專利名稱：：反向子代作圖的制作方法反向子代作圖本發(fā)明涉及用于對在生物體中，特別是在植物中的性狀進(jìn)行作圖(mapping)的方法。復(fù)雜的作物性狀例如產(chǎn)量、脅迫耐受性、代謝物組成以及相關(guān)現(xiàn)象(例如雜種優(yōu)勢和配合力)由于它們的數(shù)量遺傳性質(zhì)和強(qiáng)的與環(huán)境的相互作用而很難研究。此外，這些性狀/由它們引起的現(xiàn)象的遺傳學(xué)常常也是復(fù)雜的，并且大部分是數(shù)量性的和多基因的，這意味著所得的。，"、土，一、5^土當(dāng)每個單獨(dú)的基因座對總的效應(yīng)具有可測量的貢獻(xiàn)而與對數(shù)量性狀有貢獻(xiàn)的其他基因座的等位基因的存在或不存在無關(guān)時，表征對所述數(shù)量性狀有貢獻(xiàn)的單獨(dú)的基因座的嘗試已獲得成功。在這種情形中，單獨(dú)的QTL正如對它們的稱呼一樣，具有加和性質(zhì)(additivenature)并且以簡單的孟德爾法則遺傳。已經(jīng)廣泛描述了數(shù)種用于QTL作圖的方法，然而當(dāng)表型是由于許多雜合基因座的相互作用而引起時，尤其是當(dāng)這樣的基因座相互依賴時，這些方法中的多數(shù)不能成功。這意味著，兩個或更多個特定的基因座需同時存在以表達(dá)特定性狀。在兩個基因座中的任何一個上缺少所需的等位基因時，所述表型性狀將不會表達(dá)。單獨(dú)地所需的等位基因可以以純合或雜合的形式出現(xiàn)。取決于所述特定的性狀，可能需要基因座的不同的遺傳素質(zhì)(geneticconstitution)。例如，可測量效應(yīng)只在當(dāng)2個或更多個基因座以雜合狀態(tài)存在時才能觀察到，當(dāng)任一基因座是純合的時候觀察不到效應(yīng)。在這樣的情形中，可以認(rèn)為這樣的基因座是相互依賴的。如前面提到的，復(fù)雜性狀如產(chǎn)量和脅迫耐受性具有很高的工業(yè)重要性，并因而，十分期望具有一些工具例如與這些復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，其使得能夠增加在不同作物中育種這些性狀的效率。當(dāng)代的植物育種通常使用遺傳(分子)標(biāo)記技術(shù)例如AFLP、RAPD，s、SSR，s、SNP，s等，關(guān)于綜述參見例如Lakshmikumaran，T.等人，MolecularmarkersinimprovementofwheatandBrassica.In:PlantBreeding-MendeliantoMolecularapproaches.H.Jain和M.Kharkwal(eds.)Copyright2004NarosaPublishingHouse,NewDelhi,India,第229-255頁。分子標(biāo)記作為指示特定性狀的診斷工具是十分理想的，甚至在所述性狀還未表達(dá)的發(fā)育階段中。此外，分子標(biāo)記對環(huán)境條件是不敏感的。例如，可以發(fā)現(xiàn)在遺傳上與負(fù)責(zé)辣椒成熟時它們果實顏色的基因相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記(例如以SNP(單核苷酸多態(tài)性)的形式，或者與瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上的DNA條帶相關(guān)聯(lián))。取自幼苗的DNA樣品可用于確定該植物果實最終將會具有哪種顏色。因而，在這種情形中，正在被"召喚"的特定DNA序列的存在和特殊性狀的存在之間存在直接關(guān)聯(lián)。大體上，相同的程序?qū)υS多多基因性狀是確實可行的(參見例如TanksleyS.，Mappingpolygenes,Annu.Rev.Genet.1993，27:205-233)。在后一種情況下，所述的性狀，不管它是什么，例如抗病性、對脅迫的抗性、維生素的產(chǎn)生等，可能由多于一個的基因座控制。假定可以測量每個單獨(dú)的基因座的貢獻(xiàn)以及其相關(guān)聯(lián)的DNA標(biāo)記，并且假定不同基因座以及它們各自的DNA標(biāo)記物之和將在表型上導(dǎo)致特定性狀的存在(在某種程度上)。這種觀念要追溯到R.A.Fisher的經(jīng)典工作(ThecorrelationsbetweenrelativesonthesuppositionofMendelianinheritance,Trans.R.Soc.Edinb.(1918)52，399-433)，該工作將孟德爾遺傳學(xué)與關(guān)于親屬(relatives)之間相關(guān)性的先前的統(tǒng)計學(xué)方法相聯(lián)系，以解釋數(shù)量遺傳性狀。通過重組進(jìn)行的真核生物染色體作圖是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)(GriffithsAJF等人，(2005)Eukaryotechromosomemappingbyrecombination,In:IntroductiontoGeneticAnalysis,第8版，W.H.FreemanandCompany,NewYork,第115-137頁)。分離性性狀(segregatingtrait)的作圖，即QTL-作圖(QTL=數(shù)量性狀基因座)不僅取決于技術(shù)問題或重組，而且同樣重要的是對表型的精確觀察或評分(分別是定性的或定量的)。