一種快速培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)方法存在的菌絲生長速度極慢的問題。該培養(yǎng)基包括新鮮黃綠蜜環(huán)菌子實體，該方法包括黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基制作方法以及黃綠蜜環(huán)菌接種與菌絲體培養(yǎng)。采用此方法培養(yǎng)的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生長良好，菌絲生長速度快。
【專利說明】一種快速培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于菌株培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]黃綠蜜環(huán)菌又名黃蘑菇、黃環(huán)菇、黃金菇等。屬菌物界，擔(dān)子菌門，傘菌綱，傘菌亞綱，傘菌目，傘菌科。學(xué)名-Armillaria luteo-virens。為青藏高原真菌資源寶庫中的代表種之一。黃綠蜜環(huán)菌具有較高的食用、營養(yǎng)和藥用價值，被譽為最具開發(fā)利用前景的珍稀名菌之一，黃綠蜜環(huán)菌味道鮮美、營養(yǎng)豐富、價格昂貴，過度采摘使其瀕臨滅絕。目前不能進行人工栽培。
[0003]為了有效的保護傳統(tǒng)珍稀真菌資源，人們進行了黃綠蜜環(huán)菌菌絲體分離及培養(yǎng)研究。黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)雖有報道，但菌絲生長速度極慢，需4個月之久。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種快速培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的培養(yǎng)基，以解決現(xiàn)有黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)方法存在的菌絲生長速度極慢的問題。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供一種快速培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的培養(yǎng)方法。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案如下:一種快速培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的培養(yǎng)基，由下述重量份的原料制成:馬鈴薯150.0份-200.0份、葡萄糖5.0份-10.0份、麥芽糖2.5份-5.0份、酵母浸膏 1.0 份-2.0 份、蛋白胨 1.0 份-2.0 份、KH2PO4 1.0 份-2.0 份、K2HPO4 1.0 份-2.0份、MgSO4 0.5份-1.0份、黃綠蜜環(huán)菌子實體100.0份-200.0份、瓊脂15.0份-20.0份，加水 1000.0ml, pH 值為 6.9。
[0007]優(yōu)選的，一種快速培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的培養(yǎng)基，由下述重量份的原料制成:馬鈴薯200.0份、葡萄糖10.0份、麥芽糖5.0份、酵母浸膏2.0份、蛋白胨2.0份、KH2PO4
1.0份、K2HPO4 1.0份、MgSO4 0.5份和黃綠蜜環(huán)菌子實體200.0份、瓊脂20.0份，加水1000.0ml, pH 值為 6.9。
[0008]用上述黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的方法，它包括如下步驟:A、黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基制作:
a.黃綠蜜環(huán)菌濾液的制備:先將新鮮黃綠蜜環(huán)菌子實體或風(fēng)干黃綠蜜環(huán)菌子實體加水打成糊狀，過濾，汁液留用；濾渣再次加水打漿,過濾，汁液留用；合并2次汁液備用；
b.馬鈴薯濾液的制備:馬鈴薯洗凈去皮、去芽眼，切片，加水煮至酥而不爛，濾液備用；
c.將瓊脂粉用冷水調(diào)成糊狀，加水調(diào)勻，煮至瓊脂粉全部熔化，制成瓊脂液；d.將瓊脂液與黃綠蜜環(huán)菌濾液和馬鈴薯濾液混合，加水至1000ml，加入培養(yǎng)基配方中剩余成分，攪拌煮沸溶化，成為黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基。
[0009]B、黃綠蜜環(huán)菌接種與菌絲體培養(yǎng):
