專利名稱：：具有白銹菌抗性的甘藍(lán)植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗白4秀菌(AlbugoCandida)的甘藍(lán)植物(Brassicaoleracea)，該白銹菌可引起甘藍(lán)植物的白銹病。本發(fā)明還涉及這些具有抗性的植物的種子、果實(shí)和/或植物的其他部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及了生產(chǎn)具有白銹菌抗性的甘藍(lán)植物的方法。本發(fā)明還涉及與白銹菌抗性基因連接的特殊的DNA標(biāo)記用于鑒定抗性甘藍(lán)植物的用途。
背景技術(shù)：
：白4秀病(A.Candida,又名A.cruciferum,A.cruciferatum;另ll名白斑病，叢枝病)是一種植物病害，這種病害不但對(duì)甘藍(lán)蔬菜作物，也對(duì)有關(guān)種如油菜、芥菜和蘿卜等都會(huì)產(chǎn)生很多的問(wèn)題。原則上這種病害會(huì)發(fā)生在所有的十字花科植物上，故也見于野生種如薺菜(地米菜)和野生芥菜(天芥菜、芥菜和芥子)。與其名字表示的相反，它不是銹菌，而是卵菌，其與霜霉病(霜霉病菌)和疫病菌更相近。盡管卵菌以絲狀生長(zhǎng)，但它不是真菌，而更接近于藻類。卵菌可在蕓苔植物的葉片、莖和卵巢(長(zhǎng)角果，十字花科植物的長(zhǎng)形果實(shí))上，引起含芽孢的水皰(孢子嚢群，皰狀突起)。經(jīng)常以斑點(diǎn)形式的變形存在。植物全身性的感染會(huì)導(dǎo)致異常生長(zhǎng)、畸形和花或花期時(shí)常不育。卵菌最適合在10-20。C溫度范圍和潮濕的條件下繁育。2.5小時(shí)的潮濕時(shí)間足以導(dǎo)致一個(gè)葉片感染，孵育期1014天。因此，溫和潮濕的天氣條件利于卵菌的感染和傳播。當(dāng)白銹菌的孢子落在甘藍(lán)葉上，它們形成一個(gè)芽管穿透葉子。菌絲體在細(xì)胞間生長(zhǎng)，通過(guò)吸器吸收營(yíng)養(yǎng)。在表皮下形成的游動(dòng)孢子嚢中產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)性芽孢。當(dāng)在充足的濕度條件下，新生的無(wú)性孢子將從游動(dòng)孢子嚢中被釋放，并再引起新的感染。孢子有兩個(gè)鞭尾(鞭毛)，一只能前向運(yùn)動(dòng)，一只游動(dòng)。白銹菌能以厚壁的有性的卯孢子形式在地面越冬，該卯孢子可以在或不在受感染植物的殘余物上，或以無(wú)性的形式(菌絲體)存在于冬季硬化的寄主植物上。在溫暖的冬天，卵菌沒有真正的停止活動(dòng)，而是保持相對(duì)較低的活性。在春季新生植物可被感染。植物體也可能在植物床就已經(jīng)被感染，但沒有任何可見的癥狀。卵菌可通過(guò)孢子嚢進(jìn)行傳播，孢子囊被空氣流動(dòng)、強(qiáng)降雨、灌溉、機(jī)械、農(nóng)場(chǎng)工人和昆蟲帶動(dòng)，使其他植物被感染。白銹菌的特異性宿主是已知的，不同的生理種和?；透鶕?jù)物種或受感染的品系和在品系上的侵占性隔離來(lái)區(qū)別。蕓莒屬是十字花科中的一個(gè)屬(以前稱為十字花科的)。這個(gè)屬中的大多數(shù)涉及包心菜或芥菜。蕓苔屬中包含許多重要的農(nóng)作物和園藝作物，如油菜、花椰菜、紅球甘藍(lán)、皺葉甘藍(lán)、白球甘藍(lán)、牛心甘藍(lán)菜，羽衣甘藍(lán)，花莖甘藍(lán)，抱子甘藍(lán)，大白菜，球莖甘藍(lán)和葡萄牙甘藍(lán)(tronchuda)。幾乎植物的所有部分都能作為食物，如根(蘿卜)，莖(球莖甘藍(lán))，葉(白球甘藍(lán))，腋芽(苗)，花(花椰菜，花莖甘藍(lán))和種子(油菜)。油菜和油菜籽也能用來(lái)榨油，以用作燃料和能量消耗品。人們中止一些開白色或紫色花或者其葉子有特殊的顏色或特殊的外形的物種用于裝飾。蕓苔屬物種可見于世界各地，有一年生的、兩年生的和多年生的。這個(gè)物種也包含大量的野生種。目前幾乎沒有藥劑可用于控制生于蕓苔屬的白銹病。而且越來(lái)越多的歐洲國(guó)家出臺(tái)政策主張減少農(nóng)藥的使用。如果當(dāng)局不再允許使用控制藥劑，這會(huì)給養(yǎng)殖蕓苔屬物種帶來(lái)嚴(yán)重的問(wèn)題。諸如當(dāng)青花菜(野生白菜)(大頭菜)、芥菜(芥茉)和甘藍(lán)型油菜(油菜籽)染上白銹病將造成大量損失。