專利名稱：：提供容易獲得的源于外周血的細(xì)胞材料的方法及其組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在TVEMF-生物反應(yīng)器中制備的來自外周血的成體干細(xì)胞、以及這種制備方法、其組合物和使用所述細(xì)胞或組合物治療哺乳動(dòng)物的方法。技術(shù)背景哺乳動(dòng)物尤其是人體組織的再生長期以來是醫(yī)學(xué)界的理想。迄今，人體組織的修復(fù)很大程度上通過移植來自供體的相似組織已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。基本上始自從雙胞胎Herrick中一個(gè)向另一個(gè)的腎臟移植，以及后來南非醫(yī)生ChristianBarnard在1967年12月3日完成的從DeniseDarval向LouisWashkansky的4mM:界著名的心臟移植，組織移植成為了用于延長晚期患者壽命的廣泛接受的方法。人體組織移植從它的最初應(yīng)用開始就遇到了重大問題，主要是由于身體的自然免疫系統(tǒng)而產(chǎn)生的組織排斥。這通常造成應(yīng)用組織移植時(shí)生命的延長非常有限(Washkansky手術(shù)后只活了18天)。為了克服身體免疫系統(tǒng)的問題，很快開發(fā)出了許多抗排斥藥(比如ln證n、環(huán)孢霉素)以抑制免疫系統(tǒng)并因此延長組織在排斥之前的應(yīng)用。但是，排斥問題仍然產(chǎn)生對(duì)組織移植替代方法的需求。骨髓移植也有應(yīng)用,并且仍是治療一些疾病比如白血病的所選擇療法，以修復(fù)某些組織比如骨髓，但是骨髓移植也存在問題。它需要供體匹配(不到50%能找到);它會(huì)引起疼痛，且昂貴并具有風(fēng)險(xiǎn)。因此，骨髄移植的替代方法是非常希望得到的。組織干細(xì)胞的移植比如在美國專利No.6，129，911中的肝臟干細(xì)胞移植也有類似的限制，使得它們的廣泛應(yīng)用存在疑問。近年來，研究人員試驗(yàn)了應(yīng)用多能性胚胎干細(xì)胞作為組織移植的替代手段。應(yīng)用胚胎千細(xì)胞背后的理論是它們?cè)诶碚撋夏軌蛴糜谠偕眢w內(nèi)幾乎任何組織。然而，胚胎干細(xì)胞在組織再生上的應(yīng)用也遇到了問題。在這些問題中較為嚴(yán)重的有，所移植的胚胎干細(xì)胞的可控性受到限制，它們有時(shí)生長成腫瘤，并且可用于研究的人胚胎千細(xì)胞被患者的免疫系統(tǒng)所排斥(Nature,June17,2002:Pearson,"StemCellHopesDouble",11cws@1mturc.com,publishedonline:21June2002)。另夕卜，胚胎干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用受到倫理、道德、和政治因素的阻礙，使得它的廣泛應(yīng)用仍然是存在疑問的。干細(xì)胞的多能性特點(diǎn)是首先在從骨髓中找到的成體干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。Verfailie,C.M.etal"Pluripotencyofmesenchymalstemcellsderivedfromadultmarrow.池敏c417，publishedonline20June;doi:10.1038/nature009()0,(2002)citedbyPearson,H.Stemcellhopesdouble.H6ws@ii3ture。a)m,publishedonline:21June2002;doi:10.1038/news020617-11.Boyseetal.,美國專利No.6,569,427Bl公開了低溫^^以及低溫保存的胎兒和新生兒血液可用于治療或預(yù)防多種疾病與病癥比如貧血、惡性肺瘤、自身免疫疾病、和多種免疫功能障礙及缺陷。Boyse還公開了造血重建在使用異源基因序列的基因療法中的應(yīng)用。但是，Boyse的公開由于缺乏用于治療的細(xì)胞擴(kuò)增而停止。CorCell，一個(gè)臍帶血庫，提供了對(duì)臍帶血千細(xì)胞的擴(kuò)增、低溫保存、和移植的統(tǒng)計(jì)。"ExpansionofUmbilicalCordBloodStemCells",InformationSheetUmbiiicaSCordBlood,CorCdl，Inc.(2003)。一種擴(kuò)增方法乂>開了應(yīng)用一種生物反應(yīng)器,該生物反應(yīng)器帶有位于中央的基于膠原蛋白的基質(zhì)。ReseairdiCenterJulich:BloodStemCellsfromtheBioreactor.PressreleaseMay17,2001。研究繼續(xù)致力于闡明有關(guān)干細(xì)胞擴(kuò)增的分子機(jī)制。例如，CorCell的文章公開了被命名為Delta-1的信號(hào)分子有助于臍帶血干細(xì)胞的發(fā)育。OhishiK,etal"Delta-lenhancesmarrowandthymusi.epopulatingabilityofhumanCD34+/CD38-cordbloodcells.Clin.Invest110:11654174(2002)。在本申請(qǐng)中，術(shù)語"外周血，，意思是指在哺乳動(dòng)物中全身性循環(huán)或曾經(jīng)循環(huán)的血液。術(shù)語"外周血細(xì)胞"意思是指在外周血中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。盡管在很多成熟組織中可以發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞,但是發(fā)現(xiàn)它們的量更少并且更難定位。此外，組織中發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞可能專注于該組織，很少具有作為真正多能細(xì)胞的功能。然而，外周血細(xì)胞比組織中干細(xì)胞更容易獲得。因此，需要提供不基于器官移植、骨髓移植、或者胚胎干細(xì)胞的修復(fù)人體組織的方法和程序，同時(shí)還需要提供不太可能引起免疫應(yīng)答的已擴(kuò)增外周血干細(xì)胞的組合物，優(yōu)選以治療狀況和劑量，以在數(shù)小時(shí)而不是數(shù)天內(nèi)應(yīng)用。發(fā)明概述本發(fā)明部分涉及來自哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的外周血干細(xì)胞，優(yōu)選其中所述干細(xì)胞是TVEMF擴(kuò)增的。本發(fā)明也涉及來自哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的外周血千細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞在單位體積的數(shù)量上至少是其來源材料(例如，TVEMF擴(kuò)增之前所述干細(xì)胞的外周血來源)的7倍；并且其中外周血千細(xì)胞具有與天然存在(即來源)的外周血干細(xì)胞相同或基本相同的三維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持(cell-to-cellsupport)以及細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)構(gòu)(cell-to-cdlgeometry)。此種細(xì)胞優(yōu)選由此處所述的TVEMF擴(kuò)增程序來制備。本發(fā)明也涉及包含這些細(xì)胞的組合物，其按照需要添加其它成分，包括藥用可接受的載體、低溫保存劑、和細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明也涉及制備干細(xì)胞和干細(xì)胞組合物的方法，這是通過以下步驟:將外周血混合物置于TVEMF生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室中，對(duì)混合物施加TVEMF，以及TVEMF擴(kuò)增TVEMF生物反應(yīng)器中的外周血干細(xì)胞，以制備TVEMF擴(kuò)增的外周血千細(xì)胞和千細(xì)胞組合物。優(yōu)選地，施加在細(xì)胞上的TVEMF為約0.05到約6.0高斯。本發(fā)明還涉及低溫保存擴(kuò)增干細(xì)胞的方法，這是通過將溫度降低到-120T至-196E維持1年或更長，之后將該溫度升高至適于將細(xì)胞導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的溫度。本發(fā)明也涉及使用本發(fā)明的干細(xì)胞和千細(xì)胞組合物治療哺乳動(dòng)物的方法。此治療可用于組織修復(fù)和再生、以治療疾病，或者本申請(qǐng)討論的任何其它用途。本發(fā)明也包括用于治療此處所定義任何疾病、或者用于修復(fù)組織或器官的組合物和方法，其中包含本發(fā)明的干細(xì)胞。本發(fā)明還包括本發(fā)明的組合物在制備用于治療本文所討論任何疾病、或者用于本文所述組織l務(wù)復(fù)或再生的藥物中的用途。特別期望根據(jù)本發(fā)明的低溫TVEMF擴(kuò)增細(xì)胞從出生或幼齡就可獲得，例如在每分鐘延遲治療都可能意味著生死之別的緊急危機(jī)中。此外，在本發(fā)明中使用外周血使得本發(fā)明細(xì)胞和組合物容易獲得(至少考慮到外周血的容易獲得性)。附圖簡述附圖中，圖1以示意圖方式舉例說明生物反應(yīng)器的培養(yǎng)載體流動(dòng)回路的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案；圖2是本發(fā)明的TVEMF生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的側(cè)視圖；圖3是圖2的TVEMF生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的側(cè)面投影圖；圖4是TVEMF生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的俯視截面圖；圖5是一種TVEMF生物反應(yīng)器的俯視截面圖；圖6是隨時(shí)間變化電磁力裝置的側(cè)視圖，該裝置能容納生物反應(yīng)器并向生物反應(yīng)器提供隨時(shí)間變化的電磁力；圖7是圖6所示裝置的前視圖；以及圖8是圖6所示裝置的前視圖，進(jìn)一步顯示其中的生物反應(yīng)器。附圖詳述用最簡單的話來說，旋轉(zhuǎn)式TVEMF生物反應(yīng)器包含細(xì)胞培養(yǎng)腔室和隨時(shí)間變化的電磁力源。在運(yùn)行中，外周血混合物被置于細(xì)胞培養(yǎng)腔室中。細(xì)胞培養(yǎng)腔室旋轉(zhuǎn)一段時(shí)間，在此期間，隨時(shí)間變化電磁力源在腔室內(nèi)產(chǎn)生隨時(shí)間變化的電磁力。在時(shí)間結(jié)束時(shí)，將TVEMF擴(kuò)增的外周血混合物從腔室移出。在較復(fù)雜的TVEMF生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，隨時(shí)間變化電磁力源可以集成到TVEMF生物反應(yīng)器，如圖2-5舉例所示,但是也可與生物反應(yīng)器相鄰,如在圖6-8中。另夕卜，向細(xì)胞提供支持的流體栽體比如細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液(優(yōu)選與加到外周血混合物中的培養(yǎng)勤目似,如下討論)可以周期性更新和移出。在此處描述優(yōu)選的TVEMF生物反應(yīng)器。現(xiàn)在參看圖1，其舉例說明在一個(gè)完整的用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)栽體流動(dòng)回路l的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)帶有細(xì)胞培養(yǎng)腔室19,優(yōu)選旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)腔室，充氧器21，輔助培養(yǎng)載體定向流動(dòng)的裝置，優(yōu)選通過使用主泵15，以及供應(yīng)多支管17，其選擇性輸入培養(yǎng)載體需求，比如但不限于，營養(yǎng)物3、緩沖劑5、新鮮培養(yǎng)基7、細(xì)胞因子9、生長因子11、以及激素13。在此優(yōu)選實(shí)施方案中，主泵15提供新鮮流體載體到充氧器21，流體載體在此被充入氧氣并且通過細(xì)胞培養(yǎng)腔室19。來自細(xì)胞培養(yǎng)腔室19的使用后流體載體中的廢物被移去并傳送到廢物18，剩下的細(xì)胞培養(yǎng)載體返回到多支管17，在使用泵15通過充氧器21循環(huán)到細(xì)胞培養(yǎng)腔室19之前，必要時(shí)它在此接受新鮮補(bǔ)充。在培養(yǎng)載體流動(dòng)回路l中，培養(yǎng)載體通過腔室19中的活細(xì)胞培養(yǎng)物并且圍繞如圖1所示的培養(yǎng)載體流動(dòng)回路l。在此回路l中，根據(jù)化學(xué)傳感器(未顯示)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以維持細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)腔室19中的恒定條件?？刂贫趸?jí)毫Σ?dǎo)入酸或堿以校正pH值。氧氣、氮?dú)狻⒑投趸既芙庠跉怏w交換系統(tǒng)(未顯示)中，以支持細(xì)胞呼吸。閉合回路1添加氧氣，并從循環(huán)氣體容量中移去二氧化碳。.盡管圖1是可用于本發(fā)明的培養(yǎng)載體流動(dòng)回路的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，但是本發(fā)明并不限于此?？梢允謩?dòng)或者自動(dòng)或者通過其他控制手段向生物反應(yīng)器輸入培養(yǎng)載體比如但不限于氧氣、營養(yǎng)物、緩沖劑、新鮮培養(yǎng)基、細(xì)胞因子、生長因子、和激素，比如可以類似于廢物和二氧化碳的控制和移除。圖2和3舉例說明帶有集成的隨時(shí)間變化電磁力源的TVEMF生物反應(yīng)器10的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。圖4是以優(yōu)選方式用于本發(fā)明的一種旋轉(zhuǎn)式TVEMF生物反應(yīng)器10的橫截面圖。圖4的TVEMF生物反應(yīng)器10舉例說明帶有集成的隨時(shí)間變化電磁力源。圖5也舉例說明帶有集成的隨時(shí)間變化電磁力源的TVEMF生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。圖6-8顯示帶有相鄰的隨時(shí)間變化電磁力源的旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)到圖2，圖2舉例說明的是本發(fā)明的TVEMF生物反應(yīng)器10的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的側(cè)視圖。圖2包含由基座112支撐的馬達(dá)支架lll。