一種優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法，為采用含有碳納米材料的玻璃化溶液處理擬南芥幼苗以提高其保存效果，具體包括：裝載液處理、玻璃化溶液處理和液氮保存步驟，其中所述玻璃化溶液含有0.1～0.5g/L石墨烯量子點的MS培養(yǎng)液。本發(fā)明中公開的方法對擬南芥幼苗的保存效果優(yōu)化顯著，通過添加石墨烯量子點作為外源物質對植物玻璃化超低溫保存起到促進作用。
【專利說明】一種優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物或其局部的保存領域，具體涉及一種優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低 溫保存效果的方法。

【背景技術】
[0002] 超低溫保存是上世紀70年代發(fā)展起來的一項現代種質資源離體保存技術。通常 在液氮中保存，被保存材料細胞內的物質代謝和生長活動幾乎完全停止，處在相對穩(wěn)定的 生物學狀態(tài)，達到長期保存種質的目的，超低溫保存是目前唯一不需要連續(xù)繼代的中長期 保存方式。玻璃化法超低溫保存是將細胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護 劑組成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下固化成非結晶的玻 璃化態(tài)，并以這種玻璃態(tài)在低溫下保存。玻璃化法因操作簡單快捷，成本低，適宜保存種類 廣泛，保存材料遺傳性穩(wěn)定，保存效果好等優(yōu)點，是近十年來用于優(yōu)良種質資源中長期保存 的首選方法。
[0003] 在植物及其組織的玻璃化超低溫保存的方法中，采用一些保存方法時，植物及其 組織恢復培養(yǎng)后成活率不高或者根本不能成活；另外采用相同的保存方法時候，不同的植 物及其組織恢復培養(yǎng)后是否能成活及成活率的高低也不盡相同?，F有技術中添加一定的外 源物質有利于提高超低溫保存成活率，但是對于特定的植物和組織選擇何種外源物質才能 提1?其保存效果卻是未知的。
[0004] 擬南芥屬于被子植物門，雙子葉植物綱，其為兩年生草本，擬南芥作為模式植物的 優(yōu)點是植株小、結子多，其還為自花受粉植物，基因高度純合。在超低溫保存領域的研究中， 擬南芥具有重要的地位和研究意義。擬南芥幼苗是非常好的研究材料，在已有的研究中發(fā) 現，擬南芥萌發(fā)60h幼苗可以篩選不同的外源添加物質對于超低溫保存效果的影響，同時 可以作為保存材料研究超低溫保存過程中的分子機理，是一種很重要的生理學和分子生物 學研究材料。


【發(fā)明內容】

[0005] 鑒于以上所述現有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃 化超低溫保存效果的方法，以克服現有技術中擬南芥幼苗超低溫保存恢復生長率低的缺 點，并且優(yōu)化了植物玻璃化超低溫保存的生理生化響應研究。
[0006] 為了實現上述目的或者其他目的，本發(fā)明是通過以下技術方案實現的。
[0007] -種優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法，采用玻璃化超低溫保存的方 法對擬南芥幼苗進行保存，具體步驟如下：
[0008] 1)裝載液處理：室溫下，將擬南芥幼苗在裝載液中浸泡處理20?30分鐘后移除 裝載液；
[0009] 2)玻璃化溶液處理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡處理擬南芥幼苗40?60 分鐘；
[0010] 3)液氣保存：保持擬南介幼苗在玻璃化溶液中浸泡的狀態(tài)，并直于液氣中保存；
[0011] 所述玻璃化溶液為含有〇. 1?〇. 5g/L石墨烯量子點的玻璃化冷凍保護液。
[0012] 本發(fā)明中所述 MS 培養(yǎng)液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 ? 7H20， lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批B多醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨酸， 0. 83mg/L KI,6. 2mg/L H3BO3, 22. 3mg/L MnSO4 ? 4H20, 8. 6mg/L ZnSO4 ? 7H20, 0. 25mg/L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,余量為水。所述 MS 培養(yǎng)液 的pH為5. 8。