((Bemier，Can.PlantDis.Surv.52:108,1972;Fanetal.,Can.J.Genet.Cytol.25:420-424，1983);HarperandPittman,Phytopathology64:408-410,1974;Varshneyetal.,TheoreticalandAppliedGenetics109:153-159,2004)。蔬菜作物的外觀質(zhì)量尤為重要。染上白銹病的豆芽菜、結(jié)球甘藍(lán)和巻心菜等蔬菜由于外觀受損，不再適合銷售。因此對(duì)具有抗白銹病能力的蕓莒屬蔬菜作物有著大量的需求。在不同的蕓苔屬物中如青花菜、甘藍(lán)型油菜和芥菜，都有白銹病抗性的凈艮道(Ebrahimietal.，Proc.Am.Phytopathol.Soc.3:273,1976;DelwicheandWilliams,Proc.Am.Phytopathol.Soc,1:66,1974;Tiwarietal.,Can.J.OfPlantScience68:297-300,1988;Koleetal.,Genome45:22-27,2002;Varshneyetal"TheoreticalandAppliedGenetics109:153-159,2004;Tanhuanpaa,TheoreticalandAppliedGenetics108:1039-1046,2004)。此外，也有對(duì)甘藍(lán)類品系白銹病具有部分抗性的凈艮道(SantosandDias,GeneticResourcesandCropEvolution51:713-722，2004)。然而，尚無(wú)對(duì)白銹病具有完全抗性的甘藍(lán)類蔬菜作物的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能抵抗白銹菌的甘藍(lán)植物，該白銹菌可引起白銹病。本發(fā)明為此提供了一種含白銹菌抗性基因的甘藍(lán)植物。根據(jù)本發(fā)明所述的抗性基因?qū)Π卒P菌為單基因抗性和顯性抗性。該抗性基因較好是以雜合的形式存在，并且，該抗性基因更優(yōu)選地是以純合的形式存在。本發(fā)明所述的白銹菌抗性基因優(yōu)選來(lái)自于甘藍(lán)類植物，其種子保藏于2006年3月1曰保藏在美國(guó)菌種保藏中心(ATCC，專利保管，大學(xué)大道10801，馬納薩斯，弗吉尼亞州20110,美利堅(jiān)合眾國(guó))，編號(hào)為PTA74-12。令人驚訝的，已發(fā)現(xiàn)由本發(fā)明所述的抗性基因，為顯性基因抗性，可用于抑制白銹菌。為了從甘藍(lán)中獲得對(duì)白銹菌完全抗性的基因，本發(fā)明所描述的對(duì)白銹病顯性的、單基因抗性的傳播，是采用第一代甘藍(lán)源向不同的其他類型甘藍(lán)，如白球甘藍(lán)，抱子甘藍(lán)，花椰菜和球莖甘藍(lán)傳播。通過(guò)使用疾病測(cè)試篩選有白銹病抗性的甘藍(lán)品系，同時(shí)鑒定一種白銹菌抗性源。并通過(guò)反復(fù)回交的方法，將抗性從源傳播到具有特性的品系，有些情況下，將回交4-6次，伴隨多代自花傳粉。每次都進(jìn)行疾病測(cè)試，以便選擇抗性植物用于連續(xù)回交。在這些疾病測(cè)試的評(píng)估中，植物被培養(yǎng)分類為有抗性的(無(wú)明顯的反應(yīng)或壞死的斑點(diǎn))、易感染的(有許多孢子的水皰)和中間的(壞死的斑點(diǎn)和數(shù)個(gè)含孢子的水皰)。從在回交中建立的分離比率數(shù)值中發(fā)現(xiàn)，該抗性為單基因顯性。然而，在許多遺傳背景中發(fā)現(xiàn)了缺少抗性的植物，此外，同時(shí)在中間類別的許多植物發(fā)現(xiàn)數(shù)量較大的變異(從幾種植物到總數(shù)的一半)。因此，在這些遺傳背景下，該基因的滲入是十分不完全的，結(jié)果育種計(jì)劃極大的受阻。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，抗性基因與一個(gè)或多個(gè)特定DNA標(biāo)記連接。為了能更好的監(jiān)控和更快的傳播抗性，根據(jù)本發(fā)明，DNA標(biāo)記已經(jīng)開發(fā)出來(lái)，其緊密地連接到其上具有抗白銹病的抗病性基因的滲入。所迷的標(biāo)記已采用BSA(分群分析)法進(jìn)行研究。為此，在疾病測(cè)試實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將個(gè)體以適當(dāng)?shù)目傮w分離比例(1:l)BC分成有抵抗性和易感染兩類。然后，從所有的植物中分離DNA,有抵抗性的植物被膨脹為一個(gè)有抗性的群，并且易感染的植物也^皮膨脹為一個(gè)易感染的群。