馬達(dá)113位于馬達(dá)支架111內(nèi)部，且通過第一線114和第二線115連接至其內(nèi)帶有控制裝置的控制盒116，由此通過轉(zhuǎn)動(dòng)控制鈕117可對(duì)馬達(dá)113的轉(zhuǎn)速進(jìn)行增量控制。馬達(dá)支架111內(nèi)部i殳置有馬達(dá)U3，使得馬達(dá)軸118穿過支架111延伸，且馬達(dá)軸118是徑向的，使得軸118的中心與在徑向腔室119位置的地球平面平行，優(yōu)選地用包括但不限于塑料的透明材料制成。在此優(yōu)選實(shí)施方案中，徑向腔室119連接到軸118使得腔室119圍繞徑向軸旋轉(zhuǎn)，而徑向軸與地球平面平行。腔室119被線圏120所纏繞。線圏120的尺寸和纏繞圏數(shù)使得，當(dāng)優(yōu)選為0.1mA到1000mA的方波電流供應(yīng)在線圏120上時(shí)，在腔室119內(nèi)產(chǎn)生優(yōu)選為0.05高斯到6高斯的隨時(shí)間變化的電磁力。線圏120在軸118的末端通過線123和124連接至第一環(huán)121和第二環(huán)122。然后，環(huán)121和122與第一電磁傳送線125和第二電磁傳送線128相接觸，使得腔室119可以旋轉(zhuǎn)同時(shí)電流恒定地供應(yīng)到線圏120上。電/^發(fā)生裝置126與線12S、128相連接。通過旋轉(zhuǎn)電磁發(fā)生裝置鈕127調(diào)節(jié)其輸出，從而使得電磁發(fā)生裝置126提供方波到線125、128和線圈120上。圖3是可用于本發(fā)明中的圖2所示TVEMF生物反應(yīng)器10的側(cè)面投影圖?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)到圖4中舉例說明的帶有培養(yǎng)腔室230的旋轉(zhuǎn)式TVEMF生物反應(yīng)器IO,該腔室優(yōu)選是透明的，并且適于在其內(nèi)含有外周血混合物，另外包含外部支架220，其包括第一290和第二291圓柱形橫向末端帽構(gòu)件，該構(gòu)件與第一228和第二229末端表面相對(duì)，末端表面設(shè)置成接受內(nèi)部圓柱管狀玻璃構(gòu)件293和外部管狀玻璃構(gòu)件294。提供合適的壓力密封。在內(nèi)部293與外部294管狀構(gòu)件之間是環(huán)形線加熱器296,其用于獲得細(xì)胞生長的合適的培養(yǎng)溫度。所述線加熱器296也可用作隨時(shí)間變化的電磁力裝置，用以給培養(yǎng)腔室230提供隨時(shí)間變化的電場，或者，如圖5所述，獨(dú)立的線圏144可用于提供隨時(shí)間變化的電磁力。第一末端帽構(gòu)件290和第二末端帽構(gòu)件291具有內(nèi)部彎曲表面，其與末端表面228、229相鄰，以促進(jìn)腔室230內(nèi)的混合物流動(dòng)更平滑。笫一末端帽構(gòu)件290和第二末端帽構(gòu)件291分別具有第一中央流體傳遞軸頸構(gòu)件292和第二中央流體傳遞軸頸構(gòu)件295，其分別旋轉(zhuǎn)式接受在輸入軸223和輸出軸225上。每個(gè)傳遞軸頸構(gòu)件294、295具有凸緣以承載在末端帽構(gòu)件2卯、291中的凹陷沉孔中，并且其上附著第一鎖緊墊圏環(huán)297和第二鎖緊墊圏環(huán)298以防止相對(duì)于軸223、225的徑向運(yùn)動(dòng)。每個(gè)軸頸構(gòu)件294、295具有中間環(huán)形凹陷，其與徑向擴(kuò)展的、沿圓周布置的通il^目連。軸頸構(gòu)件292、295上的每個(gè)環(huán)形凹陷通過末端帽構(gòu)件2卯和291中的第一放射狀設(shè)置通道278和第二放射狀設(shè)置通道279分別與第一輸入偶^f203和第二輸入偶^f牛204相偶合。放射狀通道278或279中的載體流動(dòng)通過軸頸構(gòu)件294或295中的第一環(huán)形凹陷和徑向通道，以允許載體通過軸頸構(gòu)件292、295i^7v到達(dá)軸頸292、295的每個(gè)末端，在此其ii7v圍繞軸223、225。附著在末端帽構(gòu)件2卯和291的是包含滾珠軸承的第一管狀軸承支架205和第二管狀軸承支架206，該滾珠軸承相對(duì)地支撐輸入軸223和輸出軸225上的外部支架220。第一軸承支架205具有附著的第一鏈輪210，其用于為外部支架220提供旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)，其旋轉(zhuǎn)方向圍繞輸入軸223和輸出軸225以及徑向軸221。第一軸承支架205和第二軸承支架206也具備從線加熱器296和任何其它傳感器向外供電的功能。內(nèi)部濾器裝置235包括內(nèi)部管狀組件215和外部管狀組件216，其沿它們的長度方向具有孔或洞，該裝置有帶孔的第一217和第二218內(nèi)部濾器裝置末端帽組件。內(nèi)部管狀組件215構(gòu)建成兩部分，其兩部分帶有互鎖的位于中央的偶合部分，其每一部分分別附著于末端帽217或218。外部管狀組件216設(shè)置在第一217和第二內(nèi)部濾器裝置末端帽組件之間。所述末端帽組件217、218分別被旋轉(zhuǎn)式支持在輸入軸223和輸出軸225之上。內(nèi)部組件215通過釘和中央定位的(interfittiiig)凹槽219旋轉(zhuǎn)式附著至輸出軸225。十微米織法的聚酯布224布置在外部組件216的外表面之上，并且附著在任一末端的O環(huán)。因?yàn)閮?nèi)部組件215被偶合釘附著在輸出驅(qū)動(dòng)軸225上的槽，所以輸出驅(qū)動(dòng)軸225可旋轉(zhuǎn)內(nèi)部組件215。所述內(nèi)部組件215與第一217和第二218末端帽相偶合,所述帽支持外部組件216。輸出軸225延伸通過第一靜止支架240中的軸承，并與第一鏈輪241相偶合。如舉例所示，輸出軸225具有管狀孔222,其從位于密封之間的第一靜止支架240中的第一端口或通道289延伸至內(nèi)部組件215，使得流體載體的流動(dòng)可從內(nèi)部組件215中通過靜止支架240而退出。內(nèi)部組件235的第一217和第二218末端帽與外部支架220中的軸頸292、295之間是葉片組件50a和50b的第一227和第二226轂。在輸入軸223上的第二轂226通過釘231偶合至輸入軸223，使得第二轂226隨輸入軸223旋轉(zhuǎn)。每個(gè)轂227、226具有軸向延伸的通道，用于傳送載體4吏之穿過轂。輸入軸223延伸穿過第二靜止支架260中的軸承，該支架用于旋轉(zhuǎn)式支持輸入軸223。第二徑向通道267延伸穿過輸入軸223到保持塾圏和環(huán)的過渡位置，所述墊圏和環(huán)設(shè)置在面板與支架260之間的第二環(huán)狀凹陷232中。第二末端帽組件291中的第三放射狀通道272允許凹陷中流體載體從第二末端帽組件291中退出。盡管沒有顯示，第三通道272連接穿過管線和Y型至通道278和279的每個(gè)。圖4中顯示樣品端口，其中沿第一軸延伸的第一鉆孔237與腔室230的角233相交，形成受限的開口234。該鉆孔237在一端帶有沉孔和帶螺紋的環(huán)，以螺紋性接受圓柱形閥組件236。閥組件236具有互補(bǔ)成形的頂端，以M開口234并稍孩i突出到腔室230的內(nèi)部。閥組件236上的O環(huán)243提供密封。沿第二軸的第二鉆孔244與第一鉆孔237相交在O環(huán)243與開口234之間的位置。彈性體或塑料阻塞物245封閉了第二鉆孔244，并且可用皮下注射器iiA^用以取樣品。為了取樣品,閥組件236向后移，以4吏得開口234和鉆孔244可以進(jìn)入。然后可使用注射器提取樣品，開口234可被重新封閉。沒有外部污染到達(dá)TVEMF生物反應(yīng)器10的內(nèi)部。在運(yùn)行中,載體輸入到第二端口或通道266,而后到軸通道，由此通過第三放射狀通道272到達(dá)第一放射狀設(shè)置的通道278和第二放射狀設(shè)置的通道279。當(dāng)栽體通過軸頸292、294中的徑向通道進(jìn)入腔室230時(shí)，栽體撞擊在轂227、226的末端表面228、229上，并放射狀以及軸向分歉而通過轂227、226中的通道。通過轂227、226的載體撞擊在末端帽組件217、218上，并且放射狀分?jǐn)滈_來。進(jìn)入流體栽體的液流因此放射狀向外離開徑向軸221，并以螺旋管形式流動(dòng)，通過聚酯布224以及濾器裝置235中的開口從每個(gè)末端退出，以經(jīng)過通道266和289退出。通過控制外部支架220、腔室230和內(nèi)部濾器裝置235的旋轉(zhuǎn)速度和旋轉(zhuǎn)方向,可獲得任何期望類型的栽體動(dòng)作。然而，重要的是這種事實(shí)，可以在連續(xù)供應(yīng)新鮮流體載體的同時(shí)獲得回轉(zhuǎn)器操作。如果不使用集成式環(huán)形線加熱器296施加隨時(shí)間變化的電磁力，可通過另一個(gè)優(yōu)選的隨時(shí)間變化電磁力源進(jìn)行施加。例如，圖6-8舉例說明了隨時(shí)間變化電磁力設(shè)備140，其提供電磁力給生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述生物反應(yīng)器不帶有集成式隨時(shí)間變化電磁力、而是帶有相鄰的隨時(shí)間變化電磁力裝置。具體地，圖6是隨時(shí)間變化電磁力裝置140的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。圖6是裝置140的側(cè)面投影圖，其中包含支持基座145，支持在基座145之上的圓柱體線圈支持物146，其中線圏147圍繞支持物146纏繞。圖7是圖6中舉例說明的隨時(shí)間變化電磁力裝置140的前投影圖。圖8是隨時(shí)間變化電磁力裝置140的前投影圖，其舉例說明在運(yùn)行中整個(gè)生物反應(yīng)器148放入圓柱體線團(tuán)支持物146中，該支持物146由支持基座145所支持并由線圏147所纏繞。因?yàn)殡S時(shí)間變化電磁力裝置140鄰近生物反應(yīng)器148,隨時(shí)間變化電磁力裝置140可重復(fù)使用。另外，因?yàn)殡S時(shí)間變化電磁力裝置140鄰近生物反應(yīng)器148,裝置140可用于在所有類型的生物反應(yīng)器中產(chǎn)生電磁力，優(yōu)選旋轉(zhuǎn)型。運(yùn)行中，在TVEMF擴(kuò)增期間，本發(fā)明的TVEMF生物反應(yīng)器l()在細(xì)胞培養(yǎng)腔室中包含外周血混合物。在TVEMF擴(kuò)增期間，可以評(píng)估并調(diào)節(jié)含有外周血混合物的腔室的旋轉(zhuǎn)速度，以使得外周血混合物基本上保持在徑向軸處或者在徑向軸周圍。確保提高轉(zhuǎn)速以防止與壁撞擊。例如，如果外周血混合物中的外周血干細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)循環(huán)的向下側(cè)時(shí)過分向內(nèi)向下落以及在旋轉(zhuǎn)循環(huán)的向上側(cè)時(shí)過分向外并且不充分向上，則優(yōu)選提高轉(zhuǎn)速。最優(yōu)情況下,建議用戶優(yōu)選地選擇旋轉(zhuǎn)速率以使得壁碰撞頻率和強(qiáng)度盡可能小，從而維持外周血干細(xì)胞的三維幾何結(jié)構(gòu)以及它們的細(xì)胞-細(xì)胞支持和細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。本發(fā)明優(yōu)選的速率是從5到120RPM,更優(yōu)選從10到30RPM。外周血混合物可優(yōu)選地通過透明培養(yǎng)腔室優(yōu)選地在視覺上評(píng)價(jià)，并手動(dòng)調(diào)節(jié)。外周血混合物的評(píng)價(jià)和調(diào)節(jié)也可通過傳感器(例如，激光)自動(dòng)進(jìn)行,該傳感器監(jiān)測外周血干細(xì)胞在TVEMF生物反應(yīng)器IO中的位置。指示過多細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的傳感器讀數(shù)將自動(dòng)引起相應(yīng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速的機(jī)制。另外，在運(yùn)行中，本發(fā)明預(yù)期電磁發(fā)生裝置被打開并調(diào)節(jié)，使得方波輸出在含有外周血混合物的腔室中產(chǎn)生期望的電磁場，優(yōu)選在0.05高斯到6高斯的范圍。優(yōu)選地，所述方波的頻率約2至約25周/秒，更優(yōu)選約5至約20周/秒，例如約10周/秒，并且導(dǎo)體的RMS值約1至約1000mA，優(yōu)選約1至約6mA。然而，這些參數(shù)并不意味著限制本發(fā)明的TVEMF，因?yàn)檫@可以基于本發(fā)明的其它方面而有變化。例如可以通過標(biāo)準(zhǔn)裝備比如EN131細(xì)胞傳感器高斯測量儀來測量TVEMF。按照本發(fā)明所預(yù)期，在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，可對(duì)受到隨時(shí)間變化電磁力的旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器作出多種改變，因此本文所含的所有內(nèi)容應(yīng)該被理解為舉例說明，而不是限制。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明下文的定義用于輔助描述和理解本