在這方面，當(dāng)對復(fù)雜性狀或效應(yīng)進(jìn)行作圖時，本領(lǐng)域技術(shù)人員優(yōu)選使用雙單倍體系(DH)群體或重組近交系(RIL)群體，它們對目標(biāo)性狀是分離性的，并且源于單抹Fl植物。DH-系通過植林再生和染色體加倍而直接來源于單倍體Fl-植物配子。RIL是高度近交系，其來源于單粒種子世系(singleseeddescent,SSD)，即通過數(shù)代近交而得到，其中每一單獨(dú)的植抹提供一顆種子用于下一代，從F2開始。備選地，使用所謂的近等基因系(NIL)。NIL是一小段DNA片段不同的純合系。它們通常源于回交，但是也可以從分離性RIL獲得(Tuinstra等人，(1997)Theor.Appl.Genet.95:1005-1011)。DH-系、RIL和NIL對當(dāng)代的遺傳學(xué)和遺傳作圖有重大貢獻(xiàn)。這些純系的優(yōu)勢正是依賴于這樣一個事實，即與在典型的F2作圖群體(mappingpopulation)的個體植株水平上的分離相比較，品系間的表型變異(品系間變異)容易記錄。純系的可用性當(dāng)然越來越重要，因為環(huán)境的影響同樣可以通過遺傳上相同的純系植林的重復(fù)來解決。這與單個的、無重復(fù)的、單獨(dú)的F2-植林表型相反，所述F2-植林表型為基因和環(huán)境相互作用的產(chǎn)物。復(fù)雜效應(yīng)(例如雜種優(yōu)勢)或品系間的配合力的闡明是當(dāng)代遺傳學(xué)和植物育種的最大挑戰(zhàn)之一。對于雜種優(yōu)勢，已經(jīng)形成了幾個假說(參見例如，BirchlerJ等人，(2003)ThePlantCell15，2236-2239)。關(guān)于雜種優(yōu)勢的所謂的歷史解釋是"超顯性"和顯性。超顯性指這樣一個想法，即在雜種中發(fā)生等位基因相互作用，從而雜合類型比任一種純合類型的表現(xiàn)要好。顯性指其中一個親本的亞最佳的隱性等位基因由另一親本的顯性等位基因補(bǔ)充的情況。然而，由顯性解釋的雜種優(yōu)勢效應(yīng)在純合狀態(tài)中基本上是固定的，顯然對于由超顯性解釋的效應(yīng)這是不可能的。最近已經(jīng)清楚，對雜種優(yōu)勢的這兩種竟?fàn)幮缘膯位蜃忉屖遣粔虻模⑶疑衔恍?yīng)，即基因座間相互作用，作為雜種優(yōu)勢的遺傳基礎(chǔ)也起著主要作用(YuSB等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:9226-9231)。如前面提到的，傳統(tǒng)上使用的具有純合個體的作圖群體(mappingpopulation)結(jié)構(gòu)，例如重組近交系群體(RIL)和雙單倍體(DoubledHaploid，DH)群體，不能容易地應(yīng)用于對某個基因座處的雜合狀態(tài)的具體效應(yīng)進(jìn)行作圖。該缺點(diǎn)已經(jīng)通過將這些群體與測試者(tester)進(jìn)行雜交并評估后代雜種的表型而克服了。然而，這種方法具有三個缺點(diǎn)。首先，其需要額外的勞力、空間和時間。此外，其將基因座的雜合狀態(tài)僅與兩個可能的純合狀態(tài)之一進(jìn)行比較，除非使用至少一個額外的測試者。最后，其沒有全面評估雜合基因座和遺傳背景之間的相互作用，即由于雜合性而引起的具有特定效應(yīng)的基因相互作用。由Charcosset等人，(1994)和Rebai'等人，(1994)(都在Biometricsinplantbreeding:applicationsofmolecularmarkers;Eds:OoijenJ.和JansenJ.CPR0-DL0，Wageningen，TheNetherlands中)提出的雙列交配群體(dialleimatingpopulation)的使用，克服了部分的后兩種缺點(diǎn)，但需要更多的勞力和空間。F2群體和回交群體可以應(yīng)用于評估對于在某一基因座處的雜合狀態(tài)的具體效應(yīng)的作圖。然而，因為統(tǒng)計模型中可利用的參數(shù)空間(其受群體大小的限制)，在基于F2的QTL-分析中僅能評估有限的基因相互作用?；亟蝗后w需要更多時間和勞力來產(chǎn)生它們，并且僅對于輪回親本(recurrentparent)的遺傳背景評估了在某一基因座處的雜合狀態(tài)的效應(yīng)，沒有考慮與其他基因座可能的相互作用。避免時間、空間和勞力上的大量投入來發(fā)展作圖群體的另一種方法是連鎖不平衡作圖(LD-作圖；KraakmanATW等人，(2004)Genetics168，435—446;KraftT等人，(2000)Theor.Appl.Genet.101，323-326)。這種方法利用可獲得的已有遺傳材料，例如品種和基因庫參加者(accessions)。如果該材料是足夠雜合的，例如雜種品種的一個作圖組，評估所述雜合基因座的特定效應(yīng)是可能的。然而，通常LD-作圖方法不考慮上位效應(yīng)并且需要大量參加者來檢測在由上位效應(yīng)引起的統(tǒng)計學(xué)噪音內(nèi)的加和性地起作用的QTL，所述的上位效應(yīng)是由于所有參加者中不同遺傳背景引起。(Flint-GarciaSA等人，(2003)A匪.Rev.PlantBiol.54，357-374)。依賴于兩個或更多個基因座的等位基因構(gòu)成(allelicconstitution)的組合的性狀的鑒定或作圖要難得多。在群體遺傳學(xué)中，數(shù)個基因座之間的這種相互作用稱為'上位性，。在這種情形中，一個基因座的貢獻(xiàn)僅在另一個或第三個或第四個等的基因座的某種等位基因構(gòu)成中是可測量的。