采用RAMP技術(shù)對(duì)這些群進(jìn)行標(biāo)記分析，鑒定與抗性緊密連接的標(biāo)記。通過(guò)分析緊密連接的標(biāo)記，植物利用確定性被選擇，植物包含成群的抗性基因，其中疾病測(cè)試沒給出明確的圖片(很多中間反應(yīng)，沒有好的分離比率)。此外，在同系交配時(shí)，純合的有抗性植物與雜合的抗性植物被直接分開。該結(jié)果導(dǎo)致加速培育過(guò)程。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，具有抗白銹病的抗性基因的滲入的存在通過(guò)使用至少2個(gè)，優(yōu)選的至少3個(gè)，更優(yōu)選的至少4個(gè)，再更優(yōu)選的至少5、6、7或8個(gè)，最好的9個(gè)DNA標(biāo)記與抗性基因連接在一起來(lái)證明，其中DNA標(biāo)記圍繞著抗性基因。在本申請(qǐng)中的圍繞被理解為，DNA標(biāo)記物位于在抗性基因的兩邊的基因組上，即抗性基因的"上游"和"下游"。證明連接到抗性基因并更進(jìn)一步圍繞抗性基因的多個(gè)DNA標(biāo)記的存在確保了具有抗性基因的滲入實(shí)際上是存在的。根據(jù)本發(fā)明所述的DNA標(biāo)記優(yōu)選的是從表l中選出的，其中其中植物基因組的DNA標(biāo)記的存在可以使用51物序列證實(shí)，該引物序列選自包含SEQID號(hào)為1至10并包括10的序列組(表2)。導(dǎo)致本發(fā)明的研究已證實(shí)，相關(guān)DNA標(biāo)記的特點(diǎn)為抗白銹病抗性的滲入。根據(jù)本發(fā)明所述的DNA標(biāo)記為DNA片斷，其連接到相關(guān)抗性基因，具有如在表l中指出的特定的大小(bp),并且能使用特殊的引物組合來(lái)證明。才艮據(jù)本發(fā)明所述的才直物優(yōu)選J也選自由以下才直物組成的組B.o]eraceaconvar.botrytisvar.boti:ytis(花扭卩菜,羅馬.尼亞i吾),B,oleraeeacoiivar.botrytisvai'.c.ymosa(花莖甘藍(lán)),:B,oierace.aconvar,botrytisvar,asparagoides(西蘭花)，B-okraceaeonvar.oieraceavar,ge〗加ifera(抱子甘藍(lán))，B,oleraceaconvar,eapitatavar,alba(白5求甘藍(lán),牛心甘藍(lán))，B.oleraceaco!ivar,capi.tatavar.rubra(紅球甘藍(lán)),B.oleraceaconvar.capitatavar,sabawia(鈹葉甘藍(lán))，B,oleraceaconvar,acephe!avar.sabellica(羽衣甘藍(lán)),B,o)eraceaconvar,aceph—elavar.gongyloides(球莖甘藍(lán))和B,oleracea曹.tronchudasy.ri,costata(葡萄牙甘藍(lán))。本發(fā)明還涉及到上述植物的種子、果實(shí)和/或其他植物部分。植物部分在這里可以理解為，是指其中植物的可食用部分，比如說(shuō)腋芽(芽)。本發(fā)明也涉及一種獲得對(duì)白銹病有抗性的甘藍(lán)植物的方法，該方法至少包括以下步驟(a)提供一種最初的甘藍(lán)植物，該植物包含一種抗白銹菌的抗性基因；(b)將抗性植物與易感染的第二種甘藍(lán)植物雜交；(c)從培養(yǎng)的子代中分離出染色體DNA,用于利用連接到抗性基因上的一個(gè)或更多特定的DNA標(biāo)記來(lái)檢測(cè)有抗性基因的滲入的存在；以及(d)從子代中選擇一種甘藍(lán)植物，其中抗性基因的滲入的存在已由步驟(c)證實(shí)。利用根據(jù)本發(fā)明的方法，使用本發(fā)明的具有抗性基因的滲入的特定的DNA標(biāo)記，以快速而簡(jiǎn)單的方式提供抗性甘藍(lán)植物。利用根據(jù)本發(fā)明所述的方法和連接到抗性基因上的特定的DNA標(biāo)記的使用，能夠簡(jiǎn)單地檢測(cè)植物是否含有抗性基因。進(jìn)行疾病測(cè)試是一個(gè)非常耗時(shí)的過(guò)程。通過(guò)使用連接到抗性基因上的特定DNA標(biāo)記選擇抗性植物是非常有效的。植物的數(shù)目越大，測(cè)起來(lái)就越容易。具有抗性基因的滲入也更容易映射，從而能夠選擇具有最低滲入可能性的植物。此外，可在純合抗性植物與雜合抗性植物之間作出區(qū)分植物。