從黃綠蜜環(huán)菌中提取麥角甾醇過氧化物的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物化學(xué)及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種從黃綠蜜環(huán)菌中提取麥 角醬醇過氧化物的方法，W及該麥角醬醇過氧化物在制備抗肝癌藥物、抗肺癌藥物中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃綠蜜環(huán)菌(41'111；[11日1'1日1111日0-1'；[￥日]13)，又名黃磨茹、金磨茹、黃環(huán)菌，隸屬于擔(dān) 子菌亞口、層菌綱、傘菌目、白磨科、蜜環(huán)菌屬。黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體中等大，菌蓋扁半球形至 平展，直徑5-12cm，菌蓋邊緣內(nèi)卷，表皮開裂形成近環(huán)狀排列的纖毛狀后憐片。菌權(quán)近似菌 蓋色，稍密，彎生，不等長。菌柄柱形，莖部膨大，長2-lOcm，直徑2-2.5cm，白色或或帶黃色， 內(nèi)實(shí)。菌環(huán)中位，單層，菌環(huán)W上為白色，菌環(huán)W下為黃色鱗片。在顯微鏡下觀察，擔(dān)抱子楠 圓形，無色至微黃色，淀粉質(zhì)，擔(dān)抱子棒狀，無色，具4個抱子，菌絲具明顯鎖狀聯(lián)合。菌絲分 布在±壤5-10(：111。該菌夏秋季生于針葉林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌絲可與主 要植被為嵩草和高山雜類草等形成菌根。在牧草生長季節(jié)，由黃綠蜜環(huán)菌菌絲頂端生長，在 草地上形成或大或小的圓圈、半圓或條帶狀的磨茹圈。圈的寬度大約為50cm，圈的直徑大約 6cm左右(周連玉.黃綠蜜環(huán)菌的研究概述.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)[J].2010,16(3) :52-54)。
[0003] 國內(nèi)對黃綠蜜環(huán)菌營養(yǎng)成分進(jìn)行了初步分析，富含氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖多膚等營 養(yǎng)和藥用成分，具有較高的保健和藥用價(jià)值。但目前的蜜環(huán)菌制劑主要W初提混合物為原 料，如郭順星等在"蜜環(huán)菌的化學(xué)成分及應(yīng)用研究"（微生物學(xué)通報(bào)[J]. 1996,23(4) :239- 240)中提出：蜜環(huán)菌糖漿W蜜環(huán)菌培養(yǎng)液(菌絲連同發(fā)酵液)為主要原料，煮沸濃縮制成，主 治眩暈頭痛，神經(jīng)衰弱，失眠，美尼爾綜合癥;蜜環(huán)菌浸膏W菌絲體為原料，煮沸、過濾，殘?jiān)?醇析，醇析物與濾液合并濃縮制成，用于治療血管性頭痛、神經(jīng)衰弱、冠屯、病、腦動脈血管硬 化等?。幻郗h(huán)菌片W菌絲體烤干后磨成細(xì)粉壓片而成，對高膽固醇血癥、高甘油Ξ醋血癥、 降低血壓有一定效果。由于蜜環(huán)菌制劑成分一般為混合物，缺乏必要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥 效研究，所W其缺乏合理的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，難W確保臨床用藥的有效性、安全性、可持續(xù)性。 可見，對黃綠蜜環(huán)菌的化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步提取和研究非常有必要。
[0004] 麥角醬醇過氧化物是黃綠蜜環(huán)菌中一種重要的植物醬醇類物質(zhì)。目前對該化合物 的提取步驟繁瑣，重復(fù)性不高，且得率低，制備量小，僅能滿足實(shí)驗(yàn)室研究需求。而對該化合 物的研究，多用于生化方面，對其抗癌的藥理活性研究鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從黃綠蜜環(huán)菌 中提取麥角醬醇過氧化物的方法，該方法采用離線高效液相色譜進(jìn)行分離純化，分離方法 穩(wěn)定，重復(fù)性高，制備量大，得到的麥角醬醇過氧化物純度可達(dá)98% W上;且使用該方法制 備麥角醬醇過氧化物提取率高，每公斤原料可達(dá)目的產(chǎn)物30mg，相比現(xiàn)有技術(shù)提取率高，操 作簡單省時，能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種從黃綠蜜環(huán)菌中提取麥角醬醇過氧化物的方法，該方法包括W下步驟：
[0008] (1)W黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體為原料，經(jīng)干燥并磨成粉末狀后，用乙酸乙醋W液固比 (5-10)mL:lg進(jìn)行浸泡，然后過濾取上清，得到乙酸乙醋提取液，并濃縮至膏狀；
[0009] (2)使用乙醇體積分?jǐn)?shù)為10-35%的正己燒-乙醇二元混合溶劑溶解步驟（1)得到 的膏狀乙酸乙醋提取物，得到100-150mg/mL的上樣溶液；
[0010] (3)對上樣溶液進(jìn)行一維液相色譜分離:采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱， 采用的流動相為二元混合有機(jī)相，其中A相為正己燒、B相為乙醇，進(jìn)樣量為50-150mL/針，流 動相流速為550-600mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210-260皿;采用的洗脫方式為 B相濃度由0 %至75 %梯度洗脫45-75min，根據(jù)紫外吸收光譜收集10-14min洗脫液作為目的 組分，減壓濃縮至膏狀，得到一維液相組分；
[0011] (4)用乙醇體積分?jǐn)?shù)為2-13%的乙醇-正己燒二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶 解至濃度為SO-lOOrng/mL
[0012] (5)進(jìn)行二維液相色譜分離:采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采用的流動 相為二元混合有機(jī)化其中A相為正己燒、B相為乙醇，進(jìn)樣量為500-200化17針，流動相流速 為10-30mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210-260皿，采用的洗脫方式為B相濃度4- 8%等度洗脫20-30min，根據(jù)紫外吸收光譜收集6-8min洗脫液作為目的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮 至干，得到二維液相組分；