發(fā)明內(nèi)容中所定義的術(shù)語。這些定義并不意味將這些術(shù)語限制在少于通過本申請(qǐng)所描述的內(nèi)容。另外，關(guān)于TVEMF包括幾種定義，在此方面的所有定義應(yīng)4皮理解為互相補(bǔ)充，而不應(yīng)理解為互相抵觸。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"成體干細(xì)胞"指多能性細(xì)胞,其是未分化的且能產(chǎn)生多種分化細(xì)胞。在本發(fā)明中,成體干細(xì)胞優(yōu)選CD34+/CD38-。成體千細(xì)胞還被稱為體細(xì)胞干細(xì)胞，而丕是直接來源于胚胎的胚胎干細(xì)胞。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"外周血"指全身的血液，也即在哺乳動(dòng)物全身性循環(huán)或已經(jīng)循環(huán)的血液。所述哺乳動(dòng)物不是胎兒。對(duì)于本發(fā)明的目的，沒有理由區(qū)分位于相同循環(huán)回路中不同部分處的血液。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"外周血細(xì)胞，，指來自外周血的細(xì)胞。能夠復(fù)制的外周血細(xì)胞可在TVEMF生物反應(yīng)器中經(jīng)歷TVEMF擴(kuò)增，并且可存在于本發(fā)明的組合物中。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"外周血干細(xì)胞，，指來自外周血的成體干細(xì)胞。外周血干細(xì)胞是成體干細(xì)胞，也稱為體細(xì)胞干細(xì)胞(somaticstemcell)，而不是直接來自胚胎的胚胎干細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的外周血干細(xì)胞是CD34+/CD38-細(xì)胞。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"外周血干細(xì)胞組合物，，或?qū)ζ湟檬侵副景l(fā)明的外周血細(xì)胞，或者(1)每單位體積的數(shù)量至少是天然存在的外周血源的7倍并且與天然存在的外周血細(xì)胞具有相同或類似的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞-細(xì)胞支持，和/或者(2)經(jīng)歷TVEMF擴(kuò)增并維持上文提到的幾何結(jié)構(gòu)和支持。伴隨外周血干細(xì)胞的是某種載體，或者是藥用可接受的栽體、血漿、血液、白蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)基、生長因子、銅螯合劑、激素、緩沖劑、低溫保存劑、或者一些其它物質(zhì)。參考天然存在的外周血，優(yōu)選比較本發(fā)明的外周血干細(xì)胞與它們的原始外周血來源。但是，如果此比較不可用，那么天然存在的外周血可指外周血的平均或典型特征，優(yōu)選相同哺乳動(dòng)物物種作為本發(fā)明外周血干細(xì)胞的來源。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"外周血混合物，，指外周血細(xì)胞與允許所述細(xì)胞擴(kuò)增的物質(zhì)的混合物，該物質(zhì)比如用于細(xì)胞生長的培養(yǎng)基，該物質(zhì)可放置于TVEMF生物反應(yīng)器中(比如在細(xì)胞培養(yǎng)腔室中)。所述外周血細(xì)胞可簡單地通過將全外周血與諸如細(xì)胞培養(yǎng)基之類的物質(zhì)相混合而存在于外周血混合物中。此外，外周血混合物也可由來自外周血的細(xì)胞制備物比如"血沉棕黃層，，制成，按照貫穿本申請(qǐng)所述，該外周血含有外周血干細(xì)胞。優(yōu)選地，外周血混合物包含CD34+/CD38-外周血干細(xì)胞以及Dulbecco，s培養(yǎng)基(DMEM)。優(yōu)選的，至少一半的外周血混合物是細(xì)胞培養(yǎng)基比如匪EM。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"TVEMF"指"隨時(shí)間變化的電磁力(TimeVaryingElectromagnetic!Force)，，。3口上-斤討論，本發(fā)明的TVEMF是方波(在傅立葉曲線之后)。優(yōu)選地，所述方波的頻率是約10周/秒，并且導(dǎo)體的RMS值約1至約1000mA，優(yōu)選約1至約6mA。然而，這些參數(shù)并不意味著限制本發(fā)明的TVEMF，因?yàn)檫@可以基于本發(fā)明的其它方面而有變化。例如可以通過標(biāo)準(zhǔn)裝備比如EN131細(xì)胞傳感器高斯測量儀來測量TVEMF。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"TVEMF生物反應(yīng)器"指施加T、EMF的旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器，如上文中所更詳細(xì)描述的。施加到生物反應(yīng)器上的TVEMF優(yōu)選在0.05到6.0高斯的范圍內(nèi)，優(yōu)選0。05I5高斯。例如如圖2、3、4和5，作為TVEMF生物反應(yīng)器的實(shí)例(不意味著限制)。在一個(gè)簡單的實(shí)施方案中，本發(fā)明的TVEMF生物反應(yīng)器使得封閉的外周血混合物在適當(dāng)?shù)母咚顾较?根據(jù)施加的TVEMF)旋轉(zhuǎn)，并允許其中的外周血細(xì)胞(包括干細(xì)胞)擴(kuò)增。優(yōu)選地，TVEMF生物反應(yīng)器允許交換生長培養(yǎng)基(優(yōu)選帶有添加劑)并允許對(duì)外周血混合物充氧氣。所述TVEMF生物反應(yīng)器提供用于細(xì)胞生長數(shù)天或更多的機(jī)制。不限于任何理論，所述TVEMF生物反應(yīng)器使得反應(yīng)器中的細(xì)胞受到TVEMF，以使得TVEMF穿過細(xì)胞，因此《吏之經(jīng)歷TVEMF擴(kuò)增。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"TVEMF擴(kuò)增的外周血細(xì)胞，，指在置于TVEMF生物反應(yīng)器中并受到約0.05至6.0高斯的TVEMF之后每單位體積數(shù)量增加的外周血細(xì)胞。每單位體積數(shù)量上的增加是細(xì)胞在TVEMF生物反應(yīng)器中復(fù)制的結(jié)果，使得細(xì)胞總數(shù)增加。每單位體積中細(xì)胞數(shù)量增加明確地不是因?yàn)榱黧w體積的簡單減少，例如，血液體積從70ml減少到10ml從而每ml細(xì)胞的數(shù)量增加。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞"指在置于TVEMF生物反應(yīng)器并受到約0.05至6.0高斯的TVEMF之后每單位體積數(shù)量增加的外周血干細(xì)胞?！雒繂挝惑w積干細(xì)胞數(shù)量上的增加是細(xì)胞在TVEMF生物反應(yīng)器中復(fù)制的結(jié)果，使得生物反應(yīng)器中干細(xì)胞總數(shù)增加。每單位體積中干細(xì)胞數(shù)量的增加明確地不產(chǎn)因?yàn)榱黧w體積的簡單減少，例如,血液體積從70ml減少到10ni!從而每ml干細(xì)胞的數(shù)量增加。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"TVEMF擴(kuò)增"(TVEMF-expanding)指在TVEMF(旋轉(zhuǎn))反應(yīng)器中在TVEMF存在下TVEMF反應(yīng)器中細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制(分裂并生長)的步驟。外周血干細(xì)胞(優(yōu)選CD34+ZCD38-干細(xì)胞)優(yōu)選復(fù)制且不經(jīng)歷進(jìn)一步分化，使得在生物反應(yīng)器中期間，根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增的所有或基本所有CD34+/CD38-干細(xì)胞復(fù)制但不分化。"基本所有"意思是指至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、甚至更優(yōu)選至少97%、最優(yōu)選至少99%的CD34+/CD38-細(xì)胞不分化，寸吏得它們?cè)赥VEMF擴(kuò)增期間不再是CD34+/CD38-0按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"TVEMF擴(kuò)增，，(TVEMF-expansion)指TVEMF生物反應(yīng)器中的外周血細(xì)胞，優(yōu)選外周血干細(xì)胞，通過讓細(xì)胞受到約0.05到約6.0高斯的TVEMF,使之?dāng)?shù)量增加的過程。優(yōu)選地，外周血干細(xì)胞，其數(shù)量的增加在每單位體積的數(shù)量上至少M(fèi)始外周血來源的7倍。根據(jù)本發(fā)明的TVEMF生物反應(yīng)器中的外周血干細(xì)胞的擴(kuò)增提供了維持或具有與TVEMF擴(kuò)增前外周血千細(xì)船目同或基本相同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)的外周血干細(xì)胞。TVEMF擴(kuò)增的其它方面也可提供本發(fā)明的外周血干細(xì)胞的異乎尋常的特征。不受到理論的限制，TVEMF擴(kuò)增不只提供高濃度的維持三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持的外周血干細(xì)胞。不受到理論的限制，TVEMF可以在TVEMF擴(kuò)增期間干細(xì)胞的一些性質(zhì)，例如上調(diào)促進(jìn)生長的基因，或者下調(diào)阻止生長的基因?？傊?，TVEMF擴(kuò)增導(dǎo)致了促進(jìn)生長但是總體上不導(dǎo)致分化。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞，，指經(jīng)歷了TVEMF擴(kuò)增過禾呈的細(xì)胞。貫穿本申請(qǐng)，修復(fù)組織、治療疾病或病況并非意p未著排他性的，而是涉及總體上組織修復(fù)的目的，其中組織的改善是由于施用如本文所討論的干細(xì)胞。盡管本發(fā)明部分地涉及癥狀性并且可能危及生命的疾病或病況的治療，但本發(fā)明還意味著包括治療小的修復(fù)，以及甚至在哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)健康的癥狀或問題被注意到之前通過早期導(dǎo)入擴(kuò)增的干細(xì)胞而阻止/預(yù)防疾病或病況。貫穿本申請(qǐng)，使用術(shù)語"修復(fù)"、"補(bǔ)充"和"再生"。這些術(shù)語并沒有互相排他性的,而是涉及總體上的組織修復(fù)。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"有毒物質(zhì)"或者相關(guān)術(shù)語可指對(duì)細(xì)胞優(yōu)選外周血干細(xì)胞、或者對(duì)患者有毒性的物質(zhì)。具體地，術(shù)語有毒物質(zhì)指死細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、以及可以是外周血中特有的或不常見的物質(zhì)(如鐮刀狀細(xì)胞、或者其它組織或廢物)。其它有毒物質(zhì)在本申請(qǐng)中有所討論。從血液中除去這些物質(zhì)是本領(lǐng)域中公知的，尤其是涉及將血液制品導(dǎo)入患者的領(lǐng)域。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"骨髄提取"(aph謹(jǐn)isofb腿emarrow)表示將針插入骨中并抽取骨髓。這種提取是本領(lǐng)域公知的。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"自體"是指供體(擴(kuò)增前外周血干細(xì)胞的來源)和受體是同一哺乳動(dòng)物的情況。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"異體"是指供體(擴(kuò)增前外周血干細(xì)胞的來源)和受體不是同一哺乳動(dòng)物的情況。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"CD34+"是指在血細(xì)胞表面上存在表面抗原(CD34)。CD34蛋白在所有發(fā)育狀態(tài)中存在于造血干細(xì)胞表面上。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"CD38-，，是指在血細(xì)胞表面上缺少表面抗原(CD38)。CD38不存在于本發(fā)明干細(xì)胞的表面上。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)，，是指細(xì)胞互相之間的幾何結(jié)構(gòu)，其中包括間隔、間距和物理關(guān)系。例如，本發(fā)明TVEMF擴(kuò)增的干細(xì)胞互相之間位于體內(nèi)。所述擴(kuò)增細(xì)胞在細(xì)胞之間天然間隔的界限內(nèi)，相對(duì)而言例如二維擴(kuò)增容器，其中不保持這種間隔。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"細(xì)胞-細(xì)胞支持"表示一個(gè)細(xì)胞向鄰近細(xì)胞提供的支持。例如，健康組織和細(xì)胞維持與體內(nèi)其它細(xì)胞的相互作用比如化學(xué)、激素、神經(jīng)(其中適用/適當(dāng))相互作用。在本發(fā)明中，這些相互作用維持在正常功能參數(shù)范圍內(nèi),意思是指例如它們不開始向其它細(xì)胞發(fā)送有毒或破壞性信號(hào)(除非在天然血液環(huán)境中如此進(jìn)行)。按照貫穿本申請(qǐng)的應(yīng)用，術(shù)語"三維幾何結(jié)構(gòu)"是指細(xì)胞在三維狀態(tài)(與其天然狀態(tài)相同或非常相似)的幾何結(jié)構(gòu)，與例如生長于Petri培養(yǎng)皿中細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的二維幾何結(jié)構(gòu)相反，其中細(xì)胞被編變和/或拉抻。對(duì)于以上三個(gè)定義中每一個(gè)，涉及維持本發(fā)明干細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞支持和幾何結(jié)構(gòu)以及三維幾何結(jié)構(gòu)時(shí)，術(shù)語"基本相同，，意思是指在本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞中提供正常的幾何結(jié)構(gòu)和支持,使得所述細(xì)胞不以這種方式改變，這種方式例如使得失去功能、修復(fù)組織、或者對(duì)其它細(xì)胞有毒或有害。關(guān)于上文所定義術(shù)語或其它本申請(qǐng)中所使用術(shù)語的其它陳述不意味著受到上述定義的限制，而是可對(duì)這些定義作出貢獻(xiàn)。在本申請(qǐng)中提供了關(guān)于本發(fā)明各個(gè)方面的信息，這并不意味著只限制在它所包含的部分，而是意味著對(duì)從整體上理解本發(fā)明作出貢獻(xiàn)。本發(fā)明涉及到提供快速可用的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞的來源，用于修復(fù)、補(bǔ)充和再生哺乳動(dòng)物優(yōu)選人體組織。本發(fā)明可通過如下文描述的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行更完整的描述，但是不應(yīng)理解為限制于此。操作方法一制備TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物以及使用該組合物在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，描述了用于制備TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞的方法，所述干細(xì)胞可協(xié)助身體修復(fù)、替換和再生組織或者可用于研究中。外周血從哺乳動(dòng)物收集，優(yōu)選靈長類哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人，例如本申請(qǐng)中所述以及本領(lǐng)域已知，并且優(yōu)選通過本領(lǐng)域已知的注射器。例如可以收集外周血，并且立即擴(kuò)增或者低溫保藏供以后使用。僅僅從認(rèn)中以不危機(jī)對(duì)象的量獲取外周血。優(yōu)選地收集約10至約500ml外周血，更優(yōu)選100-300ml，甚至更優(yōu)選150-200mi。