在一個簡單的理論情形中，可以想象，如果二聚體稍微不同(在雜合子中有1個基因座但有2個等位基因)，從而例如形成更有效的催化位點(diǎn)，則由一特定基因(1個基因座)編碼的該同型二聚體酶在催化中可能會更有效。在該情形中，與AA或A'A'相比較，AA'在催化方面更優(yōu)。除此之外，十分可能，在生物合成途徑中由"A"基因(無論遺傳組成是什么)編碼的該酶可能依賴于在級聯(lián)系統(tǒng)中處于所述特定酶的上游或下游的另一種酶的催化。容易理解，如果所述酶"A"變得更有效力，則這種效力的增加僅在如果"喂養(yǎng)"所述由"A"編碼的酶的底物沒有限制時才可以有效地執(zhí)行。在A酶所利用的底物由另一種酶(B)提供并由此遵循相同規(guī)則(同型二聚體酶通過2個等位基因來改良)的情形中，改良僅通過組合來獲得。在那種情形中，AA'/BB'好于AA/BB'或AA'/BB以及其中兩種雜合狀態(tài)都不存在的另一組合。在另一方面，如果該途徑的輸出物不再受限于A控制的步驟，而如果在A下游的酶構(gòu)成了該限制步驟，則A的不同等位基因的作用是不可測量的，并且因此負(fù)責(zé)在A下游的該酶的基因座對A來說是上位的。其中雜合子個體優(yōu)于純合個體的一個眾所周知的實例是鐮形狀細(xì)胞貧血。對于在純合個體中是如此明顯有害的等位基因的存留的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，該等位基因在雜合個體中賦予了小但顯著的對于致命形式的瘧疾的抗性。自然選擇已經(jīng)導(dǎo)致了在純合情況的有害效果與由雜合情況提供的對癡病抗性之間保持平衡的等位基因群體。顯然，占優(yōu)的雜合性和上位效應(yīng)可以同時存在，并且對同型二聚體所描述的效果也可以對異型多聚體有效。總之，這意味著一個特定基因座本身的貢獻(xiàn)不能容易地測量或顯現(xiàn)，因為單獨(dú)基因座的至少一部分貢獻(xiàn)是非加和性的并與一個或多個其他基因座的等位基因狀態(tài)相互作用。因而，上位性狀的QTL作圖不能通過傳統(tǒng)方法容易地進(jìn)行，所述傳統(tǒng)方法通常假定基因座之間的可加性。由于用于該目的的遺傳模型的高參數(shù)化，因而將基因座間相互作用引入這些方法中通常導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)參數(shù)估計和低的檢測QTL的能力的問題。試圖解決該問題的備選方法是QTLx遺傳背景作圖，該方法應(yīng)用于雙列交配群體(CharcossetA等人，(1994)第75-84頁，和RebaYA等人，(1994)第170-177頁，兩篇都在Biometricsinplantbreeding:applicationsofmolecularmarkers;Eds:OoijenJ和JansenJ.CPR0-DL0，Wageningen，TheNetherlands中)，以及QTLx群體作圖，其應(yīng)用于多個相關(guān)的近交系雜交(JanninkJ-L&JansenR(2001)Genetics157:445-454)。后者聲明，這些方法也可以應(yīng)用于其他群體結(jié)構(gòu)。用于檢測上位相互作用的一個感興趣的群體結(jié)構(gòu)是異質(zhì)近交家族(HeterogeneousInbredFamily,HIF)(HaleyS等人，(1994)Theor.Appl.Genet.88，337-342;TuinstraM等人，(1997)Theor.Appl.Genet.95:1005-1011),這是因為其的'多重其他條件均相同(multipleceterisparibus)，性質(zhì)，即該家族含有許多可能的亞群，其中在它們的每一個中僅一個QTL在對于其他QTL的特定純合背景中是分離性的。HIF-群體的構(gòu)建十分冗長乏味的。其需要數(shù)代的單粒種子世系，這意味著其很慢并且耗費(fèi)勞力。在完成HIF-群體時，選取的群體親本可能不再是最新的了。減少傳代時間的設(shè)備或備選場所需要高的投資。還考慮到僅兩個親本的QTL-等位基因得以分析這樣一個事實，從而常常不值得去投資這樣的種群用于商業(yè)育種目的。用于在存在上位效應(yīng)時進(jìn)行QTL-作圖的一種更實用的方法在美國申請2005/0015827中介紹。當(dāng)其處于正在進(jìn)行的育種程序中時，QTL在給定背景中的位置和效應(yīng)受到反復(fù)地監(jiān)控。沒有應(yīng)用特定的群體結(jié)構(gòu)，和連鎖不平衡作圖一樣(見下面)，并且QTL的位置和效應(yīng)的改變被接受為無法更改的事實。這種方法的主要缺點(diǎn)是不得不分析大量的參加者，并且缺少建立特定上位效應(yīng)的分析能力。換句話說，不分析遺傳背景中哪個特定基因座與改變中的QTL相互作用。避免QTL-分析中的上位效應(yīng)的一種更根本的方法是使用回交群體。以這種方法，QTL-效應(yīng)可以在或多或少恒定的遺傳背景，即輪回親本的遺傳背景中進(jìn)行分析。大部分回交群體類型(例如回交近交系或BIL)可以看作是正規(guī)的作圖群體類型的類似物，其中包括了一個或多個回交代來產(chǎn)生更一致的遺傳背景，并且在幾種情況中，排除了基因座的三種等位基因狀態(tài)中的一種。鑒于上面所述，本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于對在生物體中，特別是在植物中的性狀進(jìn)行作圖的方法，該方法沒有上面描述的缺點(diǎn)。本發(fā)明是基于下列發(fā)現(xiàn)，即通過利用來源于特殊類別的異常減數(shù)分裂的配子，并且對從這樣的配子再生的生物體的子代進(jìn)行表型分析，有可能容易地對編碼復(fù)雜性狀的基因座進(jìn)行作圖。