[0013] 優(yōu)選地，所述擬南芥幼苗為在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的擬南芥幼苗，在MS培養(yǎng)基 上培養(yǎng)的方法為：將擬南芥種子置于MS固體培養(yǎng)基上，每天先進行光照培養(yǎng)8?12h，光強 100?200 iimol/m2,溫度20?27°C，每天光照培養(yǎng)剩余時間進行黑暗培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)溫度 為20?25°C，循環(huán)每天光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)。
[0014] 本發(fā)明中所述 MS 固體培養(yǎng)基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/ L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20, 440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/ LFeSO4 ? 7H20, lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批卩多醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素， 2mg/L 甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnS04*4H20,8.6mg/L ZnS04*7H20， 0? 25mg/L Na2MoO4 ? 2H20,0? 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0? 025mg/L CoCl2 ? 6H20, 30g/L 蔗糖，IOg/ L瓊脂粉，余量為水。所述MS固體培養(yǎng)基的pH為5. 8。
[0015] 優(yōu)選地，所述擬南芥種子在預培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時間為24?72h。
[0016] 更優(yōu)選地，所述擬南芥種子在預培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時間為60h。
[0017] 本發(fā)明中所述擬南芥種子在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的方法為每天采用光照培養(yǎng)和黑暗 培養(yǎng)交替的形式直至達60h。如，每天先進行8h的光照培養(yǎng)，然后進行16h的黑暗培養(yǎng)，如 此循環(huán)直至第三天再培養(yǎng)12h，第三天的12h為光照培養(yǎng)。
[0018] 優(yōu)選地，室溫下，將擬南芥幼苗在裝載液中浸泡處理20分鐘后移除裝載液。
[0019] 優(yōu)選地，在0°C下使用玻璃化溶液浸泡處理擬南芥幼苗50分鐘。
[0020] 更優(yōu)選地，所述擬南芥幼苗在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的方法為：先進行8h光照培養(yǎng)，光 強100?200 i! mol/m2,溫度25°C;再進行16h黑暗培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)溫度為20°C。更優(yōu)選地， 光強為 150iimol/m2。
[0021] 優(yōu)選地，所述擬南芥種子為先經春化處理過的擬南芥種子，所述春化處理為將所 述擬南芥種子在〇?KTC下放置24?72h。
[0022] 優(yōu)選地，所述春化處理為將所述擬南芥種子在4?6°C下放置40?50h。
[0023] 更優(yōu)選地，所述春化處理為將所述擬南芥種子在4°C下放置48h。
[0024] 優(yōu)選地，所述擬南芥種子在春化處理前先經消毒處理，消毒處理工藝為：將擬南芥 種子用65?75%乙醇浸泡10?30s，再使用無菌水沖洗，然后使用含15?25wt %的NaClO 和0?0. 03wt%的吐溫20的水溶液浸泡5?15分鐘，并使用無菌水沖洗。本發(fā)明中所述 的65?75%乙醇是指乙醇的水溶液，其中百分含量為體積百分含量。
[0025] 更優(yōu)選地，所述消毒處理工藝為：將擬南芥種子用70%乙醇消毒15s，無菌水沖洗 4?6遍，然后使用含15?25wt %的NaClO和0?0. 03wt %的吐溫20的水溶液浸泡10分 鐘，并使用無菌水沖洗5?6遍。
[0026] 更優(yōu)選地，所述消毒處理工藝為：將擬南芥種子用70%乙醇消毒15s，無菌水沖洗 4遍，然后使用含20wt %的NaClO和0. Olwt %的吐溫20的水溶液浸泡10分鐘，并使用無菌 水沖洗6遍。
[0027] 優(yōu)選地，所述裝載液為含有1?2mol/L丙三醇和0? 3?0? 5mol/L蔗糖的MS培養(yǎng) 液。
[0028] 優(yōu)選地，所述擬南芥種子為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥種子如：Arabidopsis thaliana ecotype Col-0 型。