才艮據(jù)本發(fā)明收集外周血沒有限制性含義，但也可以包括例如直接收集哺乳動(dòng)物外周血、合并來自一個(gè)或多個(gè)來源的外周血，間接收集外周血例如通過從商業(yè)或其他來源獲得血液，包括例如從"血庫，，中的低溫保藏血。典型地，當(dāng)直接從哺乳動(dòng)物收集時(shí),將外周血抽取到一或多個(gè)注射器中，優(yōu)選其中含有抗凝劑。外周血然后可以分離很多份;白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血漿。這通過離心機(jī)(旋轉(zhuǎn)血液容器直至分開血液的裝置)或者通過沉淀(例如注射沉淀物到血液容器使得血液分離的擴(kuò)增)進(jìn)行。第二，一旦外周血被分成紅細(xì)胞(RBC)在底部，白細(xì)胞(WBC)在中間，和血漿在頂部，取出所述白細(xì)胞保存。中間層也稱"血沉棕黃層"含有目標(biāo)外周血干細(xì)胞,不需要該血液的其它部分。對(duì)于一些血庫，這將是他們加工處理的程度。然而，另—些血庫將通過從WBC中取出單個(gè)核細(xì)胞(在此情況下是白細(xì)胞的一個(gè)亞類)從而基序處理血沉棕黃層。盡管并非每個(gè)人同意該方法，這樣保存更少并且保存所述細(xì)胞所需低溫液氮更少。另一種分離外周血細(xì)胞的方法是將全部收集的白細(xì)胞在分離器比如CobeSpectra細(xì)胞分離器中進(jìn)行一或多輪(優(yōu)選3輪)連續(xù)流白細(xì)胞去除(leukapheresis)。這種處理將使具有一個(gè)核的外周血細(xì)胞與其它外周血細(xì)胞相分離。所述干細(xì)胞是具有一個(gè)核的組的一部分。分離血細(xì)胞的其它方法是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選從外周血樣品中去除RBC。盡管人們可能煽油相同的HLA類型(對(duì)于千細(xì)胞移植是需要的)，它們可以不具有相同的血液類型。通過去除RBC,可以盡可能減少對(duì)千細(xì)胞移植的不良反應(yīng)。因此，通過去除RBC，干細(xì)胞樣品具有與更多/4目容的更好機(jī)會(huì)。當(dāng)RBC解凍時(shí)還可能破裂，從而釋放游離血紅蛋白。這種類型的血紅蛋白能嚴(yán)重影響接受移植的人的腎臟。此外，當(dāng)RBC破裂時(shí)干細(xì)胞的活力降低。另外，尤其是如果低溫保存外周血或者將外周血轉(zhuǎn)移入另一哺乳動(dòng)物，可以檢驗(yàn)該血液以確保不存在傳染病或遺傳病，比如HIV/AIDS、肝炎、白血病或免疫疾病。如果存在這種疾病，該血液可以拋棄或者使用同時(shí)具有與代理人將來可能有未來的使用者可以考慮。'在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，可以從供體獲得血細(xì)胞。在收集之前，優(yōu)選用G-CSF(優(yōu)選量0.3ng至5ug，更優(yōu)選1ng/kg至100ng/kg，甚至更優(yōu)選5ng/kg至20ng/kg，甚至更優(yōu)選6ng/kg)在3天中每12小時(shí)處理供體然后在第4天中處理一次供體。在一種優(yōu)選方法中,還施用相似量的GM-CSF。另一些替代方案是單獨(dú)使用GM-CSF、或者使用其它生長因子分子、白細(xì)胞介素。然后從供體收集血液，并可以外周血混合物整體使用或者如本申請(qǐng)所討論首先分離成細(xì)胞部分，在此所述細(xì)胞部分包括干細(xì)胞(CD34+/CD38-)被用于制備待擴(kuò)增的外周血混合物。例如，可以通過將供體血總體積通過分離器比如CobeSpectra細(xì)胞分離器進(jìn)行3輪連續(xù)流白細(xì)胞去除。優(yōu)選地所擴(kuò)增干細(xì)胞被重新導(dǎo)入同一供體，其中供體需要如本文所討論的組織修復(fù)。然而，如本文所指，還可以使用異體導(dǎo)入。對(duì)于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員，其它收集前施用都將是顯而易見的。優(yōu)選地，從外周血中除去紅細(xì)胞，包括外周血干細(xì)胞的剩余細(xì)胞與合適培養(yǎng)基一起置于TVEMF生物反應(yīng)器中(見"外周血混合物")，比如見此處所描述的。在本發(fā)明一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，僅僅將上文所述的"血沉棕黃層，，(其包括外周血干細(xì)胞，如本申請(qǐng)所討論的)置于TVEMF生物反應(yīng)器中。其它實(shí)施方案包括移去其他非干細(xì)胞以及外周血成分，以制備不同的外周血制備物。這種外周血制備物甚至可含有作為剩下的僅有外周血組分的CD34+/CD38-外周血干細(xì)胞。除去外周血細(xì)胞中的非干細(xì)胞類型可通過負(fù)性分離技術(shù)(negativeseparationtechniques)來實(shí)現(xiàn)，其比如但不限于沉降和分離。許多負(fù)性分離方法是本領(lǐng)域公知的。但是，正性選擇技術(shù)也可使用，并且在本發(fā)明中是優(yōu)選的。用于除去血液中多種組分和正性選擇CD34+ZCD38-的方法是本領(lǐng)域中已知的，只要它們不裂解或者不可逆地?fù)p傷所期望的外周血干細(xì)胞就可以使用。例如，可應(yīng)用對(duì)CD34+ZCD38-有選擇性的親和方法。優(yōu)選地，從外周血中制備如上文所述的"血沉棕黃層"，然后從"血沉棕黃層，，中分離出其中的CD34十/CD38-細(xì)胞用于TVEMF擴(kuò)增。所收集的外周血，或者如上文所述的期望細(xì)胞部分，必須置于TVEMF生物反應(yīng)器中用于TVEMF擴(kuò)增。如上文所討論的，術(shù)語"外周血混合物"包含外周血(或者期望細(xì)胞部分，例如沒有紅細(xì)胞的外周血，或者優(yōu)選從外周血中分離出的CD34十/CD38-外周血千細(xì)胞)與允i午這些細(xì)胞擴(kuò)增的物質(zhì)的混合物，這些物質(zhì)比如用于細(xì)胞生長的介質(zhì)，其將置于TVEMF生物反應(yīng)器中。細(xì)胞培養(yǎng)基、允許細(xì)胞生長和擴(kuò)增的介質(zhì)是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選地，允許細(xì)胞擴(kuò)增的物質(zhì)是細(xì)胞培養(yǎng)基，更優(yōu)選是Dulbecco，s培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)基的組分顯然必須不殺死或損傷細(xì)胞。在TVEMF擴(kuò)增之前或期間，其它組分也可添加到外周血混合物中。例如，外周血可置于帶有Dulbecco，s培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，并且另外添加5%的(或者其它所需量，比如在約1%到10%的范圍)AA清白蛋白。外周血混合物的其它添加物，包括但不限于生長因子、銅螯合劑、細(xì)胞因子、激素和其它可增強(qiáng)TVEMF擴(kuò)增的物質(zhì)，也可在外周血置于生物反應(yīng)器中之前，在生物反應(yīng)器外部或內(nèi)部加入到外周血中。優(yōu)選地，來自一個(gè)個(gè)體的外周血收集物的全部體積(優(yōu)選人外周血量為約10ml到約500ml，更優(yōu)選100ml到約300ml，甚至更優(yōu)選150ml到約2聽ml外周血)與細(xì)胞培養(yǎng)基比如Dulbecco，s培養(yǎng)基(DMEM)相混合，并且添加5%人血清白蛋白,以制備外周血混合物用于TVEMF擴(kuò)增。例如，對(duì)于50至100ml外周血樣，優(yōu)選使用約25至約100mlDMEM/5。/。人血清白蛋白，使得外周血混合物的總體積在置于生物反應(yīng)器時(shí)為約75到約200ml。作為一船現(xiàn)則，收集外周血越多越好;例如，如果從一個(gè)個(gè)體收集了超過200ml,優(yōu)選j吏用此外周血中的所有干細(xì)胞。在可獲得更大體積的情況下，例如通過合并外周血(從相同或不同來源)，可以優(yōu)選多于一個(gè)劑量。當(dāng)外周血收集物合并并一起TVEMF擴(kuò)增時(shí)，使用灌注TVEMF生物反應(yīng)器是特別有用的。本發(fā)明的銅螯合劑可以是任何無毒性銅螯合劑，并且優(yōu)選是青霉胺或鹽酸三乙撐四胺。更優(yōu)選地，所述青霉胺是D(+2-M-3巰基-3-曱基丁酸(D(-)-2-Amino-3-Mercaptor-3-MethylbutanicAcid，Sigma-AWrich)，其溶于DMSO中并以約10ppm的量加到外周血混合物中。所述銅螯合劑還可以施用給哺乳動(dòng)物，然后直接從該哺乳動(dòng)物收集外周血。在從所述哺乳動(dòng)物收集外周血之前，優(yōu)選地這種施用超過1天，更優(yōu)選超過2天。無論是加到外周血混合物自身中或者施用給供血哺乳動(dòng)物、或者兩者都進(jìn)行，銅螯合劑的目的是在TVEMF擴(kuò)增之前降低外周血中銅的量。不限于理論，相信可用銅量的降低可以增強(qiáng)TVEMF擴(kuò)增。術(shù)語"置于TVEMF生物反應(yīng)器中，，沒有限制性含義，外周血混合物可完全在生物反應(yīng)器外部制成，然后再將混合物置于生物反應(yīng)器中。外周血混合物也可全部在生物反應(yīng)器內(nèi)部混合。例如，外周血(或其細(xì)胞部分)可與I)i"becco，s培養(yǎng)基并且添加5%人血清白蛋白一起置于生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)基和血清白蛋白或者是已經(jīng)存在于生物反應(yīng)器中，或者是同時(shí)添加到生物反應(yīng)器中，或者在外周血之后加入到生物反應(yīng)器中。待置入TVEMF生物反應(yīng)器的本發(fā)明的優(yōu)選外周血混合物包含以下成分分離自外周血樣品的血沉棕黃層的CD34+/CD38-千細(xì)胞，和Dulbecco，s培養(yǎng)基，其與CD34+/CD38-細(xì)胞一共約150-250mS，優(yōu)選約200ml。更優(yōu)選地，將G-CSF(粒細(xì)胞集落刺'激因子)包括在外周血混合物中。優(yōu)選地，G-CSF的存在量足以刺激外周血干細(xì)胞的TVEMF擴(kuò)增。更優(yōu)選地，在TVEMF擴(kuò)增之前外周血混合物中存在的G-CSF的量是約25到約200ng/ml混合物，更優(yōu)選約50到約150ng/ml混合物，再優(yōu)選是約100ng/ml。TVEMF生物反應(yīng)器容器(含有包括外周血干細(xì)胞的外周血混合物)以一定速度旋轉(zhuǎn)，該速度使得外周血干細(xì)胞懸浮并維持其三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，旋轉(zhuǎn)速度是5-120rpm;更優(yōu)選是10-30rpm。這些旋轉(zhuǎn)速度沒有限制性含義，旋轉(zhuǎn)速度將至少部分依賴于生物反應(yīng)器類型和細(xì)胞培養(yǎng)室大小以^Jt入其中的樣品。在細(xì)胞位于TVEMF生物反應(yīng)器期間，優(yōu)選向它們供應(yīng)營養(yǎng)物和新鮮培養(yǎng)基(例如，DMEM和5%人血清白蛋白，見上流體載體的討論)，使其接觸到激素、細(xì)胞因子、和/或生長因子(優(yōu)選G-CSF);并除去有毒物質(zhì)。從TVEMF生物反應(yīng)器中的外周血細(xì)胞中除去的有毒物質(zhì)包括垂死細(xì)胞的有毒顆粒物質(zhì)以及粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的有毒物質(zhì)。細(xì)胞的TVEMF擴(kuò)增受到控制，使得細(xì)胞優(yōu)選擴(kuò)增(每單位體積的數(shù)量增加)至少七倍。優(yōu)選地，外周血干細(xì)胞(以及其它細(xì)胞，如果存在的話)經(jīng)過至少4天的TVEMF擴(kuò)增，優(yōu)選約7到約14天，更優(yōu)選約7到約10天，再優(yōu)選約7天。TVEMF擴(kuò)增可在TVEMF生物反應(yīng)器中持續(xù)到長達(dá)160天。盡管TVEMF擴(kuò)增甚至可長于160天，此種長度的擴(kuò)增不是本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案。優(yōu)選地，TVEMF擴(kuò)增在TVEMF生物反應(yīng)器中在約26。C到約41。C的溫度實(shí)施，更優(yōu)選地，在37。C的溫度實(shí)施。監(jiān)測正在經(jīng)歷TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞的總體擴(kuò)增的一個(gè)方法是通過視覺檢查。外周血干細(xì)胞典型地是暗紅色。優(yōu)選地，用于形成外周血混合物的培養(yǎng)基在顏色上是淺色或無色。一旦生物反應(yīng)器開始旋轉(zhuǎn)并且施加TVEMF，細(xì)胞優(yōu)選聚集在生物反應(yīng)器容器中央，培養(yǎng)基圍繞在有顏色的細(xì)胞簇周圍。通氧氣和添加其它營養(yǎng)物通常不影響通過構(gòu)建在生物反應(yīng)器上觀察窗(典型是透明塑料的)觀察細(xì)胞簇的能力。蔟的形成對(duì)于幫助干細(xì)胞保持它們的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)是重要的；如果所述蔟^LiL細(xì)胞開始接觸到生物反應(yīng)器容器的壁，則提高轉(zhuǎn)速(手動(dòng)或自動(dòng))使得中央的細(xì)胞簇可再次形成。在細(xì)胞簇形成后不久測量可觀察的細(xì)胞蔟直徑，其可與此后的蔟直徑做比較，以顯示出TVEMF生物反應(yīng)器中細(xì)胞大概的增長數(shù)。在TVEMF擴(kuò)增期間細(xì)胞數(shù)量增加的測量也可以按照常規(guī)生物反應(yīng)器領(lǐng)域已知的許多方法進(jìn)行。自動(dòng)傳感器也可包括在TVEMF生物反應(yīng)器中，以監(jiān)測和測量簇尺寸的增加oTVEMF擴(kuò)增過程可被仔細(xì)監(jiān)測，例如由實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員監(jiān)測，其將檢查細(xì)胞簇的形成以確保細(xì)胞在生物反應(yīng)器中保持成簇狀態(tài)，并且當(dāng)細(xì)胞簇開始分散時(shí)將增加生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)。用于監(jiān)測細(xì)胞簇和監(jiān)測生物反應(yīng)器內(nèi)外周血混合物粘性的自動(dòng)系統(tǒng)也可用于監(jiān)測細(xì)胞簇。細(xì)胞簇粘性的改變?cè)赥VEMF擴(kuò)增過程開始約兩天后就可明顯觀察到，并且可在該時(shí)間附近增加TVEMF生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)速度。TVEMF生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)速在TVEMF擴(kuò)增過程中可以變化。優(yōu)選地，旋轉(zhuǎn)速度適時(shí)改變使得正在經(jīng)歷TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞不與TVEMF生物反應(yīng)器容器的側(cè)面接觸。