本發(fā)明的方法，在此稱為"反向子代作圖(ReverseProgenyMapping)"或"RPM"，是基于細(xì)胞特別是孢子的使用，所述細(xì)胞是由于減數(shù)分裂的第二次分裂異常而形成的，所謂的第二次分裂重建(SecondDivisionRestitution)或SDR，并且這些孢子因此與為單倍體的正常孢子相反是二倍體的(當(dāng)親本植林也是二倍體時)。這樣的孢子稱為SDR-0孢子，并且從它再生的植物稱為SDR-O植物。第二次分裂重建僅僅是更廣泛的一類所述未減數(shù)孢子/配子的一種情形。VeilleuxR((1985)PlantBreedingReviews3，253-288)描述了未減數(shù)配子形成的機(jī)制并提供了在作物植物中未減數(shù)配子發(fā)生的列表。那時，主要公認(rèn)兩種不同類別的未減數(shù)配子，即第二次分裂重建(SDR)和第一次分裂重建(FDR)。最近，已經(jīng)公開了第三類未減數(shù)配子，稱為不定減數(shù)分裂重建(IndeterminateMeioticRestitution,IMR)(LimK等人，(2001)Theor.Appl.Genet.103:219-230)。對于本發(fā)明的目的來說，僅SDR是相關(guān)的。說明SDR是天然和普遍現(xiàn)象的另一出版物是LimK等人，(2004)BreedingScience54:13-18。由于第一次減數(shù)分裂期間的交換(crossing-over)，SDR-0孢子的染色體可能具有雜合的區(qū)段。在本發(fā)明的上下文中，雜合性表示雜種起始植物基因的等位基因是多態(tài)性的，而純合性表示基因的等位基因是相同的。當(dāng)再生通過SDR產(chǎn)生的孢子時，獲得雙倍體植物，其平均具有與通過正常減數(shù)分裂和自交而獲得的植物(F2代)相比較而言水平降低的雜合性。據(jù)估計，SDR事件(events)平均含有60%的純合性(源于100%雜合的雜種植物)，而對于FDR事件純合性為20°/。。實際的水平取決于在特定SDR事件過程中發(fā)生的交換的數(shù)目和與著絲粒的相對位置。只有位于SDR-O植物的雜合區(qū)段上的基因座可以分離。分離在下一代(稱為SDR-1)中發(fā)生。在SDR-1代中將產(chǎn)生特定表型的基因型將不同于在SDR-0代中的基因型。然而，SDR-1代中的分離性表型(segregatingphenotype)只在如果SDR-0植物在一定程度上是雜合的時才可以發(fā)生。這意味著，足以確定在SDR-O代中哪個基因座是雜合的以便定位負(fù)責(zé)SDR-1代中的分離性表型的基因座。單獨(dú)的SDR-0植林中交換斷裂點(diǎn)的鑒定和定位預(yù)測了負(fù)責(zé)SDR-1子代中特定表型性狀的分離的基因座的位置，并因而對其進(jìn)行了作圖。因此，本發(fā)明涉及用于對在生物體中，特別是在植物中的性狀進(jìn)行作圖的方法，所述方法包括以下步驟a)提供SDR-0生物體特別是植物的群體，所述生物體每一個起源于由第二次分裂重建產(chǎn)生的未減數(shù)細(xì)胞群體特別是未減數(shù)孢子群體中的一個成員；b)產(chǎn)生每個這些SDR-0生物體的SDR-1子代群體；c)對SDR-1子代群體進(jìn)行表型分析以鑒定每個SDR-1子代群體內(nèi)的分離性性狀；d)如果分離性子代存在于SDR-1子代群體中，則對相應(yīng)的SDR-O生物體進(jìn)行基因分型，并將其基因型與其他SDR-O生物體的基因型進(jìn)行比較以鑒定與在所述SDR-1子代群體中鑒定出的分離性性狀的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)的雜合染色體區(qū)域。在一個具體的實施方案中，所述未減數(shù)細(xì)胞群體通過下列方式來獲得，所述未減數(shù)細(xì)胞中的每一個產(chǎn)生SDR-O群體的植物，所述方式為基于大小、質(zhì)量或DNA含量來分選細(xì)胞特別是孢子的群體，并選擇具有增加的大小、質(zhì)量或DNA含量的細(xì)胞特別是孢子作為未減數(shù)細(xì)胞特別是未減數(shù)孢子的群體的成員。所述細(xì)胞，特別是孢子，可以借助于流式細(xì)胞儀、離心機(jī)進(jìn)行分選，采用顯微操作器人工進(jìn)行分選，或通過任何其他分選手段來進(jìn)行分選。SDR-1子代群體的表型分析可以以任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式進(jìn)行，并且可以特別是借助于目視觀察或通過分析每個SDR-1生物體中的離子、轉(zhuǎn)錄物、蛋白質(zhì)、代謝物或其組合的含量和/或組成來進(jìn)行。分析離子、轉(zhuǎn)錄物、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物的含量和/或組分例如用技術(shù)例如離子組學(xué)(ionomics)、轉(zhuǎn)錄物組學(xué)(transcriptomics)、蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)、代謝物組學(xué)(metabolomics)或其組合來進(jìn)行。在對SDR-1子代群體進(jìn)行表型分析后，對產(chǎn)生出現(xiàn)分離的SDR-l子代群體的SDR-O生物體進(jìn)行基因分型?；蚍中涂梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來完成。