[0029] 優(yōu)選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞 砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L石墨烯量子點的MS培養(yǎng)液。
[0030] 更優(yōu)選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亞砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 3g/L石墨烯量子點的MS培養(yǎng)液。
[0031] 更優(yōu)選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亞砜、0. 4mol/L蔗糖和0. lg/L石墨烯量子點的MS培養(yǎng)液，或所述玻璃化溶液為含有300g/ L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞砜、0. 4mol/L蔗糖和0. 3g/L石墨烯量子點的MS 培養(yǎng)液。
[0032] 本發(fā)明還公開了一種擬南芥幼苗的解凍及再培養(yǎng)方法，所述擬南芥幼苗為采用上 述所述方法保存的擬南芥幼苗，所述擬南芥幼苗的解凍及再培養(yǎng)方法為將擬南芥幼苗從液 氮中取出，先水浴解凍，然后去除玻璃化溶液后用洗滌液洗滌，最后轉入MS固體培養(yǎng)基中 恢復培養(yǎng)。
[0033] 優(yōu)選地，水浴解凍的條件為在30?40°C的水浴中解凍60?120s，用洗滌液洗滌 的工藝為：用洗滌液在室溫下浸泡30?50分鐘，并每隔5?10分鐘換一次洗滌液，所述洗 滌液為含有1. 〇?I. 5mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)液。
[0034] 更優(yōu)選地，水浴解凍的條件為在40°C的水浴中解凍90s，用洗滌液洗滌的工藝為： 用洗滌液在室溫下浸泡40分鐘，并每隔10分鐘換一次洗滌液，所述洗滌液為含有I. 2mol/ L蔗糖的MS培養(yǎng)液。
[0035] 更優(yōu)選地，水浴解凍時采用搖動加速解凍方案。
[0036] 優(yōu)選地，所述再培養(yǎng)方法為將擬南芥幼苗每天先光照培養(yǎng)8?12h，光強100? 200 ii mol/m2,培養(yǎng)溫度為20?27°C，每天中剩余時間采用黑暗培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)溫度為20? 25。。。
[0037] 更優(yōu)選地，所述恢復培養(yǎng)工藝為將擬南芥幼苗每天先光照培養(yǎng)8h，光強 150iimol/m2,培養(yǎng)溫度為25°C，每天中剩余時間采用黑暗培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)溫度為20°C [0038] 更優(yōu)選地，為了證明本發(fā)明中方法的保存效果，采用恢復生長率來統(tǒng)計，具體地， 在恢復培養(yǎng)的第15天統(tǒng)計成活的擬南芥幼苗的數量，并計算恢復生長率，所述恢復生長率 為：成活的幼苗數量/幼苗總數量X 100%。
[0039] 根據納米科學原理，向冷凍保護劑中添加納米材料能夠有效提高冷凍保護劑的粘 度和熱導率，改變冰晶的形成狀況、減少對細胞的傷害。本發(fā)明對擬南芥幼苗，特別是擬南 芥種子萌發(fā)60h幼苗在玻璃化法超低溫保存中，先用裝載液處理，然后采用玻璃化溶液處 理，最后在液氮中超低溫保存，其中玻璃化溶液又為添加了石墨烯量子點的玻璃化溶液，這 種外源物質的添加配合方法中的其他工藝，能夠有效的提高擬南芥幼苗的保存效果。本發(fā) 明中公開的方法對擬南芥幼苗的保存效果優(yōu)化顯著，通過添加石墨烯量子點作為外源物質 對植物玻璃化超低溫保存起到促進作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1為實驗組和對照組中60h擬南芥幼苗超低溫保存恢復生長照片。
[0041] 圖1中左列為對照組中60h擬南芥幼苗超低溫保存恢復生長照片；
[0042] 圖1中右列為實驗組中60h擬南芥幼苗超低溫保存恢復生長照片；
[0043] 圖1中第一排到第三排中玻璃化溶液中添加的石墨烯量子點的含量分別為0. Ig/ L、0.3g/L和 0? 5g/L。

【具體實施方式】
[0044] 以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所揭露的內容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
[0045] 本發(fā)明實施例中所用的擬南芥種子為擬南芥哥倫比亞生態(tài)型種子，Arabidopsis thaliana ecotype Col-0 型。
[0046] 本發(fā)明實施例中實驗試劑的配方如下：