并且，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員可以在TVEMF擴(kuò)增期間，例如一天一次、或每兩天一次，人工(例如使用注射器)，如上文所討論的，往生物反應(yīng)器中加入新鮮培養(yǎng)基和優(yōu)選地其它所需的添加物比如營養(yǎng)物和生長因子，并且抽出含有細(xì)胞廢物和毒素的舊培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基和其它添加物也可在TVEMF擴(kuò)增期間自動(dòng)泵入TVEMF生物反應(yīng)器，廢物則自動(dòng)排出。在置于TVEMF生物反應(yīng)器并進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增之后約7到約14天，外周血干細(xì)胞可增加到它們初始數(shù)量的至少七倍。優(yōu)選地，TVEMF擴(kuò)增持續(xù)約7到10天，更優(yōu)選約7天。因此不需要在TVEMF擴(kuò)增期間進(jìn)行干細(xì)胞數(shù)量的測量。如上文所顯示的并貫穿本申請(qǐng)，本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞具有與天然存在的非TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞相同或基本上相同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。完成TVEMF擴(kuò)增后，TVEMF生物反應(yīng)器中的細(xì)胞材料包含在本發(fā)明組合物中的本發(fā)明的千細(xì)胞?？梢詮乃鼋M合物中除去多種物質(zhì)或者向其添加多種物質(zhì)供進(jìn)一步使用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及離體哺乳動(dòng)物外周血千細(xì)胞組合物，其功能是協(xié)助身體系統(tǒng)或組織進(jìn)行修復(fù)、補(bǔ)充和再生組織,例如，貫穿本申請(qǐng)所描述的組織。所述組合物包含TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞，優(yōu)選外周血干細(xì)胞的每單位體積數(shù)量至少是其來源外周血中每單位體積數(shù)量的七倍。例如，優(yōu)選地，如果將一定體積中的數(shù)量X的外周血干細(xì)胞置于TVEMF生物反應(yīng)器，則TVEMF擴(kuò)增之后，從該相同體積的置于TVEMF生物反應(yīng)器的外周血干細(xì)胞中得到的外周血干細(xì)胞的數(shù)量將至少是7X(除非在擴(kuò)增過程中取出細(xì)胞)。盡管此至少7倍的擴(kuò)增對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施不是必要的，但此擴(kuò)增對(duì)于治療目的是特別優(yōu)選的。例如，如果需要的話，TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞的數(shù)量可以只是天然存在的外周血中的外周血干細(xì)胞數(shù)量的兩倍。優(yōu)選地，TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞是在每單位體積天然存在外周血中的外周血干細(xì)胞數(shù)量的約4倍到約25倍的范圍。本發(fā)明也涉及包含來自哺乳動(dòng)物的外周血干細(xì)胞的組合物，其中所述外周血干細(xì)胞每單位體積中的數(shù)量是來自哺乳動(dòng)物的天然存在外周血中外周血干細(xì)胞數(shù)量的至少七倍；并且其中外周血干細(xì)胞具有與天然存在的外周血干細(xì)胞相同或相似或基本上相同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的組合物可包含藥用可接受栽體，包括但不限于血漿、血液、白蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)基、生長因子、銅螯合劑、激素、緩沖劑或者低溫保存劑。"藥用可接受載體，，意思是允許將干細(xì)胞導(dǎo)入哺乳動(dòng)物優(yōu)選人類的試劑。此載體可包括本文提及的物質(zhì)，具體包括可用于輸血的任何物質(zhì)，比如血液、血漿、白蛋白，還有鹽水或緩沖液(優(yōu)選添加白蛋白的緩沖液)，優(yōu)選來自所述組合物將導(dǎo)入的哺乳動(dòng)物。術(shù)語將組合物"導(dǎo)入"哺乳動(dòng)物，意思是指向動(dòng)物"施用"組合物。優(yōu)選地，將本發(fā)明的干細(xì)胞施用給哺乳動(dòng)物通過靜脈注射來進(jìn)行。然而，也可以使用其它形式的施用，包括例如，直接注射入器官或需要修復(fù)的位點(diǎn)附近，直腸施用(尤其是對(duì)于結(jié)腸疾病)，以及其它方法比如本領(lǐng)域公知的方法，優(yōu)選將干細(xì)胞導(dǎo)入需要修復(fù)的過渡區(qū)域。甚至更優(yōu)選地，與可接受量的G國CSF以及注射，例如0.3ng至5ug的量，更優(yōu)選lng/kg至100ng/kg，甚至更優(yōu)選5ng/kg至20ng/kg,甚至更優(yōu)選6ng/kg。在本發(fā)明組合物中的干細(xì)胞可以與本領(lǐng)域一般狀況所述藥用栽體一起施用。有待在組合物中施用的根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增的干細(xì)胞的量是治療有效量(以下還將討論)，優(yōu)選至少1000個(gè)干細(xì)胞，更優(yōu)選至少104個(gè)干細(xì)胞，甚至更優(yōu)選至少105個(gè)千細(xì)胞，甚至更優(yōu)選至少107至109個(gè)干細(xì)胞的量，或者甚至更多干細(xì)胞比如1012個(gè)干細(xì)胞?？梢酝ㄟ^一次或更多次施用這些數(shù)目的擴(kuò)增干細(xì)胞。如本申請(qǐng)中所指出，施用給患者的干細(xì)胞數(shù)目可能受來源血液中開始可獲得干細(xì)胞的數(shù)目、乘以根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增。不限于理論，相信施用后不被身體所用的干細(xì)胞簡單地通過自然身體系統(tǒng)被去除。"可接受載體，，通常指本發(fā)明外周血干細(xì)胞可在其中存活的任何物質(zhì)，即無論是TVEMF擴(kuò)增之后、低溫保存之前或之后、還是導(dǎo)入(施用)到哺乳動(dòng)物之前對(duì)細(xì)胞沒有毒性。這種載體是本領(lǐng)域公知的，并且可以包括很寬范圍的物質(zhì)，包括貫穿本申請(qǐng)針對(duì)此目的所描述的物質(zhì)。例如，血漿、血液、白蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖劑和低溫保存劑都是本發(fā)明可接受的載體。期望的載體部分取決于期望的用途。本領(lǐng)域已知的其它擴(kuò)增方法(不使用TVEMF)不提供外周血干細(xì)胞在數(shù)量至少是天然存在外周血的至少七倍的擴(kuò)增并且同時(shí)還保持外周血千細(xì)胞三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持不變。TVEMF擴(kuò)增的外周血千細(xì)胞具有與所來源外周血相同或基本上相同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)，或保持其不變。所述組合物可包含TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞，優(yōu)選地在Dulbecco，s培養(yǎng)基懸浮液中或者在準(zhǔn)備用于低溫保存的溶液中。所述組合物優(yōu)選沒有有毒顆粒物質(zhì)，例如垂死細(xì)胞以及粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的有毒物質(zhì)或內(nèi)容物。所述組合物可以是包含TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞的低溫保存組合物，這是通過降低組合物到-120。C到。196。C的溫度，并且保持低溫保存組合物在此溫度范圍直到其用于治療或其它應(yīng)用。如下文所討論，優(yōu)選地，在低溫保存之前盡可能多的從組合物中除去有毒物質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及使用TVEMF擴(kuò)增外周血干細(xì)胞組合物用于再生組織和/或治療疾病比如自身免疫疾病(如上文所討論)的方法，所使用的外周血干細(xì)胞組合物或者是經(jīng)過低溫保存的或者是TVEMF擴(kuò)增完成后不久的。細(xì)胞可被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物身體中，優(yōu)選人類，例如靜脈注射或者直接注射到待修復(fù)組織，以允許身體固有系統(tǒng)修復(fù)和再生組織。優(yōu)選地，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物身體的組合物不含有毒物質(zhì)以及可造成對(duì)所施用TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞有不利反應(yīng)的其它物質(zhì)。該方法(和組合物)可潛在地用于修復(fù)哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的生命關(guān)鍵器官和其它組織，這種潛在應(yīng)用包括但不限于肝臟組織、心臟組織、造血組織、血管、皮膚組織、肌肉組織、腸組織、胰臟組織、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、骨、軟骨組織、結(jié)締組織、肺組織、脾組織、腦組織和其它身體組織。所述細(xì)胞容易獲得用于治療或研究，所述治療或研究需要個(gè)體血細(xì)胞，尤其是如果已經(jīng)發(fā)生疾病并且需要沒有該疾病的細(xì)胞。實(shí)施例1一TVEMF生物反應(yīng)器中實(shí)際的TVEMF擴(kuò)增如下表1所示收集外周血并擴(kuò)增外周血細(xì)胞。A)收集和維持細(xì)胞如上所述通過注射器從人供體獲得人外周血(約0.75xl06細(xì)胞/ml)并懸于Iscovc，s改良Dulbecco，s培養(yǎng)基中實(shí)施例I—TVEMF生物反應(yīng)器中實(shí)際的TVEMF擴(kuò)增如下表1所示收集外周血并擴(kuò)增外周血細(xì)胞。A)收集和維持細(xì)胞如上所述通過注射器^A供體獲得人外周血(75ml;約0.75x106細(xì)胞/ml)并懸于Iscove，s改良Dulbecco，s培養(yǎng)基(IMDM)(GIBCO,GrandIsland,NY)中，其中添加20%的5%人白蛋白(HA)、100ng/ml重組人G-CSF(AmgenInc.,ThousandOaks,CA)、和100ng/ml重組人干細(xì)胞因子(SCF)(Amgen)。外周血混合物置于如圖2和3所示的TVEMF生物反應(yīng)器中。在37°C、6%C02以及正常空氣02/N比下進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增。如本申請(qǐng)中所述，TVEMF生物反應(yīng)器初始以10轉(zhuǎn)/分鐘的速度旋轉(zhuǎn)，然后根據(jù)需要調(diào)節(jié)，以保持外周血細(xì)胞懸于生物反應(yīng)器中。向生物反應(yīng)器施加6mA的時(shí)間變化電流。施加到外周血混合物的方波TVEMF為約0.5高斯。(頻率約10周/秒)。每一至二天更^/更新TVEMF生物反應(yīng)器中外周血混合物中的培養(yǎng)基。第10天時(shí),從TVEMF生物反應(yīng)器中取出細(xì)胞并用PBS洗滌和進(jìn)行分析。結(jié)果列于表l中。對(duì)照數(shù)據(jù)表示未擴(kuò)增的人外周血樣品；擴(kuò)增樣品表示TVEMF擴(kuò)增后的各自對(duì)照樣品。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>從表1可以看出，與未擴(kuò)增對(duì)照相比，外周血細(xì)胞的TVEMF擴(kuò)增導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)在10天中大致增加10倍。每1-2天更換/更新一次細(xì)胞生長的培養(yǎng)基。B)TVEMF擴(kuò)增細(xì)胞的分析用計(jì)數(shù)室(一種諸如血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的裝置，通過將一定體積的對(duì)照細(xì)胞懸液或者擴(kuò)增樣品置于具有微格柵的專門制造顯微鏡載玻片上并計(jì)數(shù)樣品中細(xì)胞數(shù)目來使用)獲得對(duì)照和擴(kuò)增樣品的總細(xì)胞計(jì)數(shù)。TVEMF擴(kuò)增10天后對(duì)照樣品和擴(kuò)增樣品中總細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示于表l中。如下確定表1中相應(yīng)CD34+增加的指標(biāo)用人CD34選擇試劑盒(EasySeppositiveselection,StemCellTechnologies)將擴(kuò)增樣品中CD34+細(xì)胞與其中的其它細(xì)胞相分離，用如上所指計(jì)數(shù)室進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用FACScan流式細(xì)胞儀(Becton-Diddnson)確認(rèn)。通過克隆形成分析計(jì)數(shù)CFU-GEMM和CFU-GM。通過臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)確定細(xì)胞活力(其中活細(xì)胞是活的，無活性細(xì)胞是死的)。所有擴(kuò)增樣品中"是，，的答案表明，CD34+細(xì)胞數(shù)以對(duì)應(yīng)總細(xì)胞計(jì)數(shù)的量增加。C)造血集落形成細(xì)胞的量的增加在此TVEMF擴(kuò)增組織培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)供體外周血細(xì)胞顯著增加造血集落形成細(xì)胞的數(shù)目。經(jīng)過獨(dú)立分析測定，直至第7天一直觀察到CFU-GM(高達(dá)7倍)和CFU-GEMM(高達(dá)9倍)集落形成細(xì)胞數(shù)的穩(wěn)定增加，而沒有顯著的平臺(tái)。D)CD34+細(xì)胞的增加在此TVEMF擴(kuò)增組織培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)來自正常供體的MNC顯著增加CD34+細(xì)胞的數(shù)目。經(jīng)過獨(dú)立分析測定，通過6天培養(yǎng)，CD34+細(xì)胞的平均數(shù)目增加10倍并在此天進(jìn)入平臺(tái)期。操作方法一低溫保存如上文所提及的，從哺乳動(dòng)物優(yōu)選人中收集外周血。優(yōu)選從外周血中至少除去紅細(xì)胞。