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述SDR-O生物體的基因分型借助于揭示核酸多態(tài)性的方法來進(jìn)行。許多揭示這樣的多態(tài)性的技術(shù)是已知的，例如AFLP、RFLP、SNP、SFP、SSR、RAPD。這一分子標(biāo)記技術(shù)列表僅作為實例給出，而決不是限制本發(fā)明。有利地，所述SDR-1子代群體的產(chǎn)生在變化的條件下，特別是在變化的環(huán)境條件下進(jìn)行。所述變化的環(huán)境條件選自實驗室條件和野外條件。這兩種類型的條件可以進(jìn)一步根據(jù)天氣條件而發(fā)生變化。采用這種方法，有可能發(fā)現(xiàn)僅在某些條件下表型上可見的性狀并對其進(jìn)行作圖。在一個進(jìn)一步的實施方案中，相同的性狀在不同的遺傳背景中進(jìn)行作圖。采用這種方法，有可能發(fā)現(xiàn)在一種遺傳背景中的相互作用基因座，這種相互作用基因座在另一種遺傳背景中是不可見的。本發(fā)明實際上提供了新的起始群體和已知的QTL-作圖技術(shù)的組合。由于在這種群體中的雜合性水平比其他群體低得多，因而需要分析的生物體的數(shù)目比現(xiàn)有技術(shù)要少得多。此外，在本發(fā)明最基本的實施方案中，只有產(chǎn)生關(guān)于待進(jìn)行作圖的性狀來說發(fā)生分離的SDR-1子代群體的SDR-0生物體需要進(jìn)行基因分型，而其SDR-1子代群體關(guān)于那種性狀來說不發(fā)生分離的SDR-0生物體則不需要。負(fù)責(zé)該性狀的基因座則位于存在于分離性SDR-1子代群體的SDR-O生物體中的雜合染色體片段內(nèi)。減數(shù)分裂機(jī)制已經(jīng)描述得相當(dāng)詳細(xì)了，包括許多異常形式，其中尤其有稱為第一次分裂重建或FDR和第二次分裂重建或SDR。由于分別不存在第一次或第二次減數(shù)細(xì)胞分裂，所以這兩種減數(shù)分裂形式都導(dǎo)致二倍體配子的形成。SDR導(dǎo)致兩個姐妹染色單體都存在于孢子/配子中，所述孢子/配子因而就它們的遺傳組成而言，除了由于減數(shù)分裂重組而為雜合的那些區(qū)域(并且所述區(qū)域因而在供體植物中也是雜合的，所述供體植物為提供SDR-O孢子的植物)外，是相同的。在每個染色體臂發(fā)生單次交換的情形中，該染色體的遠(yuǎn)端，即從交換點(diǎn)朝向端粒，將是雜合的，而交換點(diǎn)近側(cè)的染色體區(qū)域(包括著絲粒)將是純合的。由于第一次減數(shù)分裂期間獨(dú)立的染色體再分配，所以SDR事件的染色體的純合區(qū)域含有來自父性或母性遺傳的染色體的遺傳信息，并因而SDR群體是十分異質(zhì)的。然而，SDR群體可以描述為包含與部分雜合的RIL或HIF和部分雜合的回交近交系(BIL)相似的品系的群體，所述部分雜合的回交近交系在兩個親本背景中都具有漸滲現(xiàn)象(introgression)。SDR孢子/配子的產(chǎn)生本身是眾所周知的，并且對于數(shù)種物種進(jìn)行了描述(參見例如Ki-ByungLim等人，(2004)BreedingScience54:13-18;VeilleuxR.(1985)PlantBreedingReviews3，253-288;BastiaanssenH.(1997)Markerassistedelucidationoftheoriginof2N-gametesindiploidpotato(PhD論文)ISBN90-5485-759-5(該論文還包括對許多作物的參考資料))。直到現(xiàn)在，復(fù)雜基因座還不能或很難通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在遺傳上進(jìn)行定位。本發(fā)明教導(dǎo)了一種用于制備作圖群體的全新方法，所述作圖群體使得能夠就出現(xiàn)分離的基因座掃描整個基因組。所述基因座的類型不限于多基因性狀，因為該系統(tǒng)學(xué)(systematics)也可以應(yīng)用于單基因性狀。本發(fā)明提供了一種新的并且出奇簡單的方法，其用于分析可能具有相互依賴和/或上位的相互作用的基因座。此外，本方法不限于僅2個基因座，而是可以應(yīng)用于相互作用的許多基因座，只要品系內(nèi)的分離可以測量或，見察。品系間變異眾所周知發(fā)生在完全純合的品系(例如雙單倍體)之間，而品系內(nèi)變異是指其中在品系內(nèi)有限數(shù)目的表型特性在個體植抹間不同的情況，這是由于品系親本中殘留的雜合性的分離引起的。根據(jù)本發(fā)明，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，從已經(jīng)省略了第二次減數(shù)分裂的孢子再生的植物(所謂的SDR-0植物)提供了獨(dú)特的材料以用于對性狀進(jìn)行作圖，包括極其復(fù)雜的性狀，例如依賴于處于各種等位構(gòu)型(allelicconfiguration)的多基因座位的存在的那些性狀，和用于對效應(yīng)例如雜種優(yōu)勢進(jìn)行作圖。SDR類型的未減數(shù)孢子的鑒定、富集或誘導(dǎo)，隨后這些孢子再生為植物(SDR-O)和所述SDR-0植物的分子表征(殘余雜合染色體區(qū)段的鑒定)和這些區(qū)段與SDR-1代中任何性狀或效應(yīng)的分離的相關(guān)性/關(guān)聯(lián)性，以及不同雜合SDR-O品系與它們的分離模式之間的比較，這些步驟的組合使得能夠?qū)ο嗷プ饔没虿幌嗷プ饔玫乃谢蜃M(jìn)行作圖和鑒定，無論是多基因的還是不是多基因的。