本發(fā)明涉及細(xì)胞工程中真菌原生質(zhì)體制備與再生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體的制備方法。

背景技術(shù)：

小麥光腥黑粉菌(tilletiafoetidawalle.lindr.)引起的小麥光腥黑穗病(commonbuntofwheat)是一種世界性病害，具有分布廣泛、流行性強(qiáng)，危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響小麥的生產(chǎn)。感病植株通常在外觀上沒有明顯的癥狀，在發(fā)病后期，穎殼略向外張開，整個(gè)麥穗變成病穗，病粒外有一層灰色薄膜，內(nèi)部充滿黑粉，是病原菌的冬孢子，冬孢子有魚腥味，引起小麥產(chǎn)量和品質(zhì)降低。小麥光腥黑粉菌屬于擔(dān)子菌亞門(basidiomycotina)、冬孢菌綱(teliomycetes)、黑粉菌目(ustilaginales)、腥黑粉菌科(tilletiaceae)、腥黑粉菌屬(tilletia)。冬孢子呈褐色，球形或近球形，可隨種子傳播，在土壤中能夠存活多年，一旦條件適宜并遇到大面積的寄主植物，便會(huì)引起發(fā)病。

國內(nèi)外對(duì)于小麥光腥黑穗病的研究主要集中在病原菌生物學(xué)特性以及分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)該病原菌的致病機(jī)制研究較少。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模定點(diǎn)突變的重要方法，利用該技術(shù)能夠改變真菌的遺傳物質(zhì)，研究植物病原菌的的致病機(jī)理。目前，真菌遺傳轉(zhuǎn)化的方法有很多，常見的有聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合以及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化等。原生質(zhì)體是大多數(shù)轉(zhuǎn)化方法的受體細(xì)胞，因此原生質(zhì)體的制備和再生直接關(guān)系到轉(zhuǎn)化能否順利進(jìn)行。獲得產(chǎn)率高、可再生的小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體的制備方法，將為建立該病原菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)，推動(dòng)對(duì)該病原菌致病機(jī)制的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述領(lǐng)域存在的需求，本發(fā)明的目的在于提供一種小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體的制備方法。

本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)菌絲培養(yǎng)：將小麥光腥黑粉菌的冬孢子在水瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-9天后，用滅菌蒸餾水沖洗下來，收集菌液，離心去上清，得到菌絲；

(2)細(xì)胞壁裂解：以氯化鉀溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑，配制混合酶液，加入菌絲中，28℃振蕩酶解1.5-2.5h，即得到小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體；

所述混合酶液包括質(zhì)量百分比濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶。

優(yōu)選地，所述水瓊脂培養(yǎng)基的制備方法為：稱取20g瓊脂粉，加水定容到1l，高壓蒸汽滅菌。

優(yōu)選地，所述小麥光腥黑粉菌冬孢子在水瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。

優(yōu)選地，所述氯化鉀溶液的濃度為1.2mol/l。

優(yōu)選地，所述28℃振蕩酶解的時(shí)間為2h。

優(yōu)選地，所述混合酶液與所述菌絲的配比為20ml：1g。

優(yōu)選地，所述振蕩酶解在180r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述小麥光腥黑粉菌的冬孢子在水瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)的條件為溫度為16℃和相對(duì)濕度為80％。

原生質(zhì)體是許多真菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞，優(yōu)化原生質(zhì)體的制備方法，能更好的建立小麥光腥黑粉菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本發(fā)明以小麥光腥黑粉菌菌株為供試材料，研究了菌株培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞壁裂解酶、酶解時(shí)間和滲透壓穩(wěn)定劑等對(duì)原生質(zhì)體制備的影響，獲得了小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體制備的最佳條件。

菌齡：制備真菌的原生質(zhì)體一般都采用新鮮的菌絲或孢子，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分在不同的生長時(shí)期會(huì)有所不同。小麥光腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)后先產(chǎn)生先菌絲和初生擔(dān)孢子，之后初生擔(dān)孢子h結(jié)合產(chǎn)生侵染菌絲，侵染菌絲既對(duì)小麥有侵染性，又容易被酶解。培養(yǎng)時(shí)間過短，產(chǎn)生的先菌絲和擔(dān)孢子相對(duì)比較幼嫩，在原生質(zhì)體釋放后容易受到酶的作用而破裂，降低原生質(zhì)體得率；培養(yǎng)時(shí)間過長，菌絲細(xì)胞壁老化、成分改變，酶系統(tǒng)對(duì)其作用不顯著，原生質(zhì)體得率較低。因此，小麥光腥黑粉菌冬孢子的培養(yǎng)時(shí)間直接影響原生質(zhì)體數(shù)量。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在水瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的小麥光腥黑粉菌最適宜制備原生質(zhì)體，產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量最多。