外周血干細(xì)胞(如果需要，以及其它細(xì)胞和培養(yǎng)基)置于TVEMF生物反應(yīng)器中，受到隨時(shí)間變化電磁力，并且擴(kuò)增。如果在TVEMF擴(kuò)增之前沒有去除RBC，優(yōu)選在TVEMF擴(kuò)增之后將它們?nèi)コ?。TVEMF擴(kuò)增之后的細(xì)胞可低溫保存。此處提供關(guān)于低溫保存TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞的方法以及包含這些細(xì)胞的組合物的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，具體見下文。在TVEMF擴(kuò)增之后，TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞，包括TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞，可以轉(zhuǎn)移到至少一個(gè)含有至少一種低溫保護(hù)劑的低溫保存容器中。TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞優(yōu)選地首先用溶液(例如，緩沖溶液或所期望的低溫保存溶液)進(jìn)行清洗以除去培養(yǎng)基和TVEMF擴(kuò)增過程中存在的其它組分，接著優(yōu)選將其混合在允許對(duì)細(xì)胞低溫保存的溶液中。這種溶液通常稱為低溫保存劑、低溫保存溶液或者低溫保護(hù)劑。所述細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到合適的低溫容器中，此容器一般降溫至-120。C到-196。C,優(yōu)選約-130。C到約-150。C，并且維持在此溫度。優(yōu)選地這種溫度降低緩慢并仔細(xì)進(jìn)行，以免在冷凍過程中破壞或至少盡可能少破壞干細(xì)胞。當(dāng)需要時(shí)，細(xì)胞的溫度(約低溫容器的溫度)上升到與導(dǎo)入人體相容的溫度(通常從約為室溫到約為體溫)，然后TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞可以導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，優(yōu)選人類，例如:^本申請(qǐng)所i寸論。冷凍細(xì)胞通常有破壞性。不限于理論，在降溫過程中，細(xì)胞內(nèi)的水結(jié)冰。然后可通過對(duì)細(xì)胞膜的滲透作用、細(xì)胞脫水、溶質(zhì)濃縮、以及水晶形成而發(fā)生損傷。隨著在細(xì)胞外部形成冰，有效水從溶液中被除去并從細(xì)胞中吸取水分，造成滲透壓脫水并提高了溶質(zhì)濃度，最終破壞了細(xì)胞。(作為討論,見Mazur,P"1977，Cryobioiogy14:251-272.)不同物質(zhì)具有不同的水點(diǎn)。優(yōu)選地，備用于低溫保存的外周血干細(xì)胞組合物包含盡可能少的污染物質(zhì)，以盡可能減少在結(jié)晶和冷凍過程中對(duì)細(xì)胞壁的損傷。這些損傷作用可通過以下來降低或甚至避開:(a)應(yīng)用低溫保護(hù)劑，(b)控制冷凍速率，以及(c)在足夠低的溫度保存，以盡可能減少降解反應(yīng)。在本發(fā)明中優(yōu)選包括低溫保存劑?？墒褂玫牡蜏乇Ｗo(hù)劑包括但不限于足量的，二甲基亞砜(DMSOXLoveioek，J'E.andBishop，M。W,H.,1959，Nature183:1394-1395;Ashwood-Smith，M。J,，1961，Nature190:1204-1205)、甘油、聚乙蜂吡咯烷酮(Rinfret，A,R，1960，Ann,N'Y,AcacLSci,85:576)、聚乙二醇(Sloviter，H,A,認(rèn)dRavdin，R.G，1962，Nature196:548)、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、i-赤鮮醇、D-核糖醇、Db甘露醇(Rowe，A.W.,etal.，1962，F(xiàn)ecLProc。21:157)、D-山梨醇、i-肌醇、D-乳糖、氯化膽堿(Bender,M.A.，etaL，1960,J.Appl.Physiol.15:520)、氨基酸葡萄糖溶液或者氨基酸(PhanTheTranandBender,M.A.，1960,Exp.CellRes.20:651)、曱醇、乙酰胺、單乙酸甘油酉旨(Lovelock,J.E.,1954,Biochem.J.56:265)、和無機(jī)鹽(PhanTheTranandBender,M.A.，1960,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.104:388;PhanTheTranandBender,M.A.，1961inRadiobiology，ProceedingsoftheThirdAustralianConferenceonRadiobiology,IIbery，P.LT.，ed.，Butterworth，London,p.59)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用DMSO。DMSO,液體，低濃度下對(duì)細(xì)胞無毒。作為小分子，DMSO可自由穿過細(xì)胞并通過與水結(jié)合而改變其冷凍性來保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，以及防止形成冰而造成的損害。添加血漿(即，至濃度20-25%)可增加DMSO的保護(hù)效杲。添加DMSO后，細(xì)胞應(yīng)保持在0。C或更低，因?yàn)镈MSO約1%濃度在高于4。C的溫度是有毒的。與TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)船目結(jié)合，我所選擇的優(yōu)選低溫保護(hù)劑對(duì)其全部組成是在60至80%氨基酸葡萄糖溶液中的20至40%二甲基亞砜溶液，或者15至25%的羥乙基淀粉溶液，或者4至6%的甘油、3至5%葡萄糖、6至10%葡聚糖T10,或者15至25%聚乙二醇或者75至85%氨基酸葡萄糖溶液。以上指出的低溫保存劑的量優(yōu)選是全部組合物(而不是僅加到該組合物中物質(zhì)的量)中低溫保存劑的總量。盡管除外周血細(xì)胞和低溫保護(hù)劑之外的其它物質(zhì)可以存在于待低溫保存的本發(fā)明的組合物中，優(yōu)選本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物的低溫保存帶有盡可能少的其它物質(zhì)，例如由于如上文討論的關(guān)于冷凍機(jī)制的原因。優(yōu)選地，本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物冷卻到溫度為約-120。C到約496。C的范圍，優(yōu)選約-130。C到約-196°C，更優(yōu)選為-130。C到約-150°C。受控的緩慢冷卻速率是重要的。不同的低溫保護(hù)劑(Rapatz，Ci，etal.，1968，CryoWology5(1):18。25)和不同的細(xì)胞類型有不同的最優(yōu)冷卻速率(對(duì)于降溫速度對(duì)于外周細(xì)胞存活的影響(以及對(duì)于它們移植潛力的影響)可參見，例如Rowe，A.W.andRinfret，A,P。，1962，B直ood20:636;Rowe，A.W"1966，Cryo固ogy3(1):12-18;Lewis,J.P"etaL,1967，Transfusion7(1):17-32;andMazur，P"1970，Science168:939-949)。水變成冰時(shí)的熔化熱應(yīng)該盡可能小。冷卻過程可通過應(yīng)用例如可編程冷凍設(shè)備或者甲醇浴方法來實(shí)施?？删幊汤鋬鲅b置允許確定最優(yōu)冷卻速率并促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的可重現(xiàn)的冷卻?？删幊趟俾士刂评鋬鲅b置比如Cryomed或Planar允許將冷凍方案調(diào)整到期望的冷卻速率曲線。其它可接受的冷凍裝置可以是，例如，SanyoModelMDF-1155ATN-152C和ModelMDF-2136ATN-135C，PrincetonCryoTechTEC2000。例如，對(duì)于10%DMSO和20%血漿中的外周血細(xì)胞或者CD34+ZCD38-細(xì)胞，最優(yōu)速率為從0。c到-2oo°c，i到y(tǒng)c/分鐘。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，此冷卻速率可用于本發(fā)明所述細(xì)胞。盛有所述細(xì)胞的低溫容器必須在低溫下穩(wěn)定，并且允許快速的熱傳遞，以便于有效控制冷凍和解凍。密封塑料管(例如Nimc、Wheatoncryules)或玻璃安瓿可用于多個(gè)小量(1-2ml)，而較大體積(100-200ml)可在聚烯烴袋(例如Delmed)中冷凍，該聚埽烴袋放在金屬板之間以便在冷卻期間更好的傳遞熱量。(骨髓細(xì)胞袋通過將其置于-8CTC冷凍裝置中成功冷凍，該冷凍裝置幸運(yùn)地提供了約3。C/夯鐘的冷卻速率)。在一個(gè)替代性實(shí)施方案中，可應(yīng)用曱醇浴冷卻方法。曱醇浴方法特別適合大規(guī)模的對(duì)多個(gè)小物品實(shí)施常規(guī)低溫保存。該方法不需要手動(dòng)控制冷凍速率也不需要記錄器監(jiān)測速率。在一個(gè)優(yōu)選的方面，■SO處理的細(xì)胞預(yù)先在冰上冷卻并轉(zhuǎn)移到裝滿冷凍甲醇的盤中，其隨后被置于-130。C機(jī)械冰箱中(例如Harris或Revco)。甲醇浴和樣品的熱電偶檢測顯示期望的1到3。C/分鐘的冷卻速率。在至少兩個(gè)小時(shí)之后,樣品達(dá)到-8(TC，然后可直接將其置于液氮(-196。C)中以永久保存。完全冷凍之后，TVEMF擴(kuò)增的臍干細(xì)胞可快速轉(zhuǎn)移到長期低溫保存容器(比如冷凍器)中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞可低溫保存在液氮(-196。C)中或者其蒸汽(-165。C)中。保存溫度應(yīng)低于-120。C，優(yōu)選低于-13(TC。高效液氮冰箱的可用性大大方《更了這種保存，所述水箱類似于具有極低真空和內(nèi)部超絕熱的大Thermos容器，使得熱量泄漏和氮?dú)饬魇Ф急３衷诮^對(duì)低值。用于低溫保存細(xì)胞的優(yōu)選的裝置和程序由ThermogenesfeCorp.,RanchoCordovo,CA所制造，利用它們的程序降低細(xì)胞溫度到低于-130。C。在冷凍和保存期間細(xì)胞盛放于Thermogenesis血漿袋中。其它冷凍器也可商業(yè)獲得。例如"BioArchive"冷凍器不僅冷凍而且詳細(xì)記錄低溫樣品比如本發(fā)明的血液或細(xì)胞，例如一次管理多達(dá)3,626袋冷凍血。該冷凍器有機(jī)器人臂，接到指示時(shí)可以存取特定樣品，確保其它樣品不受干擾或者暴露于更高溫度。其它商品冷凍器包括但不限于SanyoModelMDF-1155ATN-152C和ModelMDF-2136ATN-135C,和PrincetonCryoTechTEC2000。在TVEMF擴(kuò)增的外周血千細(xì)胞組合物的溫度降低到低于-120。C之后，優(yōu)選低于-130。C，它們可置于裝置中，比如Thermogenesis冷凍裝置。它們的溫度保持在-120。C到-196。C，優(yōu)選-130°C^"-150。C。本發(fā)明的低溫保存TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物的溫度不應(yīng)長時(shí)間高于約-120°C。根據(jù)本發(fā)明的低溫保存的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞或其組合物可冷凍無限長時(shí)間，在需要時(shí)將其解凍。例如，組合物可冷凍長達(dá)18年。甚至更長的時(shí)間也是可行的，可能甚至長iiik液供體的一生。當(dāng)需要時(shí)，其中裝有細(xì)胞的袋可置于解凍系統(tǒng)中，比如ThermogenesisPlasmaThawer或者比如ThermolineThawer系歹'J中的其它裝置。低溫保存的組合物的溫度升至室溫。在另一個(gè)優(yōu)選解凍與低溫保護(hù)劑混合的細(xì)胞的方法中，裝有本發(fā)明的低溫保存的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物的袋，其保存在液氮中，可將其置于液氮的氣相中15分鐘，然后暴露在室溫環(huán)境空氣中5分鐘，最后在37。C水浴中盡可能快的解凍。解凍袋中內(nèi)容物可以立刻用相同體積的溶液稀釋,該溶液是含有2.5%(重量/體積)人血清白蛋白和5%(重量/體積)葡聚糖40(Solplex40;Sifra，Verona,Italy)的等滲鹽溶液，接著400g離心十分鐘。除去上清，用新鮮白蛋白/葡聚糖溶液重懸沉降下來的細(xì)胞?？蓞⒁奟ubinstein,P.etaL，Processingandcryopreservationofplacental/umbiiicaScordbloodforunreiatedbonemarrowreeonstitution。/Voc.7Vto/'/4c"f￡92:10119-1012(1995)forRemovalofHypertonicCryoproteetant;此優(yōu)選解凍細(xì)胞方法的一個(gè)變型可見Lazzari,L.etal.，Evaluationoftheeffectofcryopreservationonexvivoexpansionofhematopoieticprogenitorsfromcordblood,5oweMamwrraws.28:693-698(2001)。在細(xì)胞升溫到室溫后，它們可用于研究或再生治療。解凍的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物可直接導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，優(yōu)選人類，或者以其解凍形式例如用于期望的研究中。解凍細(xì)胞所處的溶液可以完全洗除，與另一種進(jìn)行交換，或者添加到另一種中，或者根據(jù)期望進(jìn)行其它操作。在導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)之前，優(yōu)選在馬上將要導(dǎo)入之前，多種添加物可加入到解凍組合物(或者非低溫保存的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物)中。此類添加物包括但不限于生長因子、銅螯合劑、細(xì)胞因子、激素、適宜的緩沖劑或稀釋劑。優(yōu)選地，添加G國CSF。更優(yōu)選地，對(duì)于人類，以約20到約40jug/kg體重的量添加G-CSF，甚至再優(yōu)選地，以約30jig/kg體重的量。在導(dǎo)入之前，TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物可與哺乳動(dòng)物自身或者合適供體的，血漿、血液或白蛋白、或者其它可與輸血伴隨的物質(zhì)相混合。解凍的外周血干細(xì)胞可用于，例如檢驗(yàn)對(duì)期望用于治療或可用于治療的藥物是否有有害反應(yīng)。