對于單獨(dú)的SDR-O植物中交換斷裂點(diǎn)的鑒定和定位預(yù)測了負(fù)責(zé)SDR-1子代中特定表型性狀的分離的基因座的位置，并因而對其進(jìn)行了作圖。此外，精確作圖取決于再生的SDR-O植物的數(shù)目和取決于遺傳圖譜的大小而自動進(jìn)行。圖1描述了完全雜合的雜種的4個染色體對的正常減數(shù)分裂的發(fā)生，以及在發(fā)生減數(shù)分裂后染色體的自發(fā)加倍(稱為"相應(yīng)的雙單倍體")。在所描述的情形中，交換導(dǎo)致了每組中有兩個親本染色體和兩個重組染色體產(chǎn)生。由于來自不同染色體組的各自不同的同系物(homolog)的組合，可以產(chǎn)生許多不同的孢子/配子。圖1中僅描述了3種可能性。雙單倍體(DH)植物從這些"孢子"產(chǎn)生。雙單倍體的產(chǎn)生是一種完全確立了的技術(shù)(Doubledhaploidproductionincropplants,Ed:N.Maluszynski，K.Kasha,B.ForsterandI.Szarejko.KluwerAcademicpublishers,Dordrecht/Boston/London,(2003)ISBNl-4020-1544-5)。圖2描述了與圖1中相同的雜合雜種的減數(shù)分裂，但處于第二次分裂不能發(fā)生的情況(即第二次分裂重建的情形)。在這種具體的情形中，形成了二倍體孢子，然而與其中發(fā)生了自發(fā)或誘導(dǎo)的染色體加倍的圖l相反，二倍體孢子的產(chǎn)生是由于不存在第二次減數(shù)分裂而引起的。在這兩幅圖中描繪了4個染色體對，并且同系物以淺色或黑色棒狀結(jié)構(gòu)顯示，其中棒狀物上的黑色圓圏表示著絲粒。雙單倍體植物和二倍體SDR植物之間的本質(zhì)不同通過SDR植物中的染色體上的雜合區(qū)段而清楚地看出，而DH植物是完全純合的。在這種理論的情形中，分別產(chǎn)生單倍體孢子(從它制備DH)或產(chǎn)生SDR-O孢子的起始植物(供體植物雜種AB)含有完全雜合的同源染色體。這表明，由那些染色體攜帶的基因的所有等位基因都是不同的。然而，實際上，這是相當(dāng)不可能的，因而這種情形舉例說明了最極端的雜合情形。從圖2中還可以清楚地看出，在SDR情形中決定純合基因座與雜換的程度。每個染色體臂的交換程度的限度是由著絲粒的位置確定。當(dāng)然，也可以發(fā)生來自染色體的另一端的交換，并且在這種情形中也直到著絲粒。從100%雜合的植物開始，這意味著染色體上攜帶的基因的所有等位基因是多態(tài)性的，這是一種極端的情況。實際上，這是相當(dāng)不可能發(fā)生的，因此起始植物的雜合性百分比平均來說將是更低的。在圖2中還注意到，與RIL和BIL相似的SDR-植物的產(chǎn)生。在貌似BIL(BIL-look-alike)的情形中，著絲粒全部來自一個并且相同的原始親本，即A或B(參見圖1)。從源自正常減數(shù)分裂事件(其中染色體數(shù)目已經(jīng)自發(fā)地或借助于化學(xué)藥品加倍)的單倍體孢子再生的植物將進(jìn)一步被稱為DH-0。如果初級再生體源于由缺少第二次減數(shù)分裂的減數(shù)分裂事件而產(chǎn)生的孢子，則將植物稱為SDR-O。DH-O植物當(dāng)自花傳粉時將產(chǎn)生在遺傳上100%相同并且在所有等位基因中完全固定的子代(DH-1)。因而，盡管在DH-O植物上形成的孢子(配子)再次進(jìn)行減數(shù)分裂和重組，但是不能發(fā)生基因重排。這意味著，這種所謂的"純系"是永久的，因為不能發(fā)生分離。然而當(dāng)生長在不同條件下，例如低或高溫，或例如在不同氣候帶中時，這種純系可以在表型上顯示不同的表現(xiàn)。所述可以觀察到的不同是由于環(huán)境變化而引起的，并且對于所述品系的所有"成員"都是有效的。換而言之，沒有"品系內(nèi)"變異。來自不同DH-O植物的不同DH1品系的植物之間的不同具有遺傳基礎(chǔ)，并被稱為"品系間"變異。在SDR情形中，在SDR-1代中觀察到不同的圖像。圖3A和3B描述了在從圖2中的SDR-0事件3再生的植物中發(fā)生的孢子/配子形成。從圖3B中可清楚地看出，通過重組和組合可以發(fā)生全套的染色體組合，并且顯然地，組合的數(shù)目在染色體數(shù)目增加時增加。為了發(fā)現(xiàn)兩個近交親本之一的(部分雜合的)貌似BIL的情形，概率是(1/2)"、其中x是染色體的數(shù)目。為了找到特定的(部分雜合的)貌似BIL的情形，概率是(l/2)x。在表型上可觀察的最大變異取決于起始材料中的雜合性程度，并且還取決于重組發(fā)生的程度。在其中根本不發(fā)生重組，或僅在純合區(qū)域發(fā)生重組的不可能情況中，SDR-0再生體將在基因型和表型上都等價于雙單倍體(DH-0)。圖4顯示了僅在重組發(fā)生的程度上不同的理論上的個體SDR-O植林(對于一個染色體)。如果性狀或效應(yīng)的分離在SDR-0C的SDR-1代中發(fā)現(xiàn)而在SDR-OA和SDR-OB的SDR-1代中沒有發(fā)現(xiàn)，則由此斷定負(fù)責(zé)所述分離的染色體區(qū)域位于B和C的交換位置之間。取決于分子標(biāo)記的可利用性和可利用的SDR-O植物的數(shù)目，負(fù)責(zé)分離性表型的基因座因而可以得以非常精確地進(jìn)行作圖并且與已知的分子標(biāo)記相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的該方法在此稱為"反向子代作圖"。這種方法的獨(dú)特特點(diǎn)是，它使用來自親本植物作圖群體的植物子代的子代內(nèi)分離信息來進(jìn)行QTL-作圖。