根據(jù)本發(fā)明所述的方法的步驟(d)中選擇的植物，可選擇性的增加附加步驟，例如將步驟(d)中獲得的植物與易感染的甘藍(lán)植物進(jìn)行一次或多次的回交或自花傳粉，并且隨后，使用特定DNA標(biāo)記從抗性甘藍(lán)植物的子代中再選一次。例如采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)方法，如花藥和/或小孢子培養(yǎng)，對(duì)由步驟(d)中獲得的植物也可以進(jìn)行純合。在本方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在被選擇植物中的抗性基因的滲入的存在通過(guò)疾病測(cè)試的方式來(lái)i正實(shí)。抗性基因的存在和影響，可以通過(guò)進(jìn)行疾病測(cè)試確定性地3正實(shí)。最初的甘藍(lán)植物優(yōu)選地包括一個(gè)抗性基因，其給出對(duì)白銹病的單基因并顯性的抗性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，抗性基因以雜合的形式存在，優(yōu)選以純合的形式存在。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，最初的甘藍(lán)植物包含抗性基因，該抗性基因來(lái)自其種子于2006年3月1日保藏在美國(guó)菌種保藏中心(美利堅(jiān)合眾國(guó)，弗吉尼亞州20110,馬納薩斯，大學(xué)大道10801,ATCC,專利保管(ATCC,PatentDepository,10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110,UnitedStatesofAmerica))的編號(hào)為PTA74-12的甘藍(lán)植物。在根據(jù)本發(fā)明所述的方法的另一優(yōu)選實(shí)施例中，在步驟(d)中的抗性甘藍(lán)植物的選擇包括選擇甘藍(lán)植物，該甘藍(lán)植物其包括至少2個(gè)，優(yōu)選的至少3個(gè)，更優(yōu)選的至少4個(gè)，再更優(yōu)選的至少5、6、7或8個(gè)，最優(yōu)選的9個(gè)DNA標(biāo)記與抗性基因連接在一起，其中DNA標(biāo)記圍繞抗性基因?，F(xiàn)可以肯定地確定該植物確實(shí)具有抗性基因的滲入。根據(jù)本發(fā)明所述的DNA標(biāo)記優(yōu)選的是從表1中選出，其中植物基因組中的DNA標(biāo)記的存在，可以使用引物序列證實(shí)，該引物序列選自包含SEQID號(hào)為1至10并包括10的序列組(表2)。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，最初的甘藍(lán)植物含有白銹菌的抗性基因，該抗性基因源自其種子于2006年3月1日保藏在美國(guó)菌種保藏中心(美利堅(jiān)合眾國(guó)，弗吉尼亞州20110，馬納薩斯，大學(xué)大道10801，ATCC，專矛H呆管(ATCC，PatentDepository,10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110，UnitedStatesofAmerica))的編號(hào)為PTA74-12的甘藍(lán)植物。導(dǎo)入抗性基因的易感染甘藍(lán)植物，優(yōu)選地選自由以下植物構(gòu)成的組B.oleraceaconvar.botrytisvar.botrytis(花椰菜(cauliflower)，羅馬尼亞語(yǔ))，B.okracsaconvar.botrytisvar.cymosa(花莖甘藍(lán)(broccoli)),B.oleraceaconvar.botrytisvar.asparagoides(西蘭花(sproutingbroccoli)),B.oleraceacorner,olsracsavar.gemnifera(抱子甘藍(lán)(Brusselssprouts)),B.olcmc6aconvar.capitatavar.alba(白球甘藍(lán),牛心甘藍(lán)(whitecabbage,oxheartcabbage)),B.olsmcsaconvar.capitatavar.rubra(紅球甘藍(lán)(redcabbage)),B.oleraceaconvar.capitatavar.sabauda(鈹葉甘藍(lán)(savoycabbage)),B.olsraceaconvar.acephelavar,sabellica(習(xí)習(xí)衣甘藍(lán)(curlycalecabbage)),B.olsraceaconvar.accphslavar.gongyloides(球莖甘藍(lán)(turnipcabbage))和^oleraceavar.tronchudasyn.costata(葡萄牙甘藍(lán)(Portuguesecabbage))。