裂解酶及酶解時(shí)間：真菌細(xì)胞壁成分復(fù)雜多樣，在原生質(zhì)體制備中，用于裂解細(xì)胞壁的酶的種類及酶解時(shí)間，對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)出率有非常重要的影響。酶解時(shí)間過短，細(xì)胞壁破解不完全，許多原生質(zhì)體不能從菌絲上分離下來，使原生質(zhì)體產(chǎn)率降低；時(shí)間過長，酶對(duì)得到的原生質(zhì)膜傷害作用過大，容易造成原生質(zhì)體的破裂，也會(huì)降低原生質(zhì)體的產(chǎn)率。擔(dān)子菌菌絲的細(xì)胞壁主要成分是幾丁質(zhì)和葡聚糖。本發(fā)明采用崩潰酶、溶壁酶和蝸牛酶對(duì)小麥光腥黑粉菌細(xì)胞壁進(jìn)行溶解實(shí)驗(yàn)，其中崩潰酶是含有木聚糖酶、昆布多糖酶、及纖維素酶等的復(fù)合酶；溶壁酶具有幾丁質(zhì)酶、纖維素酶及蛋白酶等活性；蝸牛酶中含有纖維素酶、果膠酶、葡糖酸酶、幾丁質(zhì)酶和脂酶等多種酶。結(jié)果表明，一種酶或者兩種酶都不能很好地溶解小麥光腥黑粉菌細(xì)胞壁，本發(fā)明采用質(zhì)量濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶的復(fù)合酶液，在28℃振蕩條件下對(duì)菌體細(xì)胞壁酶解2h后，獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)率最高。

滲透壓穩(wěn)定劑：滲透壓穩(wěn)定劑可以保護(hù)細(xì)胞膜使其不受裂解酶過度破壞，對(duì)原生質(zhì)體起到保護(hù)作用，能影響原生質(zhì)體的制備和再生。滲透壓穩(wěn)定劑通常包括有機(jī)和無機(jī)兩種，針對(duì)不同的真菌，作用效果不同。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，以1.2mol/l的kcl為滲透壓穩(wěn)定劑，所得的小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體數(shù)量最多，且釋放的原生質(zhì)體能夠均勻散亂分布，不聚集成堆。

綜上，采用本發(fā)明的方法制備小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體，產(chǎn)量高達(dá)17.0×10⁵～18.0×10⁵個(gè)/ml，且釋放的原生質(zhì)體均勻散亂分布，不聚集成堆。得到的原生質(zhì)體可以在tb3培養(yǎng)基上長出較多單菌落，可用于小麥光腥黑粉菌的原生質(zhì)體再生。

附圖說明

圖1為小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體的釋放過程，

其中，a：在酶解初始階段，菌絲細(xì)胞開始向內(nèi)凹陷成念珠狀；b：隨著酶解進(jìn)行，細(xì)胞壁逐漸被降解，原生質(zhì)體釋放出來，呈圓形透明的小球；c：有的原生質(zhì)體會(huì)連在一起；d：最后菌絲酶解完全，大量的原生質(zhì)體釋放出來。

圖2為菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成的影響，

其中，橫坐標(biāo)為菌體的培養(yǎng)天數(shù)，縱坐標(biāo)為原生質(zhì)體數(shù)量(×10⁵個(gè)/ml)。

圖3為不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，

其中，橫坐標(biāo)為酶解時(shí)間(小時(shí))，縱坐標(biāo)為原生質(zhì)體數(shù)量(×10⁵個(gè)/ml)。

圖4為不同滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，

其中，橫坐標(biāo)為不同的滲透壓穩(wěn)定劑，縱坐標(biāo)為原生質(zhì)體數(shù)量(×10⁵個(gè)/ml)。

圖5為使用不同滲透壓穩(wěn)定劑制備的原生質(zhì)體釋放后的狀態(tài)，

其中，a：以山梨醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，所釋放的原生質(zhì)體易聚集分布，箭頭所示為原生質(zhì)體；b：以蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑，很多原生質(zhì)體聚集在一起，箭頭所示為原生質(zhì)體；c：以mgso4為滲透壓穩(wěn)定劑，原生質(zhì)體釋放后分散分布，箭頭所示為原生質(zhì)體；d：以kcl為滲透壓穩(wěn)定劑，原生質(zhì)體釋放后分散分布，箭頭所示為原生質(zhì)體。

圖6為小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體的再生，

其中，左側(cè)為tb3培養(yǎng)基，右側(cè)為pda培養(yǎng)基。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，需要理解的是，下述實(shí)施例僅作為解釋和說明，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