與經(jīng)常在傳統(tǒng)作圖中使用的子代手段的使用相反，本方法利用子代變異。其利用對于某一染色體位置來說雜合的個體和對于該位置來說純合的個體之間的對比，而不管是哪個親本等位基因的。傳統(tǒng)的方法利用染色體位置的全部三種等位基因狀態(tài)(純合親本(AA)、雜合親本(AB)、純合親本(BB))之間的對比，重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)兩種純合狀態(tài)之間的對比。在另一個實施方案中，反向子代作圖可以與常規(guī)的品系間作圖方法相組合以增加QTL-檢測的能力。在一個進(jìn)一步的實施方案中，個體SDR-l植林表型可用于一般的混合模型方法(mixturemodelapproach)(JansenRC(1992)Th眼.Appl.Genet.85:252-260)，其中對于在被分析的染色體位置上是雜合的每個SDR-0個體模擬三種可能的等位基因狀態(tài)。備選地，有可能使用SDR-l品系變異，例如來計算額外的似然比率，所述額外的似然比率可以與常規(guī)的似然比率(用于品系間作圖)相乘來獲得提高的測試統(tǒng)計量(statistic)。在另一個實施方案中，有可能對于SDR-1品系中分離存在或不存在簡單地使用打分。而且在該情況下，可以計算額外的似然比率。上面的實施例不排除將本發(fā)明的品系內(nèi)和品系間分離的利用與另一種用于QTL-作圖的技術(shù)相組合的其他可能性。存在其中反向子代作圖方法最佳地起作用的某些條件。在一個優(yōu)選的實施方案中，對于其來說QTL應(yīng)當(dāng)進(jìn)行作圖的性狀僅在部分SDR-1品系(優(yōu)選在50%到80%之間)中分離。這意味著，對于某些多基因性狀(對于所述性狀來說，更高數(shù)量的QTL在群體中分離)，需要較低水平的雜合性。如果必要，這可在HIF的情況中通過進(jìn)一步雜交或在SDR的情況中通過第二輪SDR來獲得，其中將每個SDR-0個體用于產(chǎn)生新的SDR-O植物，產(chǎn)生所謂的SDR2-0群體。應(yīng)該注意，群體大小足夠大以使整個基因組仍然表現(xiàn)為雜合狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明，基于SDR-O的反向子代作圖(RPM)結(jié)合了雙單倍體品系在表型記錄中的理想特征和評估雜合基因座單獨(dú)和與其他雜合或純合基因座相互作用的效應(yīng)的可能性。正如先前已經(jīng)說明的，SDR品系在其中它們?yōu)殡s合性的那些染色體區(qū)域與DH品系不同，所述雜合性是由于起始材料中的雜合性并且由于在那些雜合區(qū)段中的重組而引起的。這意味著，對于所有其他區(qū)段，SDR品系與DH-品系相似。這意味著，在表型水平上僅對有限數(shù)目的特征觀察到品系內(nèi)分離。然而，可以記錄需要特定基因座的雜合性的表型類別。如果，例如，決定一個特定性狀的基因座在SDR-O代中是雜合的，取決于第二輪配子形成中的重組位置，其可以在SDR-1代中產(chǎn)生1:2:1(AA:Aa:aa)的傳統(tǒng)的孟德爾分離。如果Aa表型不同于AA和aa，則仍可將其i己錄。在某一基因座必須是雜合狀態(tài)以快速生長的理論情形中，來自具有雜合狀態(tài)的該基因座的SDR-O植物的SDR-1品系將顯示較快生長對正常生長為1:1的分離，條件是第二輪重組沒有改變SDR-0植物的重組位置。與在DH-1品系之間發(fā)生的"品系間變異"相反，這是在SDR-0品系中應(yīng)用"品系內(nèi)變異"的一個清楚的實例。此外，理論上的"快速生長，，特征的分離可以通過SDR-0代中存在雜合片段來解釋。所以，足以在遺傳上分析SDR-O代來解釋在SDR-1代中在表型上有什么發(fā)生并對其進(jìn)行作圖。本發(fā)明方法的能力還通過單獨(dú)的基因座之間的相互作用可以進(jìn)行研究這個事實來證明。例如，考慮了這樣的植物，即其中一個基因座應(yīng)該是純合隱性的(aa)而另兩個基因座應(yīng)該是雜合的以顯示目標(biāo)性狀。在該情形中，如果SDR-O代是AA，則對于所述目標(biāo)性狀將不發(fā)生分離。但如果SDR-O代是aa，則對于其他基因座所述性狀仍將分離。這種所謂的上位效應(yīng)很難研究，特別是如果該性狀也依賴于環(huán)境。DH群體的表型記錄的優(yōu)勢由于缺乏品系內(nèi)分離和缺乏DH-植物的雜合性而被抵消。然而，F(xiàn)2-群體將顯示出所期望的所述性狀的分離，但倘若每個F2-個體具有不同的遺傳背景，則分析受整個基因組是分離性的這個事實阻礙。這形成了大的統(tǒng)計學(xué)背景噪音，其降低了檢測上位QTL-效應(yīng)的能力。除此之外，F(xiàn)2-植物僅可以進(jìn)行表型分析一次，這引入了大的環(huán)境誤差。在不同環(huán)境中復(fù)制DH品系并數(shù)次記錄表型差別的可能性是可靠的QTL-作圖的一個巨大優(yōu)勢。本發(fā)明方法同樣是這樣的。當(dāng)從SDR-O品系產(chǎn)生足夠的種子以使得能夠在不同條件下測試相同的SDR-1代時，不僅可以記錄以純和狀態(tài)作出貢獻(xiàn)的基因座，而且還可以記錄以雜合狀態(tài)表現(xiàn)不同的基因座。記錄是可能的，當(dāng)然，對于編碼定性或數(shù)量性狀的單基因座位來說也是可能的。這是相對于現(xiàn)有技術(shù)來說一個明顯的優(yōu)勢。染色體上的圖距以本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的厘摩(cM)表示。