本發(fā)明還涉及使用上述方法獲得的甘藍(lán)植物，以及種子和/或植物部分。本發(fā)明還涉及連接到抗白銹病的抗性基因上的至少一個(gè)DNA標(biāo)記用于鑒定對(duì)白銹病有抗性的甘藍(lán)植物的用途，其中DNA標(biāo)記是選擇自表l中的DNA標(biāo)記，同時(shí)，其中DNA標(biāo)記可用引物序列證實(shí)，該引物序列選自包含SEQID號(hào)為1至10并包括10的序列組(表2)?？剐曰騼?yōu)選地來(lái)自其種子于2006年3月1日保藏在美國(guó)菌種保藏中心(美利堅(jiān)合眾國(guó)，弗吉尼亞州20110,馬納薩斯，大學(xué)大道10801，ATCC,專利保管(ATCC,PatentDepository,10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110，UnitedStatesofAmerica))的編號(hào)為PTA74-12的甘藍(lán)植物。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l-種群和疾病測(cè)試白4秀病抗源來(lái)自于親代系BejoZadenBV的9002757,其種子于2006年3月1日保藏在美國(guó)菌種保藏中心(美利堅(jiān)合眾國(guó)，弗吉尼亞州20110，馬納薩斯，大學(xué)大道10801,ATCC,專利保管)，編號(hào)為PTA74-12。將該親代系與不同的甘藍(lán)種雜交(羽衣甘藍(lán)，球莖甘藍(lán)，花莖甘藍(lán)，西蘭花，白球甘藍(lán)，牛心甘藍(lán)，紅球甘藍(lán),皺葉甘藍(lán),葡萄牙甘藍(lán)，抱子甘藍(lán)和花椰菜)。與易感親代系回交后可得到BC1種群。為了從這些種群中選擇抗性植物，使用一種疾病測(cè)試。為了保藏疾病測(cè)試實(shí)驗(yàn)用的白銹病隔離群，從土地中易感染甘藍(lán)中分離游動(dòng)孢子嚢。在水中發(fā)芽后，給易感染的植物接種芽孢。產(chǎn)生水皰后，收獲游動(dòng)孢子嚢，并保藏在液氮內(nèi)以備用。在溫室中對(duì)BC1種群的幼苗進(jìn)行最后疾病測(cè)試實(shí)^r,在測(cè)試前，BC1種群的子葉發(fā)育24-48小時(shí)。用新鮮的游走孢子懸浮液(每毫升5xl0"個(gè)游走孢子)給植物接種，所用的懸浮液是自易感染植物沖洗游動(dòng)孢子嚢,并讓它們?cè)谒邪l(fā)育制備而成。吸取數(shù)滴游走孢子懸浮液滴在子葉上。移液后，植物在一個(gè)塑料大棚中進(jìn)一步生長(zhǎng)，以確保感染的最佳條件。對(duì)接種后兩個(gè)星期的植物進(jìn)行評(píng)定，其中，它們長(zhǎng)成^i元類、易感染類或中間類類(Williams,篩選多重抗病性十字花科.研討會(huì)，1981年9月2-3日，美國(guó)，麥迪遜，威斯康星大學(xué)，F(xiàn)riedrick中心(Williams,Screeningcmcifersformultiplediseaseresistance.Workshop,September2-3,1981,J.RFriedrickCenter,UniversityofWisconsin,Madison,USA))。對(duì)幼苗進(jìn)行完疾病測(cè)試實(shí)驗(yàn)后，保留抗性植物用于后續(xù)的回交。疾病測(cè)試的結(jié)果表明所述抗性原則上是單基因顯性。然而，除了具有易感染和抗性反應(yīng)的植物外，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有中間反應(yīng)的植物。該發(fā)現(xiàn)高度依賴于目前正在進(jìn)行的遺傳背景。從過(guò)程中挑選不同的種群，過(guò)程中沒有或幾乎沒有任何中間反應(yīng)，并且發(fā)現(xiàn)期待的分離比率(BC為1:1和自花授粉為3:1)。實(shí)施例2-標(biāo)記研究對(duì)于連接的DNA標(biāo)記的研究，大約有200個(gè)個(gè)體的4個(gè)種群(花椰菜，羽衣甘藍(lán)，葡萄牙甘藍(lán)，白球甘藍(lán))被使用。從葉穿孔中分離所有個(gè)體的DNA(—0.3平方厘米/葉穿孔)。