將黃綠蜜環(huán)菌子實體放入體積濃度為0.1%的升汞溶液中浸泡10-20秒，滅菌，用無菌水沖洗，用滅菌接種刀切取菌柄與菌蓋結(jié)合處的組織塊，以無菌操作方式接種于滅菌后的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿上，18-28°C條件下培養(yǎng)；30h后組織塊上有菌絲萌發(fā)，3-6天菌絲開始生長；培養(yǎng)8-10天，菌絲在培養(yǎng)基上定值；無菌操作方法移出組織塊，讓菌絲體繼續(xù)在原培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)25天，菌落有2cm時轉(zhuǎn)接到試管黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基上；22-28°C培養(yǎng)I個月，菌絲體可長滿試管，成為黃綠蜜環(huán)菌母種。
[0010]優(yōu)選的，上述步驟B中滅菌后的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿的制作過程如下:e.將步驟d中的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基倒入三角瓶或試管中，塞入塞子密封；
f.將上述盛有培養(yǎng)基的三角瓶或試管進行高壓蒸汽滅菌；0.05mp時放冷氣，繼續(xù)升溫到56°C,壓力0.017mpa,維持30min,自然降溫,壓力降到Ompa時,打開滅菌器蓋；取出三角瓶或試管，置于37°C溫箱中孵化24h ;再次重復(fù)上述滅菌程序，如此重復(fù)三次，完成黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基滅菌工作；
g.黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿制作:將滅菌的平皿放入無菌操作臺，將步驟f滅菌后的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基無菌操作倒入滅菌的平皿中，冷卻，培養(yǎng)基凝固后倒置放置；
h.黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基試管制作:將盛有培養(yǎng)基的試管趁熱放置成斜面，斜面長度約為試管長度的2/3，冷卻，培養(yǎng)基凝固后進行無菌檢驗。
[0011]新鮮黃綠蜜環(huán)菌子實體Clr?i77aria luteo-virens)的來源:采摘于中國青海省海北州剛察縣哈爾蓋鎮(zhèn)貢貢嗎村金銀灘草地。
[0012]本發(fā)明優(yōu)點如下:1.本發(fā)明黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基組方中加入了黃綠蜜環(huán)菌子實體，菌絲體培養(yǎng)效果特別好，生長速度快，做為進一步研究的試驗材料和栽培試驗的目種用；2.黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基滅菌方法獨特、巧妙、滅菌效果可靠；3.黃綠蜜環(huán)菌接種與菌絲體培養(yǎng)方法簡單。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是黃綠蜜環(huán)菌在本發(fā)明培養(yǎng)基上20天菌絲體生長情況圖；
圖2是黃綠蜜環(huán)菌在PDA培養(yǎng)基上20天菌絲體生長情況圖。

【具體實施方式】
[0014]實施例1
培養(yǎng)基組成如下:馬鈴薯200.0g、葡萄糖10.0g、麥芽糖5.0g、酵母浸膏2.0g、蛋白胨
2.0g、KH2PO4 1.0g、K2HPO4 1.0g、MgSO4 0.5g、黃綠蜜環(huán)菌子實體 200.0g、瓊脂 20.0g，加水1000.0ml, pH 值為 6.9。
[0015]黃綠蜜環(huán)菌接種與菌絲體培養(yǎng):將新鮮黃綠蜜環(huán)菌子實體放入體積濃度為0.1%的升汞溶液中浸泡10秒滅菌，無菌水沖洗，無菌紗布吸干多余水分。用滅菌接種刀切取菌柄與菌蓋結(jié)合處的組織塊，以無菌操作方式接種于黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿上，18°c條件下培養(yǎng)。30h后組織塊上有菌絲萌發(fā)，3-6天菌絲開始生長。培養(yǎng)8天，菌絲在培養(yǎng)基上定值。無菌操作方法移出組織塊，讓菌絲體繼續(xù)在原培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)25天，菌落有2cm時轉(zhuǎn)接到試管黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基上。22°C培養(yǎng)I個月，菌絲體可長滿試管，成為黃綠蜜環(huán)菌母種，留作深層培養(yǎng)或進一步研究之用。
[0016]實施例2
培養(yǎng)基組成如下:馬鈴薯150.0g、葡萄糖5.0g、麥芽糖2.5g、酵母浸膏l(xiāng).0g、蛋白胨1.0g、KH2PO4 2.0g、K2HPO4 2.0g、MgSO4 1.0g、黃綠蜜環(huán)菌子實體 100.0g、瓊脂 15.0g，加水1000.0ml, pH 值為 6.9。
