苷酸分子進(jìn)行修飾而造成的對細(xì)胞的
毒性作用。本發(fā)明中，所述修飾的方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，本發(fā)明對所述小分子干擾核酸進(jìn)行的化學(xué)修飾為以下的一種或幾種:(1)對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；
(2)對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中核糖的的修飾；(3)對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中堿基的修飾。所述磷酸二酯鍵的修飾是指對磷酸二酯鍵中的氧進(jìn)行修飾，包括硫代磷酸修飾(Phosphorthioate)和硼燒化磷酸鹽修飾(Boranophosphate)。如圖所示分別用硫和硼燒置換磷酸二酯鍵中的氧。兩種修飾都能穩(wěn)定小分子干擾核酸的結(jié)構(gòu)，保持堿基配對的高特異性和高親和力。而硼烷化磷酸鹽修飾的小干擾核酸的疏水性強(qiáng)，易于在血漿中形成水合蛋白，對人體的毒副作用低于硫代磷酸酯。
權(quán)利要求
1.一種修飾的小干擾核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能夠形成雙鏈區(qū)域，所述第一片段包含至少一個連續(xù)的UA序列，所述第二片段包含至少一個與所述第一片段的UA序列互補(bǔ)的連續(xù)的UA序列，所述第一片段的UA序列與所述第二片段的UA序列形成UA/UA位點，其特征在于，所述UA/UA位點中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性高于未修飾的小干擾核酸，所述的第一片段為 5’ -AGCGCUUAAAGGGCGAGAAGAUU-3’，第二片段為 3’ -UUUCGCGAAUUUCCCGCUCUUCU-5’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小干擾核酸中，除了所述UA/UA位點中的核苷酸以外，其它核苷酸是未經(jīng)過修飾的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾的小干擾核酸，其中，所述UA/UA位點中，只有一個尿嘧啶核苷酸是經(jīng)過修飾的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任意一項所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小干擾核酸為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈分子，所述第一片段和第二片段之間的互補(bǔ)區(qū)域形成雙鏈區(qū)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任意一項所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小干擾核酸包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈和反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈，所述第一片段位于正義鏈，所述第二片段位于反義鏈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任意一項所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小干擾核酸包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈?zhǔn)前▋蓚€或兩個以上的正義鏈部分的不連續(xù)的核苷酸鏈；所述反義鏈為連續(xù)的核苷酸鏈；所述第一片段位于一個或多個正義鏈部分，所述第二片段位于反義鏈。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任意一項所述的修飾的小干擾核酸，其中，該修飾的小干擾核酸為包含核糖核苷酸和至少一個脫氧核糖核苷酸的雜合分子。
8.根據(jù)權(quán)利 要求1-3中的任意一項所述的修飾的小分子干擾核酸，其中，所述修飾為如下的修飾中的至少一種: (1)對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾； (2)對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中核糖的修飾； (3)對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中堿基的修飾。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的修飾的小干擾核酸，其中，所述修飾為對所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中核糖的2’ -OH的修飾。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的修飾的小干擾核酸，其中，所述修飾為所述小分子干擾核酸的核苷酸序列中核糖的2’ -OH被甲氧基或氟取代。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種修飾的小干擾核酸及其制備方法，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能夠形成雙鏈區(qū)域，所述第一片段包含至少一個連續(xù)的UA序列，所述第二片段包含至少一個與所述第一片段的UA序列互補(bǔ)的連續(xù)的UA序列，所述第一片段的UA序列與所述第二片段的UA序列形成UA/UA位點，其特征在于，所述UA/UA位點中的至少一個核苷酸是經(jīng)過修飾的，該修飾使修飾的小干擾核酸的穩(wěn)定性高于未修飾的小干擾核酸，所述的第一片段為5’-AGCGCUUAAAGGGCGAGAAGAUU-3’，第二片段為3’-UUUCGCGAAUUUCCCGCUCUUCU-5’。本發(fā)明在僅引入少量修飾的情況下，即可達(dá)到增加修飾后的小干擾核酸的血清穩(wěn)定性的目的，從而降低了修飾后的小干擾核酸分子的潛在的細(xì)胞毒性，以及修飾對小干擾核酸的生物學(xué)活性的影響。
文檔編號C12N15/113GK103184222SQ20131005214
公開日2013年7月3日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者杜權(quán) 申請人:百奧邁科生物技術(shù)有限公司