4昔助于RAMP(RandomArnpHfiedMicrosatelliteP()ly歸rphisms)技術(shù)(Matsumotoetal"MammalianGenome9:531-535，1998;Reiter,PCR-basedmarkersystems,in:R丄.Philips&I.K.Vasil(eds.),DNA-basedmarkersinplants,KluwerAcademicPublishers,2001;Weisingetal.，DNAfingerprintinginplants,principles,methodsandapplication,CRCPress,2nded.，21-73，2005)，使用一種BSA方法產(chǎn)生緊密相連的DNA纟示記。這種RAMPl支術(shù)，其中將一個(gè)iSSR和一個(gè)RAPD-引物組合，產(chǎn)生具有片段的染色體帶型，其中與抗性明確的共分離，從而能夠分辨出含有和不含有抗性基因的植物，再通過(guò)定位RAMP片段，能鑒定出緊密連接的RAMP-標(biāo)記哪一個(gè)連著抗性基因。實(shí)施例3-PCR條件和標(biāo)記分析用來(lái)做RAMP反應(yīng)的PCR條件如下PCR混合75毫摩Tris-HCl(pH8.8)20毫摩NH4S040.01%(v/v)Tween202.8毫摩MgCl20.25毫摩dNTPs0.15微摩正向引物0.2微摩反向引物0.04units/|iilRedHotDNA聚合酶(ABgene,Epsom,UK)~0.2ng/fil才直物染色體組DNAPCR過(guò)程步驟1:2分鐘93。C步驟2:30秒93°C步驟3:30秒35°C步驟4:以0.37秒加熱至72。C步驟5:1分30秒72°C步驟2-5:重復(fù)40遍步驟6:5分鐘72。C聚丙烯酰胺凝膠電泳用"基因ReadIR4200DNA分析儀"("GeneReadIR4200DNAanalyzers")(LicorInc.)分析RAMP模式。在最適濃度為6.5%的丙烯酰胺的基礎(chǔ)上，可根據(jù)單堿基的大小來(lái)分離片斷。為使片斷在系統(tǒng)中可見，使用貼上標(biāo)簽(IRDye標(biāo)簽)的引物是很有必要的。為了該目的，將正向引物總數(shù)的三分之一被有相同順序的貼上標(biāo)簽的引物代替。實(shí)施例4-標(biāo)記概述表1和表2中提供的不同RAMP標(biāo)記的引物序列，有信息的片斷的大小和基于在種群中互換的數(shù)量以cM(厘摩)估計(jì)抗性的距離。在不同標(biāo)記之間的互換數(shù)量的分析示出了標(biāo)記圍繞抗性基因。表1:RAMP標(biāo)記的^既述<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>定義BSA-集群分析法(BulkedSegregantAnalysis):選擇策略，其中，在大的分離種群中，將有相同的特征(顯型)個(gè)體，或這些個(gè)體的DNA集群成"群"后。采用DNA技術(shù)對(duì)這些群進(jìn)行篩選，鑒別連接到相應(yīng)顯型上的標(biāo)記。cM-厘摩(centimorgan):標(biāo)記之間的基因距離的單位，基于每100個(gè)個(gè)體的互換次數(shù)。DNA標(biāo)記(DNAmarker):—個(gè)在基因組上已知位置與基因或者的其他DNA片連接的DNA片段,用于檢測(cè)該基因或該位置的遺傳可能性。顯性基因(Dominant):當(dāng)兩等位基因都存在時(shí)，遮住另一等位基因的表型表達(dá)的等位基因。凝膠電泳(Gel-electrophoresis):在電場(chǎng)的影響下，在矩陣(瓊脂糖或聚丙烯酰胺)中，根據(jù)分子的尺寸大小、形狀或電荷，分離分子(DNA、RNA分子和蛋白質(zhì)等)的方法?；?Gene):遺傳的基礎(chǔ)單位，借此從親本到后代傳送遺傳性狀。基因滲入(Introgression):通過(guò)雜交，將一個(gè)品系的染色體片段插入另一品系。紅外染色標(biāo)簽(IRDyelabels):用于Licor成像系統(tǒng)，對(duì)發(fā)生在波長(zhǎng)700nm或800nm的4全測(cè)估支的標(biāo)簽。個(gè)核苷酸的重復(fù)組成的DNA片斷即SSR(單重復(fù)序列)的5'末端上設(shè)計(jì)的引物。單基因(Monogenic):由一對(duì)等位基因決定的。PCR(聚合酶鏈反應(yīng))(PolymeraseChainReaction):—種用于倍增特定DNA片段的體外擴(kuò)增方法。該合成反應(yīng)利用至少一核苷酸引物與一DNA片段雜交，然后DNA聚合酶通過(guò)連續(xù)的溫度循環(huán)放大兩側(cè)的區(qū)域。