[0017]黃綠蜜環(huán)菌接種與菌絲體培養(yǎng):將新鮮黃綠蜜環(huán)菌子實體放入體積濃度為0.1%的升汞溶液中浸泡20秒滅菌，無菌水沖洗，無菌紗布吸干多余水分。用滅菌接種刀切取菌柄與菌蓋結(jié)合處的組織塊，以無菌操作方式接種于黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿上，280C條件下培養(yǎng)。30h后組織塊上有菌絲萌發(fā)，3-6天菌絲開始生長。培養(yǎng)10天，菌絲在培養(yǎng)基上定值。無菌操作方法移出組織塊，讓菌絲體繼續(xù)在原培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)25天，菌落有2cm時轉(zhuǎn)接到試管黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基上。28°C培養(yǎng)I個月，菌絲體可長滿試管，成為黃綠蜜環(huán)菌母種，留作深層培養(yǎng)或進一步研究之用。
[0018]實施例3
培養(yǎng)基組成如下:馬鈴薯180.0g、葡萄糖8.0g、麥芽糖3.5g、酵母浸膏1.5g、蛋白胨1.5g、KH2PO4 1.5g、K2HPO4 1.5g、MgSO4 0.8g、黃綠蜜環(huán)菌子實體 100.0g、瓊脂 18.0g，加水1000.0ml, pH 值為 6.9。
[0019]黃綠蜜環(huán)菌接種與菌絲體培養(yǎng):將新鮮黃綠蜜環(huán)菌子實體放入體積濃度為0.1%的升汞溶液中浸泡15秒滅菌，無菌水沖洗，無菌紗布吸干多余水分。用滅菌接種刀切取菌柄與菌蓋結(jié)合處的組織塊，以無菌操作方式接種于黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿上，230C條件下培養(yǎng)。30h后組織塊上有菌絲萌發(fā)，3-6天菌絲開始生長。培養(yǎng)9天，菌絲在培養(yǎng)基上定值。無菌操作方法移出組織塊，讓菌絲體繼續(xù)在原培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)25天，菌落有2cm時轉(zhuǎn)接到試管黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基上。25°C培養(yǎng)I個月，菌絲體可長滿試管，成為黃綠蜜環(huán)菌母種，留作深層培養(yǎng)或進一步研究之用。
[0020]上述實施例1-3中黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基制作如下:
a.黃綠蜜環(huán)菌濾液的制備:先將新鮮黃綠蜜環(huán)菌子實體或風(fēng)干黃綠蜜環(huán)菌子實體加水用打漿機打成糊狀，過濾，汁液留用。濾渣再次加入200ml水打漿，過濾，汁液留用。合并2次汁液備用。
[0021]b.馬鈴薯濾液的制備:馬鈴薯洗凈去皮、去芽眼，切成0.5X2X3的薄片，加水500ml煮至酥而不爛，濾液備用；
c.將瓊脂粉用冷水調(diào)成糊狀，加水調(diào)勻，文火或水浴煮至瓊脂粉全部熔化，制成瓊脂液。將瓊脂液與黃綠蜜環(huán)菌濾液和馬鈴薯濾液混合，加水至1000ml，加入培養(yǎng)基配方中剩余成分，攪拌煮沸溶化，成為黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基。
[0022]d.將上述黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基倒入三角瓶，塞上棉塞，2層牛皮紙包裹?；虻谷朐嚬苤?，塞入棉塞或硅膠膠塞。
[0023]黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿的制作過程如下:
e.黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基滅菌方法:將上述盛有培養(yǎng)基的三角瓶或試管進行高壓蒸汽滅菌。0.05mp時放冷氣,繼續(xù)升溫到56°C (0.017mpa),維持30min,自然降溫,壓力降到Ompa時，打開滅菌器蓋。取出三角瓶或試管，置于37°C溫箱中孵化24h。再次重復(fù)上述滅菌程序，如此重復(fù)三次，完成黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基滅菌工作。
[0024]f.黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿制作:將滅菌的平皿放入無菌操作臺，將黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)以基無菌操作倒入滅菌平皿，冷卻，培養(yǎng)基凝固后倒置放置。無菌檢驗合格后方可使用。
[0025]g.黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基試管制作:將盛有培養(yǎng)基的試管趁熱放置成斜面，斜面長度約為試管長度的2/3，冷卻，培養(yǎng)基凝固后進行無菌檢驗，合格后方可使用。
[0026]實施例培養(yǎng)物的效果試驗如下:
圖1示出了黃綠蜜環(huán)菌在本發(fā)明培養(yǎng)基上菌絲體20天的生長情況，菌落直徑為
2.0cmm。圖2示出了黃綠蜜環(huán)菌在PDA培養(yǎng)基上菌絲體生長20天的情況，接種塊未萌發(fā)，菌絲體未生長。結(jié)果表明:用本發(fā)明方法培養(yǎng)的菌絲體生長效果特別好，生長速度快，菌絲體粗壯、潔白、生長有力，可做為進一步研究的試驗材料和栽培試驗的目種用。