[0013] (6)用乙醇體積分?jǐn)?shù)為2-13%的乙醇-正己燒二元混合溶劑溶解二維液相組分，溶 解至濃度為SO-lOOrng/mL
[0014] (7)進(jìn)行再分離純化:采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采用的流動相為二 元混合有機(jī)相，其中A相為正己燒、B相為乙醇，進(jìn)樣量為300-1500化/針，流動相流速為10- 30mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210-26化m，采用的洗脫方式為B相濃度2-3%等 度洗脫35-45min，根據(jù)紫外吸收光譜收集22-24min洗脫液作為目的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至 干，得到目的產(chǎn)物麥角醬醇過氧化物。
[0015] 所述步驟(3)中的Silica正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑150mm、柱長250mm，其中娃 球粒徑為10-50μπι，使用時柱溫為室溫或25-40°C。
[0016] 所述步驟(5)、（7)中的Silica正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑20mm、柱長250mm，其 中娃球粒徑為10-50μπι，使用時柱溫為室溫或25-40°C。
[0017] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述提取得到的麥角醬醇過氧化物在制備抗肺癌藥物中的 應(yīng)用。該麥角醬醇單體化合物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受 載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如:片劑、膠囊、注射劑等。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述提取得到的麥角醬醇過氧化物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng) 用。該麥角醬醇單體化合物作為有效成分，按常規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載 體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如:片劑、膠囊、注射劑等。
[0019] 本發(fā)明原料黃綠蜜環(huán)菌化學(xué)成分復(fù)雜、物質(zhì)極性比較集中，目的化合物麥角醬醇 過氧化物極性較小，所W本發(fā)明先選用乙酸乙醋進(jìn)行有效組分的粗提。根據(jù)相似相溶原理， 該溶劑可W盡可能多地溶解目的組分W及與相近的小分子雜質(zhì)，且乙酸乙醋為脂溶性溶 劑，與其相似相溶的目的組分也應(yīng)該具備進(jìn)入生物活性細(xì)胞所必需的脂溶性特性，從而具 有更高的進(jìn)入細(xì)胞參與細(xì)胞內(nèi)作用的可能性。
[0020] 其次在色譜分離的選擇上選用離線液相色譜技術(shù)進(jìn)行有效組分的提取，其優(yōu)勢在 于液相色譜不僅具有更高的峰容量，而且Ξ維具有不同的選擇性。經(jīng)過一維簡化的組分可 W在二維、Ξ維上根據(jù)不同的選擇性實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)分離，結(jié)構(gòu)相似的化合物可W在二維、Ξ維上 達(dá)到有效分離，從而提高制備的效率和化合物純度。
[0021] 本發(fā)明利用液相色譜制備的方法成功從黃綠蜜環(huán)菌中提取分離得到純度達(dá)98% 的天然小分子麥角醬醇過氧化物，該方法工藝簡單，時間周期短，試劑耗費(fèi)量小，制備量大， 穩(wěn)定可控，重復(fù)性好，實(shí)用性高，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0022] 現(xiàn)在藥理研究表明，黃綠蜜環(huán)菌具有多種藥理作用和保健作用并被廣泛應(yīng)用于屯、 腦血管疾病、婦科各類疾病的治療。因此從中分離出具有確切結(jié)構(gòu)并且易于進(jìn)行化學(xué)合成 的集抗癌活性為一體的化合物必將為抗癌新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明得到的黃綠蜜環(huán)菌 提取物麥角醬醇過氧化物性質(zhì)穩(wěn)定，通過細(xì)胞在線實(shí)時監(jiān)測的方法觀測其在體外的抗腫瘤 作用，發(fā)現(xiàn)該化合物對肝癌化p-g2細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞均具有抑制作用；該化合物在體外 實(shí)驗(yàn)抗腫瘤作用明顯，具有抗癌藥物開發(fā)潛力，為抗癌天然藥物的開發(fā)提供了有力的依據(jù)。
【附圖說明】
[0023] 圖1所示的是本發(fā)明實(shí)施例1中的一維高效液相色譜圖；
[0024] 圖2所示的是本發(fā)明實(shí)施例1中的二維高效液相色譜圖；
[0025] 圖3所示的是本發(fā)明實(shí)施例1中的Ξ維高效液相色譜圖；
[0026] 圖4所示的是本發(fā)明實(shí)施例2中的一維高效液相色譜圖；
[0027] 圖5所示的是本發(fā)明實(shí)施例2中的二維高效液相色譜圖；
[0028] 圖6所示的是本發(fā)明實(shí)施例2中的Ξ維高效液相色譜圖；
[0029] 圖7所示的是本發(fā)明所得目的組分的分析型高效液相色譜圖；
[0030] 圖8所示的是本發(fā)明所得目的組分的MS質(zhì)譜圖；
[0031 ]圖9所示的是本發(fā)明所得目的組分的HiNMR核磁圖；
[0032] 圖10所示的是本發(fā)明所得目的組分的C^NIR核磁圖；
[0033] 圖11所示的是本發(fā)明所得目的組分的麗Q幻普圖；
[0034] 圖12所示的是本發(fā)明所得目的組分的HMB幻普圖；
[0035] 圖13所示的是本發(fā)明所得麥角醬醇過氧化物對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用；
[0036] 圖14所示是本發(fā)明所得麥角醬醇過氧化物對肝癌化P-G2