該合成反應(yīng)利用至少一種酸引發(fā)劑與一個(gè)DNA片斷雜交后，通過(guò)連續(xù)的溫度循環(huán)使DNA聚合酶放大其兩側(cè)的區(qū)域。引物(Primer):—條核苷酸短序列(20-50bp)與一條單鏈DNA分子的順序配對(duì)，用作聚合酶的起點(diǎn)。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA引物RAPD-引物(RAPD-primer)((RandomAmplifiedPolymorphicDNAprimer)):—10-mer"隨才幾"序列，其中GC含量介于60%~70%,并且引物的末端不是自補(bǔ)償。RAMPs(隨才幾擴(kuò)增樣t衛(wèi)星多態(tài)性)(RandomAmplifiedMicrosatellitePolymorphisms):基于RAPD和iSSR引物的DNA指紋技術(shù)，檢測(cè)不同的DNA突變體間的多態(tài)性?？剐?Resistance):植物體完全地或部分地防止病原體影響和/或阻礙病原體生長(zhǎng)的能力。BC(回交)(Backcrossing):—個(gè)體與其親本之一相交配。權(quán)利要求1.甘藍(lán)植物，包含白銹菌的抗性基因，白銹菌導(dǎo)致白銹病。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述的抗性基因以雜合形式存在。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物，其中所述的抗性基因以純合形式存在。4.根據(jù)權(quán)利要求1，2或3所述的植物，其中所述的抗性基因來(lái)自于其種子于2006年3月1日保藏在美國(guó)菌種保藏中心(ATCC,專利保管，大學(xué)大道10801,馬納薩斯，弗吉尼亞州20110,美利堅(jiān)合眾國(guó))的編號(hào)為PTA74-12的甘藍(lán)植物。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的植物，其中所述有抗性基因的滲入的存在，-使用連^^妄到抗性基因的至少一個(gè)特定的DNA標(biāo)記來(lái)證明。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物，其中具有白銹菌抗性基因的滲入的存在，使用連接到抗性基因的至少兩個(gè)DNA標(biāo)記證明，其中DNA標(biāo)記圍繞抗性基因。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的植物，其中DNA標(biāo)記選擇自表1,其中植物基因組中DNA標(biāo)記的存在，使用引物序列證實(shí)，該引物序列選自包含SEQID號(hào)為1至IO并包括10的序列組(表2)。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的植物，其中所述植物選自包含以下植物的纟且B.oleraeeaconvar.lbotrytisvar,botrytis(花椰菜,羅馬尼亞語(yǔ))，B.olcrsc;caconvar.botrytisvar.c、'mos錢(花莖甘藍(lán))，g.;....gj.glg.ggg簡(jiǎn)war.botrytisva.r,asparagoides(西蘭花)，.B.okra.ccaeoiivar《gjgfggggvar,gemnifera(抱子甘藍(lán))，B.olcraccticonvar.capitatavan亟|§(白球甘藍(lán)，牛心甘藍(lán))，..B.okraccaeo爵ar.capitatavanrubra(紅球甘藍(lán))，iLi!lIMMconvar*citntavar,sabauda(鈹葉甘藍(lán))，.B.oteraccac(腿曹，ii￡￡fil!￡Mvar's油e豕畫ka(羽衣甘藍(lán))，:ELolcraccaconvar,accphdavar,g￡agli￡M.M(玉求莖甘藍(lán))和:B.okraceavar.tronchudasyn.costata(葡萄牙甘藍(lán))。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的植物的種子、果實(shí)和/或其他植物部分。10.具有白銹菌抗性的甘藍(lán)植物的制備方法，包括(a)提供一種最初的甘藍(lán)植物，該植物包含一種抗白銹菌的抗性基因;(b)將抗性植物與易感染的第二種甘藍(lán)植物雜交；(c)從培養(yǎng)的子代中分離出基因組DNA,用于利用連接到抗性基因上的一個(gè)或更多特定的DNA標(biāo)記來(lái)檢測(cè)抗性基因的滲入的存在；以及(d)從子代中選擇一種甘藍(lán)植物，其中抗性基因的滲入的存在已由步驟(c)證實(shí)。