盡管FDA尚未批準(zhǔn)在美國將擴(kuò)增的外周血千細(xì)胞用于組織再生，但是此批準(zhǔn)看起來是即將來臨的。足量的擴(kuò)增外周血干細(xì)胞的直接注入應(yīng)能夠用于再生生命關(guān)鍵器官，比如心臟、肝臟、胰臟、皮膚、肌肉、腸、脾臟、腦、以及本申請(qǐng)?zhí)岬降钠渌M織。本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物應(yīng)以足夠?qū)崿F(xiàn)組織修復(fù)或再生或者足夠治療目標(biāo)疾病或病癥的量導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，優(yōu)選人類。優(yōu)選地，至少20inl每ml含l()7到l(f干細(xì)胞的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物用于任何治療，優(yōu)選一次全部使用，尤其是當(dāng)外傷發(fā)生需要立即組織修復(fù)的情況。此量對(duì)75-80kg的人體是特別優(yōu)選的。待導(dǎo)入其來源哺乳動(dòng)物的組合物中的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞的量部分取決于來源外周血材料中存在的細(xì)胞數(shù)目(尤其是如果只有非常有限的量可以獲得)。導(dǎo)入患者的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞的優(yōu)選范圍可以是，比如，約10nil到約50ml的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞組合物，其每ml含107到l(f千細(xì)胞，或者可能更多。盡管我們知道高濃度的任何物質(zhì)施用給哺乳動(dòng)物都可以是有毒的或者甚至是致死的，但是導(dǎo)入所有的哺乳動(dòng)物外周血干細(xì)胞，例如在TVEMF擴(kuò)增后至少7倍，不可能造成TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞過量。在使用來自多個(gè)供體或者同一供體多次收集的外周血的情況下，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的外周血干細(xì)胞的數(shù)量可以更高。同樣，可導(dǎo)入患者的TVEMF細(xì)胞的劑量不受從一個(gè)個(gè)體收集所提供的外周血數(shù)量的限制；多次施用，例如每天一次或兩次，或每周一次，或其它施用時(shí)間方案，可更容易應(yīng)用。并且，在準(zhǔn)備對(duì)組織進(jìn)行治療時(shí)，此類型的組織可準(zhǔn)許使用可提供的盡可能多的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞，或者使用較少劑量。例如，肝臟可能更容易治療并且可能要求比其它組織更少的千細(xì)胞。應(yīng)理解的是，盡管上文所描述的實(shí)施方案通常涉及低溫保存TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞，但是TVEMF擴(kuò)增也可以在對(duì)已經(jīng)過低溫保存的、非擴(kuò)增、或者非TVEMF擴(kuò)增的外周血千細(xì)胞解凍之后進(jìn)行。另外，如果希望低溫保存，可以在冷凍細(xì)胞之前和之后都進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增。例如，血庫有低溫保存的組合物，其包含處于冷凍保存狀態(tài)的外周血干細(xì)胞，以備在某時(shí)間點(diǎn)的需要。這些組合物可根據(jù)傳統(tǒng)方法解凍，然后按照此處所述進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增，其包括按照此處所述的TVEMF過程的變化形式。此后，如上文所述，此TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞被認(rèn)為是本發(fā)明的組合物。在低溫保存之前進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增是優(yōu)選的,例如假如發(fā)生外傷，已經(jīng)擴(kuò)增了患者的外周血干細(xì)胞就不需要再花費(fèi)寶貴的額外數(shù)天來準(zhǔn)備。同樣，盡管不是優(yōu)選,應(yīng)注意本發(fā)明的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞可低溫保存，然后解凍，然后如果不使用,再低溫保存。細(xì)胞在冷凍之前，優(yōu)選進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增(即，增加數(shù)目，而非大小)。細(xì)胞也可以在冷凍然后解凍之后擴(kuò)增，即使冷凍之前已經(jīng)擴(kuò)增也可以。外周血干細(xì)胞的擴(kuò)增可能需要幾天。在立即供應(yīng)外周血干細(xì)胞非常重要的情況下，比如生死關(guān)頭或者創(chuàng)傷性損傷，尤其是如果需要在再次導(dǎo)入細(xì)胞之前完成研究，可能等不了幾天等待外周血干細(xì)胞的擴(kuò)增。因此，特別期望從出生就可提供這種擴(kuò)增好的外周血千細(xì)胞，以準(zhǔn)M分鐘延遲治療都可能意味著生死之別的緊急情況。同樣，應(yīng)理解的是，在TVEMF擴(kuò)增后經(jīng)過或不經(jīng)過低溫保存，本申請(qǐng)的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞可導(dǎo)入哺乳動(dòng)物，優(yōu)選來源哺乳動(dòng)物(外周血來源的哺乳動(dòng)物)。然而，這種導(dǎo)入不需限于僅僅來源哺乳動(dòng)物(自體)，TVEMF擴(kuò)增的細(xì)胞也可以輸入不同哺乳動(dòng)物(異體)。同樣，應(yīng)理解的是，盡管外周血是本發(fā)明成體干細(xì)胞的優(yōu)選來源，來自骨髓的成體千細(xì)胞也可以被TVEMF擴(kuò)增并以與外周血千細(xì)胞相似的方式用于本發(fā)明。骨髓不是容易獲得的干細(xì)胞來源，而必須通過成分輸血(apheresis)或者一些其它昂貴規(guī)和疼痛的方法來收集。本發(fā)明還包括研究疾病狀態(tài)的方法，其包括將TVEMF擴(kuò)增的干細(xì)胞導(dǎo)入疾病狀態(tài)試驗(yàn)系統(tǒng)。這種系統(tǒng)可以包括但不限于，例如具有該疾病的哺乳動(dòng)物，研究該疾病的適當(dāng)動(dòng)物模型，或者研究該疾病的體外試驗(yàn)系統(tǒng)。TVEMF擴(kuò)增的外周血千細(xì)胞可用于研究下列疾病的可能療法I。源于正常血細(xì)胞產(chǎn)生與成熟的功能衰竭或功能障礙的疾病，過度增殖性干細(xì)胞病，再生障礙性貧血，全血細(xì)胞減少癥，血小板減少癥，紅細(xì)胞再生障礙，由于藥物、輻射、或者感染、先天性原因造成的布-戴氏綜合征(Blackfon-Diamondsyndrome);II,造血系統(tǒng)惡性腫瘤、急性淋巴母細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性惡性骨髓硬化癥、多發(fā)性骨髓瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、不明原因的骨髓化生(agnogenicmyelomet叩lasia)、Waldenstrom's巨球蛋白血癥、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；III.具有以下疾病的患者中的免疫抑制惡性、實(shí)體腫瘤、惡性黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、睪丸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、尤因肉瘤、淋巴瘤;IV。自身免疫性疾病,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、l型糖尿病、慢性肝炎、多發(fā)性硬化、和系統(tǒng)性紅斑狼瘡;V.遺傳性(先天性)疾病，貧血、家族性再生障礙性、范科尼氏綜合征、布盧姆綜合征、純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)、先天性角化不良癥、布-戴氏綜合征、先天性紅細(xì)胞生成障礙綜合征I-IV、Chwachmaim-Diamond綜合征、二氫葉酸還原酶缺乏癥、formamino轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、萊-尼綜合征(Lesch-Nyhansyndrome)、先天性球形細(xì)胞增多癥、先天性橢圓形細(xì)胞增;癥、先天性口形紅細(xì)胞增多、先天性無Rh病、突發(fā)性夜間血紅蛋白尿、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、丙酮酸激酶變體I、II、III缺乏癥、先天性紅細(xì)胞生成素敏感、缺乏、鐮狀細(xì)胞病和性狀、地中海貧血oup、y高鐵血紅蛋白血癥、先天性免疫病、重癥聯(lián)合免疫缺陷病(scro)、棵淋巴細(xì)胞綜合征、離子載體反應(yīng)性聯(lián)合、免疫缺陷(ionophore-responsivecombinedimmunodeficiency)、加帽異常聯(lián)合免疫缺陷(combinedimmunodeficiencywithacappingabnormality)、核普辨酸4匕酶缺乏癥、粒細(xì)胞肌動(dòng)蛋白缺乏癥、嬰兒粒細(xì)胞缺乏癥、戈謝病(Gaucher，sdisease)、腺苷脫氨酶缺乏癥、科斯特曼綜合征、網(wǎng)狀組織發(fā)生不全、先天性白細(xì)胞功能障礙綜合征;以及VI。其它，包括骨硬化癥、骨髓硬化癥、獲得性溶血性貧血、獲得性免疫缺陷、造成原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷的傳染病、細(xì)菌感染(例如布魯氏菌病、利斯特菌病、肺結(jié)核、麻風(fēng))、寄生蟲感染(例如瘧疾、利什曼病)、真菌感染、由于衰老吞噬細(xì)胞癥造成的涉及淋巴細(xì)胞組成比例失衡和免疫功能減退的病癥、科斯特曼粒細(xì)胞缺乏癥、慢性肉芽肺病、謝-希綜合征(Chediak畫Higachisyndrome)、中性粒細(xì)胞肌動(dòng)蛋白缺乏癥、中性粒細(xì)胞膜GP-180缺乏癥、代謝貯積疾病(metabolicstoragedisease)、粘多糖j^積癥、祐脂j^積癥、涉及免疫機(jī)制的混雜疾病、威-奧綜合征(Wiskott-AWrichsyndrome)、ttl-抗姨蛋白^^t乏癥。在全部擴(kuò)增、保存、和解凍過程中，本發(fā)明的外周血干細(xì)胞維持它們的三維幾何結(jié)構(gòu)和它們的細(xì)胞-細(xì)胞支持以及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。盡管此處描述了優(yōu)選的實(shí)施方案,本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明包括多種改變與修飾。本發(fā)明的范圍不限于上文所描述的實(shí)施方案。權(quán)利要求1.來自哺乳動(dòng)物的外周血干細(xì)胞，其中所述外周血干細(xì)胞每單位體積的數(shù)目是天然存在的外周血的至少7倍；和其中所述外周血干細(xì)胞具有與天然存在的外周血干細(xì)胞基本相同的三維幾何結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞支持及細(xì)胞-細(xì)胞幾何結(jié)構(gòu)。2.包含權(quán)利要求1的外周血干細(xì)胞以及可接受載體的組合物。3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述可接受載體是以下至少一種血漿、血液、白蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖劑和低溫保存劑，并且其中所述組合物任選地還包含生長因子、銅螯合劑和激素中至少一種。4.權(quán)利要求3的組合物，其中如果存在的話所述生長因子是G-CSF，并且其中如果存在的話所述銅螯合劑是D-青霉胺。5.權(quán)利要求2的組合物，其中所述組合物處于足以低溫保存所述外周血干細(xì)胞的溫度。6.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中低溫保存劑以足以低溫保存所述細(xì)胞的量存在，并且其中所述組合物處于約-120。C到約-196。C的溫度。7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中所述溫度是約-130。C到約-150°C。8.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，還包含藥用可接受載體。9.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中所述組合物包含選自下組的低溫保存劑的總量=60到80%氨基酸葡萄糖溶液中的20到40%二曱基亞砜溶液；15到25%的羥乙基淀粉溶液;4到6%的甘油、3到5%葡萄糖和6到10%葡聚糖T10;15到25%聚乙二醇；和75到85%#J^酸葡萄糖溶液。10.權(quán)利要求2的組合物，其中所述組合物不含有毒物質(zhì)。11.來自哺乳動(dòng)物的外周血干細(xì)胞，其中所述外周血干細(xì)胞是TVEMF擴(kuò)增的。12.權(quán)利要求11的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞，其中單位體積中TVEMF擴(kuò)增的外周血千細(xì)胞的數(shù)量至少是TVEMF擴(kuò)增的外周血千細(xì)胞所來源的外周血中每單位體積的干細(xì)胞數(shù)量的2倍。13.權(quán)利要求12的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞，其中TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞每單位體積的數(shù)量是至少7倍。14.包含權(quán)利要求13的外周血干細(xì)胞和可接受載體的組合物。15.包含權(quán)利要求13的TVEMF擴(kuò)增外周血干細(xì)胞的組合物，其中所述可接受載體是下組中至少一種血漿、血液、白蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)基、緩沖劑和低溫保存劑，并且其中所述組合物任選地還包含生長因子、銅螯合劑和激素中至少一種。16.權(quán)利要求15的組合物，其中如果存在的話所述生長因子是G-CSF,并且其中如果存在的話所述銅螯合劑是D-青霉胺。17.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中所述組合物還包含選自下組的低溫保存劑的總量60到80%氨基酸葡萄糖溶液中的20到40%二甲基亞砜溶液；15到25%的羥乙基淀粉溶液；4到6°/。的甘油、3到5%葡萄糖和6到10%葡聚糖T10;15到25%聚乙二醇；和75到85%氨基酸葡萄糖溶液。18.權(quán)利要求14的組合物，其中所述組合物處于足以低溫保存所述外周血干細(xì)胞的溫度。