【權(quán)利要求】
1.一種快速培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的培養(yǎng)基，其特征在于其由下述重量份的原料制成:馬鈴薯150.0份-200.0份、葡萄糖5.0份-10.0份、麥芽糖2.5份-5.0份、酵母浸膏1.0 份-2.0 份、蛋白胨 1.0 份-2.0 份、KH2PO4 1.0 份-2.0 份、K2HPO4 1.0 份-2.0 份、MgSO40.5 份-1.0 份、黃綠蜜環(huán)菌子實體(Armillaria luteo-virens) 100.0 份-200.0 份、瓊脂15.0 份-20.0 份，加水 1000.0ml, pH 值為 6.9。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的培養(yǎng)基，其特征在于其由下述重量份的原料制成: 馬鈴薯200.0份、葡萄糖10.0份、麥芽糖5.0份、酵母浸膏2.0份、蛋白胨2.0份、KH2PO4 1.0份、K2HPO4 1.0份、MgSO4 0.5份和黃綠蜜環(huán)菌子實體200.0份、瓊脂20.0份，加水 1000.0ml, pH 值為 6.9。
3.用權(quán)利要求1的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的方法，其特征在于它包括如下步驟: A、黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基制作: a.黃綠蜜環(huán)菌濾液的制備:先將新鮮黃綠蜜環(huán)菌子實體或風(fēng)干黃綠蜜環(huán)菌子實體加水打成糊狀，過濾，汁液留用；濾渣再次加水打漿,過濾，汁液留用；合并2次汁液備用； b.馬鈴薯濾液的制備:馬鈴薯洗凈去皮、去芽眼，切片，加水煮至酥而不爛，濾液備用； c.將瓊脂粉用冷水調(diào)成糊狀，加水調(diào)勻，煮至瓊脂粉全部熔化，制成瓊脂液；d.將瓊脂液與黃綠蜜環(huán)菌濾液和馬鈴薯濾液混合，加水至1000ml，加入培養(yǎng)基配方中剩余成分，攪拌煮沸溶化，成為黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基。
4.B、黃綠蜜環(huán)菌接種與菌絲體培養(yǎng): 將黃綠蜜環(huán)菌子實體放入體積濃度為0.1%的升汞溶液中浸泡10-20秒，滅菌，用無菌水沖洗，用滅菌接種刀切取菌柄與菌蓋結(jié)合處的組織塊，以無菌操作方式接種于滅菌后的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿上，18_28°C條件下培養(yǎng)；30h后組織塊上有菌絲萌發(fā)，3-6天菌絲開始生長；培養(yǎng)8-10天，菌絲在培養(yǎng)基上定值；無菌操作方法移出組織塊，讓菌絲體繼續(xù)在原培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)25天，菌落有2cm時轉(zhuǎn)接到試管黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基上；22-28°C培養(yǎng)I個月，菌絲體可長滿試管，成為黃綠蜜環(huán)菌母種。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌菌絲體的方法，其特征在于:步驟B中所述的滅菌后的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿的制作過程如下: e.將步驟d中的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基倒入三角瓶或試管中，塞入塞子密封； f.將上述盛有培養(yǎng)基的三角瓶或試管進行高壓蒸汽滅菌；0.05mp時放冷氣，繼續(xù)升溫到56°C,壓力0.017mpa,維持30min,自然降溫,壓力降到Ompa時,打開滅菌器蓋；取出三角瓶或試管，置于37°C溫箱中孵化24h ;再次重復(fù)上述滅菌程序，如此重復(fù)三次，完成黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基滅菌工作； g.黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基平皿制作:將滅菌的平皿放入無菌操作臺，將步驟f滅菌后的黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基無菌操作倒入滅菌的平皿中，冷卻，培養(yǎng)基凝固后倒置放置； h.黃綠蜜環(huán)菌菌絲體培養(yǎng)基試管制作:將盛有培養(yǎng)基的試管趁熱放置成斜面，斜面長度約為試管長度的2/3，冷卻，培養(yǎng)基凝固后進行無菌檢驗。
【文檔編號】C05G3/00GK104230566SQ201410467677
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】路等學(xué), 秦波, 金輝, 趙玉卉, 韓融冰 申請人:甘肅省科學(xué)院生物研究所