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中該抗性基因以雜合形式存在。12.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中該抗性基因以純合形式存在。13.根據(jù)權(quán)利要求10,11或12所述的方法，其中被選擇植物中的抗性基因的滲入的存在采用疾病測(cè)試的方法證實(shí)。14.根據(jù)權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中抗性基因來(lái)自于其種子于2006年3月1日保藏在美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)的編號(hào)為PTA74-12的甘藍(lán)才直物。15.根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(d)中抗性甘藍(lán)植物的選擇包括選擇其具有至少兩個(gè)與抗性基因連接的DNA標(biāo)記、且該DNA標(biāo)記圍繞抗性基因的甘藍(lán)植物。16.根據(jù)權(quán)利要求10-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中DNA標(biāo)記選擇自表l,表l中的DNA標(biāo)記用引物序列證實(shí)，該引物序列選自包含SEQID號(hào)為1至10并包括10的序列組(表2)。17.根據(jù)權(quán)利要求10-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中易感染甘藍(lán)植物選自包括以下植物的組B*okracc3convar.botrytisvar,lu血iM5(花椰菜，羅馬.尼亞i吾)，.B.olcraiccaconvar.botrytisvar,cyn應(yīng)g(花莖甘藍(lán))，l()lcnacciieonvar,botry:.tisv錢r,asparagoicles(西蘭花)5llii!llEII￡§IIeonvsit;olcracca、'ar,gemnifera(球芽甘藍(lán))，okraccaeonvar,￡§￡||§|11varMM(白球甘藍(lán)，牛心甘藍(lán))，B,ol腦咖convar,var,￡m|ji:i(紅J求甘藍(lán))，B,okracc錢e(Mivar,capitatavar,sab錢uda(杳皮p十甘藍(lán)X|iLi!l￡￡i￡￡a)nvar,ac印h由v亂sabe謹(jǐn)ca(白菜花察萊)，B.oicraccaco眼w,￡￡fi}JiM!igomgyioMes(球莖甘藍(lán))和B.oleraceavar.tronchudasyn.costata〖甘藍(lán))。18.根據(jù)權(quán)利要求10-17中任一項(xiàng)的方法獲得的抗白銹菌的甘藍(lán)植物。19.使用至少一個(gè)連接到抗白銹病的抗性基因上的DNA標(biāo)記，用于鑒定對(duì)白銹病有抗性的甘藍(lán)植物，其中DNA標(biāo)記是選擇自表1中的DNA標(biāo)記，同時(shí)，其中DNA標(biāo)記可用引物序列證實(shí)，該引物序列選自包含SEQID號(hào)為1至10并包括10的序列組(表2)。全文摘要本發(fā)明涉及具有抗白銹菌的抗性基因的甘藍(lán)植物，該菌可產(chǎn)生白銹病。本發(fā)明還涉及提供具有抗白銹菌的甘藍(lán)植物的方法，包括(a)提供一種最初的甘藍(lán)植物，該植物包含一種抗白銹菌的抗性基因；(b)將抗性植物與易感染的第二種甘藍(lán)植物雜交；(c)從培養(yǎng)的子代中分離出基因組DNA，用于利用連接到抗性基因上的一個(gè)或更多特定的DNA標(biāo)記來(lái)檢測(cè)抗性基因的滲入的存在；以及(d)從子代中選擇一種甘藍(lán)植物，其抗性基因的滲入的存在已由步驟(c)證實(shí)。文檔編號(hào)A01H5/00GK101686645SQ200880014391公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年4月22日優(yōu)先權(quán)日2007年5月1日發(fā)明者斯赫雷弗·阿爾貝圖斯·約翰內(nèi)斯·瑪莉亞,波斯特馬·哈爾斯莫·阿德里安娜·多里安,赫斯·德·揚(yáng),霍格蘭·約翰內(nèi)斯·赫拉爾杜斯·瑪麗亞申請(qǐng)人:貝霍種子有限公司