[0047] I) MS 培養(yǎng)液為：MS 培養(yǎng)液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20,440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 ? 7H20， lOOmg/L肌醇，0? 5mg/L煙酸，0? 5mg/L鹽酸批B多醇，0? lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨酸， 0. 83mg/L KI,6. 2mg/L H3BO3, 22. 3mg/L MnSO4 ? 4H20, 8. 6mg/L ZnSO4 ? 7H20, 0. 25mg/L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,余量為水，所述 MS 培養(yǎng)液 的pH為5. 8。
[0048] 2)MS 固體培養(yǎng)基為：MS 固體培養(yǎng)基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/ L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 ? 7H20, 440mg/L CaCl2 ? 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 *7H20, lOOmg/L 肌醇，0. 5mg/L 煙酸，0. 5mg/L 鹽酸批咳醇，0. lmg/L 鹽酸硫胺素，2mg/L 甘氨酸，〇.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4 .41^0,8. 6mg/L ZnSO4 *71120,0.2511^/ L Na2MoO4 ? 2H20,0. 025mg/L CuSO4 ? 5H20,0. 025mg/L CoCl2 ? 6H20,30g/L 蔗糖，lOg/L 瓊脂 粉，余量為水，所述MS固體培養(yǎng)基的pH為5. 8。
[0049] 3)裝載液為：含有2mol/L丙三醇和0. 4mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)液。
[0050] 4)玻璃化溶液為：含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞砜、 0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L石墨烯量子點的MS培養(yǎng)液。
[0051] 5)洗滌液為含有I. 2mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)液。
[0052] 實施例1
[0053] 1)擬南芥幼苗的獲得：將擬南芥種子用70%乙醇消毒15s，無菌水沖洗4遍后再 用含20wt % NaClO和0. Olwt %吐溫20的水溶液消毒10min，無菌水沖洗6遍；然后將消 毒后的種子在4°C春化48h，置于MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為每天光照培養(yǎng)8h，光強 150 ii mol/m2,培養(yǎng)溫度25°C ;然后黑暗培養(yǎng)16h，培養(yǎng)溫度為20°C，總共將種子培養(yǎng)60h，獲 得60h苗齡的擬南芥幼苗。
[0054] 2)將60h擬南芥幼苗分為實驗組和對照組，每個組分別設3個平行實驗，將50株 幼苗放入裝有ImL裝載液的2mL冷凍管中，室溫處理20min ;將裝載液吸除，加入玻璃化溶 液，(TC處理50min ;將冷凍管投入液氮中保存lh。
[0055] 實驗組的玻璃化溶液中分別含有0. Ig/L、0. 3g/L、0. 5g/L的石墨烯量子點。
[0056] 實驗組組1的玻璃化溶液中含有0. lg/L的石墨烯量子點；對照組組1中不含有石 墨烯量子點，其他與實驗組組1相同；
[0057] 實驗組組2的玻璃化溶液中含有0. 3g/L的石墨烯量子點；對照組組2中不含有石 墨烯量子點，其他與實驗組組2相同；
[0058] 實驗組組3的玻璃化溶液中含有0. 5g/L的石墨烯量子點；對照組組3中不含有石 墨烯量子點，其他與實驗組組3相同。
[0059] 3)冷凍管于液氮中保存Ih后，取出冷凍管，快速放入40°C水浴鍋中，解凍90s，并 不時輕輕搖動；將玻璃化溶液吸除，加入洗滌液，室溫處理40min，每隔IOmin換一次洗滌 液；洗滌后的幼苗移到MS固體培養(yǎng)基中，放入植物培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱各項參數同種子萌發(fā)條 件，即每天光照培養(yǎng)8h，光強150 y mol/m2,培養(yǎng)溫度25°C ;然后黑暗培養(yǎng)16h，培養(yǎng)溫度為 20°C ;擬南芥幼苗恢復培養(yǎng)第15天，計算并比較實驗組和對照組內60h擬南芥幼苗的恢復 生長率。