生物材料

小麥光腥黑粉菌：本發(fā)明所使用的小麥光腥黑粉菌為現(xiàn)有文獻(xiàn)《小麥光腥黑穗菌萌發(fā)的超微結(jié)構(gòu)研究》，西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，03期(3)：110-112所記載的菌株。

上述生物材料本實(shí)驗(yàn)室亦有保存，申請(qǐng)人聲明可自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

主要試劑

溶壁酶(lysingenzyme)，購于sigma公司，貨號(hào)：sigml1412；

崩潰酶(driselase)，購于sigma公司，貨號(hào)：d9515；

蝸牛酶(snailase)，購于上海生化所，貨號(hào)：d2412；

pda粉末，購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)：02-023；

硫酸鎂，購于北京化工廠，貨號(hào)：34156-69-9；

氯化鉀，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：7447-40-7；

山梨醇，購于amresco公司，貨號(hào)：0691-500g；

蔗糖，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：57-50-1。

培養(yǎng)基

2％水瓊脂培養(yǎng)基制備方法：稱取20g瓊脂粉，加水定容到1l，121℃高壓蒸汽滅菌。

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(pda)：稱取pda粉末37g，加水定容到1l，121℃高壓蒸汽滅菌。

tb3培養(yǎng)基：酵母提取物3g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖200g，酵母粉10g，加水定容到1l，121℃高壓蒸汽滅菌。

下述實(shí)施例中未特別說明的生物化學(xué)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法配制而得或商購獲得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級(jí)。

實(shí)施例1：小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體制備方法的優(yōu)化

將小麥光腥黑粉菌的冬孢子在2％的水瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度16℃，相對(duì)濕度為80％，選取不同培養(yǎng)天數(shù)的菌體用滅菌蒸餾水沖洗下來，收集菌液并過濾，5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，分別加入20ml不同種類的復(fù)合酶液，28℃，180r/min振蕩酶解，每隔半小時(shí)用血球計(jì)數(shù)板觀察原生質(zhì)體得率，篩選出最適宜原生質(zhì)體制備的菌齡、酶解時(shí)間、酶解體系、滲透壓穩(wěn)定劑。

1、菌體培養(yǎng)時(shí)間

在水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)小麥光腥黑粉菌的冬孢子，溫度16℃，相對(duì)濕度為80％，4d后開始萌發(fā)長出先菌絲，5d后先菌絲上長出初生擔(dān)孢子，初生擔(dān)孢子h型融合，之后長出侵染絲和次生擔(dān)孢子。選取不同生長階段(6d、7d、8d、9d)的菌體，用滅菌蒸餾水沖洗下來，過濾，5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，加入20ml用1.2m氯化鉀溶液配制的質(zhì)量濃度為1.5％崩潰酶，1.5％溶壁酶和1.5％蝸牛酶的復(fù)合酶液，28℃，180r/min振蕩酶解1.5h，觀察并記錄原生質(zhì)體獲得量，選出最適宜制備原生質(zhì)體的菌體培養(yǎng)時(shí)間。

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，培養(yǎng)7d后的侵染菌絲用作初始材料進(jìn)行酶解，比較容易得到原生質(zhì)體，且酶解相同時(shí)間后得到的原生質(zhì)體數(shù)量最多，為17.0×10⁵個(gè)/ml。

2、細(xì)胞壁裂解酶

用1.2m的氯化鉀溶液分別配制質(zhì)量濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶，研究單一酶和不同組合的酶液對(duì)小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。

在水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)小麥光腥黑粉菌的冬孢子，溫度16℃，相對(duì)濕度為80％，選取培養(yǎng)8天的菌絲，用滅菌蒸餾水沖洗下來，收集菌液并過濾，5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，分別加入20ml單種酶和不同組合的酶液，28℃，180r/min振蕩酶解1.5h，觀察并記錄原生質(zhì)體獲得量。

結(jié)果如表1所示，原生質(zhì)體的產(chǎn)量受細(xì)胞壁裂解酶的種類和濃度的影響較大，且混合酶的作用效率高于單一酶。在單個(gè)酶作用時(shí)，1.5％的崩潰酶得到的小麥光腥黑粉菌的原生質(zhì)體數(shù)量最多，為3.2×10⁵個(gè)/ml；1.5％的蝸牛酶得到的原生質(zhì)體數(shù)量最少，為2.4×10⁵個(gè)/ml；兩種酶組合時(shí)，原生質(zhì)體的數(shù)量與單種酶相比有所提高；三種酶混合時(shí)，得到的原生質(zhì)體最多。因此，在小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體的制備中，選擇崩潰酶、溶壁酶和蝸牛酶三種酶混合效果較好。