-19.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中存在低溫保存劑，并且其中所述組合物處于約-120。C到約-196。C的溫度。20.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中所述溫度是從約-130。C到約-!50。C。21.權(quán)利要求14的組合物，其中所述組合物不含有毒物質(zhì)。22.制備外周血干細(xì)胞組合物的方法，其包括以下步驟:a.將外周血混合物置于TVEMF生物反應(yīng)器的培養(yǎng)腔室中;和b.4吏外周血混合物受到TVEMF，并在TVEMF生物反應(yīng)器中對(duì)外周血干細(xì)胞進(jìn)行TVEMF擴(kuò)增以制備外周血干細(xì)胞組合物。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述TVEMF是約0.05到約6,0高斯。24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述T、函F擴(kuò)增持續(xù)進(jìn)行直到TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞每單位體積的數(shù)量是放置于TVEMF生物反應(yīng)器中外周血干細(xì)胞每單位體積的數(shù)量的7倍以上。25.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其還包括在將外周血混合物置于TVEMF生物反應(yīng)器中之前收集外周血。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述外周血是人的外周血。27.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其還包括在將外周血加到外周血混合物中之前，從外周血保存設(shè)備中收集解凍的低溫保存外周血。28.權(quán)利要求22的方法，其還包括在TVEMF擴(kuò)增之前從外周血混合物中除去有毒物質(zhì)的步驟。29.權(quán)利要求22的方法，其中TVEMF生物反應(yīng)器具有集成的TVEMF源。30.權(quán)利要求22的方法，其中TVEMF生物反應(yīng)器具有相鄰的TVEMF源。31.權(quán)利要求22的方法，其中外周血混合物包含與其它外周血組分分離開的€034+/€038-外周血干細(xì)胞。32.權(quán)利要求22的方法，其中外周血混合物包含與其它外周血組分分離開的血沉棕黃層。33.權(quán)利要求22的方法，其中外周血混合物包含不含紅細(xì)胞的外周血。34.權(quán)利要求22的方法，其還包括以下步驟:將外周血干細(xì)胞組合物的TVEMF擴(kuò)增細(xì)胞轉(zhuǎn)移到具有一定溫度的低溫容器，和以受控速率將低溫容器的溫度降低到-120。C至-196。C的溫度。35.權(quán)利要求34的方法，其還包括以下步驟:在以受控速率降低溫度到-120。C至-196。C之前，從外周血干細(xì)胞組合物中除去有毒物質(zhì)。36.權(quán)利要求34的方法，其還包括，在降溫步驟之后,在一段時(shí)間內(nèi)保持低溫容器的溫度在-120。C到-196。C的步驟。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述一段時(shí)間為至少一年。38.權(quán)利要求36的方法，其還包括，在所述降溫和保持溫度之后，以受控速率將低溫容器升溫至適于將外周血干細(xì)胞組合物導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的溫度的步驟。39.權(quán)利要求38的方法，其中有毒物質(zhì)已經(jīng)從所述升溫的外周血干細(xì)胞組合物中被除去。40.權(quán)利要求34的方法，其還包括在降低溫度的步驟之前將低溫保存劑加到外周血干細(xì)胞組合物的TVEMF擴(kuò)增細(xì)胞中的步驟。41.通過根據(jù)權(quán)利要求22的方法制備的包含外周血干細(xì)胞和可接受載體的組合物。42.修復(fù)哺乳動(dòng)物組織的方法，其包括以下步驟將治療有效量的包含權(quán)利要求1的外周血千細(xì)胞和藥用可接受載體的組合物施用給哺乳動(dòng)物。43.修復(fù)哺乳動(dòng)物組織的方法，其包括以下步驟將治療有效量的包含權(quán)利要求ll的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞和藥用可接受載體的組合物施用給哺乳動(dòng)物。44.權(quán)利要求43的方法，其中待修復(fù)組織是人體組織。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是TVEMF擴(kuò)增之前外周血干細(xì)胞的來源。46.權(quán)利要求44的方法,其中待修復(fù)組織是選自下組中的至少一種肝臟組織、心臟組織、造血組織、血管、皮膚組織、肌肉組織、腸組織、胰臟組織、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、骨、軟骨組織、結(jié)締組織、肺組織、脾組織和腦組織。47.權(quán)利要求43的方法，其中待施用給哺乳動(dòng)物的TVEMF擴(kuò)增的外周血干細(xì)胞的量是至少20ml含107到1(f個(gè)干細(xì)胞/ml的組合物。48.治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，其包括將治療有效量的包含權(quán)利要求1的外周血干細(xì)胞和藥用可接受栽體的組合物施用給哺乳動(dòng)物的步49.治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，其包括將治療有效量的包含權(quán)利要給哺乳動(dòng)物的步驟。50.權(quán)利要求49的方法,其中所述哺乳動(dòng)物是人并且其中所述哺乳動(dòng)物是TVEMF擴(kuò)增之前外周血千細(xì)胞的來源。51.權(quán)利要求50的方法，其中待施用給所述哺乳動(dòng)物的TVEMF擴(kuò)增外周血干細(xì)胞的量是至少20ml具有107至1ff個(gè)千細(xì)胞/ml的組合物。52.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是選自下組中的至少一種源于正常血細(xì)胞產(chǎn)生與成熟的功能衰竭或功能障礙的疾病，過度增殖性干細(xì)胞病，再生障礙性貧血，全血細(xì)胞減少癥，血小板減少癥，紅細(xì)胞再生障礙，由于藥物、輻射、或者感染、先天性原因造成的布-戴氏綜合征(Blackfon-Diamondsyndrome);造血系統(tǒng)惡性腫瘤、急性淋巴母細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性惡性骨髓硬化癥、多發(fā)性骨髓瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、不明原因的骨髓化生(agnogeiiicmyelometaplasia)、Waldenstrom's巨球蛋白血癥、霍奇金'淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；具有以下疾病的患者中的免疫抑制惡性、實(shí)體腫瘤、惡性黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、睪丸癌、,母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、尤因肉瘤、淋巴瘤；自身免疫性疾病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、慢性肝炎、多發(fā)性硬化、和系統(tǒng)性紅斑狼瘡；遺傳性(先天性)疾病，貧血、家族性再生障礙性、范科尼氏綜合征、布盧姆綜合征、純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)、先天性角化不良癥、布-戴氏綜合征、先天性紅細(xì)胞生成障礙綜合征WV、Chwachmaim-Diamond綜合征、二氬葉酸還原i^:乏癥、formamino轉(zhuǎn)詳多^^乏癥、萊-尼綜合征(Lesch-Nyhansynd腦e)、先天性球形細(xì)胞增多癥、先天性橢圓形細(xì)胞增多癥、先天性口形紅細(xì)胞增多、先天性無Rh病、突發(fā)性夜間血紅蛋白尿、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、丙酮酸激酶變體i、n、ni缺乏癥、先天性紅細(xì)胞生成素敏感、缺乏、鐮狀細(xì)胞病和性狀、地中海貧血a、p、y高鐵血紅蛋白血癥、先天性免疫病、重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)、棵淋巴細(xì)胞綜合征、離子栽體反應(yīng)性聯(lián)合、免疫缺陷(io聽phore-responsivecombinedimmunodeficiency)、加帽異常聯(lián)合免疫缺陷(combinedimmunodeficieiicywithacappingabnormality)、核苷磷酸化酶缺乏癥、粒細(xì)胞肌動(dòng)蛋白缺乏癥、嬰兒粒細(xì)胞缺乏癥、戈謝病(Gauchei，sdisease)、腺普脫氨酶缺乏癥、科斯特曼綜合征、網(wǎng)狀組織發(fā)生不全、先天性白細(xì)胞功能障礙綜合征;骨硬化癥、骨髓硬化癥、獲得性溶血性貧血、獲得性免疫缺陷、造成原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷的傳染病、細(xì)菌感染(例如布魯氏菌病、利斯特菌病、肺結(jié)核、麻風(fēng))、寄生蟲感染(例如瘧疾、利什曼病)、真菌感染、由于衰癥、科斯特曼粒細(xì)胞缺乏癥、慢性肉芽腫病、謝-希綜合征(Chediak-Higachisyndrome)、中性粒細(xì)胞肌動(dòng)蛋白缺乏癥、中性粒細(xì)胞膜GP-180缺乏癥、代謝貯積疾病(metabolicstoragedisease)、粘多糖貯積癥、粘脂貯積癥、涉及免疫機(jī)制的混雜疾病、威-奧綜合征(Wiskott-Aldrichsyndrome)、和od-抗胰蛋白酶缺乏癥。53.研究疾病狀態(tài)的方法，其包括將TV'EMF擴(kuò)增的干細(xì)胞導(dǎo)入所述疾病狀態(tài)的試驗(yàn)系統(tǒng)。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述疾病狀態(tài)是選自下組中的至少一種源于正常血細(xì)胞產(chǎn)生與成熟的功能衰竭或功能障礙的疾病，過度增殖性干細(xì)胞病，再生障礙性貧血，全血細(xì)胞減少癥，血小板減少癥，紅細(xì)胞再生障礙，由于藥物、輻射、或者感染、先天性原因造成的布-戴氏綜合征(Blackfan-Diamondsyndrome);造血系統(tǒng)惡性腫瘤、急性淋巴母細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性惡性骨髓硬化癥、多發(fā)性骨髓瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、不明原因的骨髓化生(agnogenicmyelometapiasia)、Waldenstrom's巨球蛋白血癥、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤；具有以下疾病的患者中的免疫抑制惡性、實(shí)體腫瘤、惡性黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、睪丸癌、M母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、尤因肉瘤、淋巴瘤；自身免疫性疾病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、慢性肝炎、多發(fā)性硬化、和系統(tǒng)性紅斑狼瘡;遺傳性(先天性)疾病，貧血、家族性再生障礙性、范科尼氏綜合征、布盧姆綜合征、純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)、先天性角化不良癥、布-戴氏綜合征、先天性紅細(xì)胞生成障礙綜合征I-IV、Chwachmann-Diamond綜合征、二氫葉酸還原S^乏癥、formami腳轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、萊-尼綜合征(Lesdi-Nyhansyndrome)、先天性球形細(xì)胞增多癥、先天性橢圓形細(xì)胞增多癥、先天性口形紅細(xì)胞增多、先天性無Rh病、突發(fā)性夜間血紅蛋白尿、G6PD(葡萄糖-6-磷皿氫酶)、丙酮酸激酶變體I、II、III缺乏癥、先天性紅細(xì)胞生成素敏感、缺乏、鐮狀細(xì)胞病和性狀、地中海貧血"、p、Y高鐵血紅蛋白血癥、先天性免疫病、重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)、棵淋巴細(xì)胞綜合征、離子栽體反應(yīng)性聯(lián)合、免疫缺陷(ionophore-responsivecombinedimmunodefidency)、加中冒異常聯(lián)合免疫缺陷(combinedimmunodeficiencywithacappingabnormality)、核普磷酸化酶缺乏癥、粒細(xì)胞肌動(dòng)蛋白缺乏癥、嬰兒粒細(xì)胞缺乏癥、戈謝病(Gaucher，sdisease)、腺普脫氨酶缺乏癥、科斯特曼綜合征、網(wǎng)狀組織發(fā)生不全、先天性白細(xì)胞功能障礙綜合征；骨石更化癥、骨髓硬化癥、獲得性溶血性貧血、獲得性免疫缺陷、造成原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷的傳染病、細(xì)菌感染(例如布魯氏菌病、利斯特菌病、肺結(jié)核、麻風(fēng))、寄生蟲感染(例如疰疾、利什曼病)、真菌感染、由于衰老吞噬細(xì)胞癥造成的涉及淋巴細(xì)胞組成比例失衡和免疫功能減退的病癥、科斯特曼粒細(xì)胞缺乏癥、慢性肉芽肺病、謝-希綜合征(Chediak-Higachisyndrome)、中性粒細(xì)胞肌動(dòng)蛋白缺乏癥、中性粒細(xì)胞膜GP-180缺乏癥、^謝l^積疾病(metabolicstoragedisease)、粘多糖貯積癥、粘脂j^積癥、涉及免疫才幾制的混雜疾病、威-奧綜合征(Wiskott-Aldrichsyndrome)、和cd-抗胰蛋白S^:乏癥。55.來自哺乳動(dòng)物的骨髓干細(xì)胞，其中所述骨髓干細(xì)胞是TVEMF擴(kuò)增的。全文摘要本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物外周外周血干細(xì)胞優(yōu)選CD34+/CD38-細(xì)胞的TVEMF擴(kuò)增，也涉及來源于TVEMF擴(kuò)增細(xì)胞的組合物，還涉及用所述組合物治療疾病或修復(fù)組織的方法。文檔編號(hào)A01N1/02GK101160046SQ200680012678公開日2008年4月9日申請(qǐng)日期2006年2月27日優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日發(fā)明者唐尼·拉德,大衛(wèi)·A·沃爾夫申請(qǐng)人:雷格內(nèi)泰克公司