[0060] 實驗組與對照組擬南芥幼苗的恢復生長率見表1。
[0061] 表 1

【權利要求】
1. 一種優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法，其特征在于，采用玻璃化超低 溫保存的方法對擬南芥幼苗進行保存，具體步驟如下： 1) 裝載液處理：室溫下，將擬南芥幼苗在裝載液中浸泡處理20?30分鐘后移除裝載 液； 2) 玻璃化溶液處理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡處理擬南芥幼苗40?60分 鐘； 3) 液氮保存：保持擬南芥幼苗浸泡在玻璃化溶液中的狀態(tài)，并置于液氮中保存； 所述玻璃化溶液為含有〇. 1?〇. 5g/L石墨烯量子點的玻璃化冷凍保護液。
2. 如權利要求1所述優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法，其特征在于， 所述擬南芥幼苗為在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的擬南芥幼苗，在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的 方法為：將擬南芥種子置于MS固體培養(yǎng)基上，每天先進行光照培養(yǎng)8?12h，光強100? 200 μ mol/m2,溫度20?27°C，每天光照培養(yǎng)剩余時間進行黑暗培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)溫度為20? 25°C，循環(huán)每天光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)。
3. 如權利要求2所述優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法，其特征在于，所 述擬南芥種子為先經春化處理過的擬南芥種子，所述春化處理為將所述擬南芥種子在〇? l〇°C下放置24?72h。
4. 如權利要求3所述優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法，其特征在于，所 述春化處理為將所述擬南芥種子在4?6°C下放置40?50h。
5. 如權利要求3所述優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法，其特征在于，所 述擬南芥種子在春化處理前先經消毒處理，消毒處理工藝為：將擬南芥種子用65?75%乙 醇浸泡10?30s，再使用無菌水沖洗，然后使用含15?25wt %的NaCIO和0?0. 03wt %的 吐溫20的水溶液浸泡5?15分鐘，并使用無菌水沖洗。
6. 如權利要求1所述優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法，其特征在于，所 述裝載液為含有1?2mol/L丙三醇和0· 3?0· 5mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)液。
7. 如權利要求1所述優(yōu)化擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存效果的方法，其特征在于，所 述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞砜、0. 4mol/L蔗糖和 0. 1?0. 5g/L石墨烯量子點的MS培養(yǎng)液。
8. -種擬南芥幼苗的解凍及再培養(yǎng)方法，所述擬南芥幼苗為采用如權利要求1?7任 一權利要求所述方法保存的擬南芥幼苗，所述擬南芥幼苗的解凍及再培養(yǎng)方法為將擬南芥 幼苗從液氮中取出，先水浴解凍，然后去除玻璃化溶液后用洗滌液洗滌，最后轉入MS固體 培養(yǎng)基中恢復培養(yǎng)。
9. 如權利要求8所述解凍及再培養(yǎng)方法，其特征在于，水浴解凍的條件為在30?40°C 的水浴中解凍60?120s，用洗滌液洗滌的工藝為：用洗滌液在室溫下浸泡30?50分鐘， 并每隔5?10分鐘換一次洗滌液，所述洗滌液為含有1. 0?1. 5mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)液。
10. 如權利要求8所述解凍及再培養(yǎng)方法，其特征在于，所述再培養(yǎng)方法為將擬南芥幼 苗每天先光照培養(yǎng)8?12h，光強100?200ymol/m 2,培養(yǎng)溫度為20?27°C，每天中剩余 時間采用黑暗培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)溫度為20?25°C。
【文檔編號】A01N3/00GK104255706SQ201410467879
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權日:2014年9月15日
【發(fā)明者】任麗, 陳冠群, 申曉輝, 張荻 申請人:上海交通大學