表1不同裂解酶組合對(duì)小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

3、酶解時(shí)間

酶解時(shí)間影響原生質(zhì)體的獲得率和再生，因此確定合適的酶解時(shí)間至關(guān)重要。用1.2m的氯化鉀溶液配制質(zhì)量濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶的復(fù)合酶液，備用。

在水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)小麥光腥黑粉菌的冬孢子，溫度16℃，相對(duì)濕度為80％，選取培養(yǎng)8天的菌絲，用滅菌蒸餾水沖洗下來，收集菌液并過濾，5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，加入20ml配制好的復(fù)合酶液，28℃搖床中180r/min振蕩酶解，設(shè)置酶解時(shí)間分別為0.5h、1h、1.5h、2h、2.5、3h，顯微鏡檢觀察是否獲得原生質(zhì)體以及原生質(zhì)體的數(shù)量。

結(jié)果如圖3所示，在酶解0.5h時(shí)原生質(zhì)體數(shù)量較少，很多菌絲的細(xì)胞壁雖然被不同程度的破壞，但大多數(shù)還沒有破解完全，原生質(zhì)體還沒有從菌絲上分離下來；之后隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體的數(shù)量也增加，2h時(shí)達(dá)到最大值，為17.6×10⁵個(gè)/ml；繼續(xù)酶解，原生質(zhì)體的數(shù)量減少。

4、滲透壓穩(wěn)定劑

本實(shí)驗(yàn)分別選擇1.2mol/l的mgso4、kcl、d-山梨醇、蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑，觀察不同滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體制備的影響。

在水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)小麥光腥黑粉菌的冬孢子，溫度16℃，相對(duì)濕度為80％，選取培養(yǎng)8天的菌絲，用滅菌蒸餾水沖洗下來，收集菌液并過濾，5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，分別加入20ml不同滲透壓穩(wěn)定劑配制的質(zhì)量濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶的復(fù)合酶液，28℃搖床中180r/min振蕩酶解1.5h，記錄原生質(zhì)體的數(shù)量。

如圖4和圖5所示，不同類型的滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體制備的影響不同，在所選的四中滲透壓穩(wěn)定劑中，相同條件的處理下，無機(jī)溶劑比有機(jī)溶劑原生質(zhì)體得率更高，且以山梨醇和蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑所得到的原生質(zhì)體易聚集，采用氯化鉀作為滲透壓穩(wěn)定劑，得到原生質(zhì)體最多，為12.1×10⁵個(gè)/ml，且原生質(zhì)體不會(huì)聚集成堆。

實(shí)施例2：采用優(yōu)化后的方法制備小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體

用1.2mol/l的氯化鉀配制質(zhì)量濃度為1.5％的崩潰酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蝸牛酶的復(fù)合酶液。然后按照如下步驟制備原生質(zhì)體：

(1)菌絲培養(yǎng)：在2％水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)小麥光腥黑粉菌的冬孢子7d，培養(yǎng)條件為溫度16℃，相對(duì)濕度80％，然后將萌發(fā)的冬孢子用滅菌蒸餾水沖洗下來后，收集菌液。

(2)酶解菌絲細(xì)胞壁：將收集的菌液過濾，然后5000r/min離心10min去上清，取1g菌絲，加入20ml復(fù)合酶液，28℃，180r/min，振蕩酶解2h，將酶解液過濾，5000r/min離心10min，即得到小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體。

結(jié)果表明，采用本發(fā)明優(yōu)化的方法制備小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體，原生質(zhì)體得率可達(dá)到17.0×10⁵～18.0×10⁵個(gè)/ml。

小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體的釋放過程如圖1所示，在酶解初始階段，菌絲細(xì)胞開始向內(nèi)凹陷成念珠狀(圖中1a)，隨著酶解進(jìn)行，細(xì)胞壁逐漸被降解，原生質(zhì)體釋放出來，呈圓形透明的小球(圖1中b),有的原生質(zhì)體會(huì)連在一起(圖1中c)，最后菌絲酶解完全，大量的原生質(zhì)體釋放出來(圖1中d)，成游離狀態(tài)，均勻分散。

實(shí)施例3：小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體的再生

將實(shí)施例1和2制備得到的原生質(zhì)體分別用1.2mol/l的氯化鉀重新懸浮后，分別涂布在pda和tb3固體培養(yǎng)基中，16℃培養(yǎng)4天，觀察長出的單菌落。

結(jié)果如圖6所示，小麥光腥黑粉菌的原生質(zhì)體在tb3培養(yǎng)基上長出較多單菌落，而pda培養(yǎng)基上無單菌落長出，因此，tb3培養(yǎng)基比pda培養(yǎng)基更適合原生質(zhì)體再生，可用于小麥光腥黑粉菌原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)。