在IOO厘摩的間隔中，平均每個染色單體出現(xiàn)一個交換(VandenBergJ等人，(1997)第334-396頁，in:Plantmolecularbiology-alaboratorymanual,Ed.M.Clark,SpringerVerlag，Berlin)。這意味著，如果要尋求對位于離著絲粒1cM處的性狀進(jìn)行作圖，在50個重組體中有1個具有直到離著絲粒1cM的染色單體互換。當(dāng)然，這適用于著絲粒的任一側(cè)。在表1中，概括了使用某些群體類型用于QTL-作圖的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。它們中的大多數(shù)前面已經(jīng)提過；否則將它們在表中注明。從該表中可清楚地看出，與其他群體相比較，產(chǎn)生基于SDR的群體需要有限的時間和投入，具有產(chǎn)生非常好的結(jié)果的前景。以這種方式，SDR-方法將雙單倍體群體(DH)的優(yōu)勢(即以有限的花費(fèi)進(jìn)行快速的群體發(fā)展)與雜合近交家族(HIF)的QTL-作圖潛力(即可靠的表型分析，強(qiáng)的QTL檢測能力，包括它們的雜合和上位效應(yīng)，以及用于精細(xì)作圖的潛力)相結(jié)合。表1.產(chǎn)生和使用數(shù)種群體類型以用于QTL-作圖所需要的投入以及潛在結(jié)果的概述。投入(花費(fèi)/時間范圍)*:非常有限，**:有限，***:一般，大，非常大；結(jié)果(除了雜合子的QTL-效應(yīng)的估計)--非常差，-差，=:中等，+=合理，++=好，+++=非常好；結(jié)果(僅對于雜合子的QTL-效應(yīng)的估計)-不可能，=:可能，+:好。BCx:在x輪回交后的回交群體；RIL:重組近交系；HIF:雜合近交家族BIL:回交近交系；DH:雙單倍體系；SDR:由第二次分裂重建產(chǎn)生的品系。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>隨機(jī)2>=2++71參見例如JeukenMJW,LindhoutP(2004):Thedevelopmentoflettucebackcrossinbredlines(BILs)forexploitationoftheLactucasaligna(wildlettuce)germplasm;Theor.Appl.Genet.109(2):394-4012用于例如LD-作圖的育種系、變種、基因庫參加者的群體3投入隨著回交代數(shù)(x)而增加4對多個等位基因進(jìn)行單倍體型分析所需的高數(shù)目的標(biāo)記5足夠覆蓋基因組(特別是在更高的回交代中)所需的更高數(shù)目6F3-品系表型分析比F2-植物表型分析更可靠7無限的復(fù)制是可能的8無限的復(fù)制是可能的，取決于每個品系的種子量9通過與輪回親本雜交是可能的10僅在雜種的情形中11取決于群體中連鎖不平衡的程度12僅純和基因座之間的QTL-相互作用ZhangX等人((2002)JournalofHorticulturalScience&Biotechnology78(1)，84-88)發(fā)現(xiàn)，在辣椒中，通過將植物暴露于11。C下48小時可以將SDR2n配子(花粉)的頻率從<1°/。增加至高達(dá)10.5%(平均值)。最大的SDR發(fā)生率據(jù)測量為81.3%。根據(jù)本發(fā)明可將該方法用于增加SDR事件的數(shù)目，并因而增加SDR-0配子的數(shù)目。除了SDR的自發(fā)發(fā)生或通過環(huán)境脅迫誘導(dǎo)SDR-0事件數(shù)目的增加之外，還提供了不同的遺傳方法，所述方法使得能夠干擾參與減數(shù)分裂的第二次細(xì)胞分裂的基因功能。這樣的干擾可以通過誘變或基因轉(zhuǎn)移(transgenesis)來進(jìn)行。轉(zhuǎn)基因方法旨在穩(wěn)定或暫時引入修飾減數(shù)分裂的第二次分裂的DM片段從而導(dǎo)致SDR類型的二倍體孢子。所述的修飾可以通過干擾參與減數(shù)分裂過程的遺傳因子，尤其是參與第二次細(xì)胞分裂的那些來進(jìn)行。所述的干擾可以通過基于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的特異性基因表達(dá)下調(diào)來建立。PTGS可以通過RNA-干擾(RNAi)或病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)來完成。用于此的技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)所熟知的。在另外一個方法中，所述干擾可以通過過表達(dá)對于減數(shù)分裂的第二次分裂施加顯性負(fù)影響的蛋白質(zhì)來建立，從而導(dǎo)致SDR。因此，在本發(fā)明的第一個實施方案中，未減數(shù)SDR-0細(xì)胞群體由經(jīng)選擇而顯示出高于平均值的第二次分裂重建的生物體產(chǎn)生。備選地，SDR-0細(xì)胞群體由經(jīng)遺傳修飾而顯示出高于平均值的第二次分裂重建的生物體產(chǎn)生。所述遺傳修飾是暫時的，或者是通過將增加生物體中第二次分裂重建事件數(shù)目的遺傳元件穩(wěn)定整合入基因組中。在更進(jìn)一步的實施方案中，未減數(shù)SDR-0細(xì)胞群體由受到環(huán)境脅迫而顯示出高于平均值的第二次分裂重建的生物體產(chǎn)生。環(huán)境脅迫的實例是溫度脅迫、N02、一氧化二氮N,O或它們的組合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及可通過以下步驟獲得的作圖群體用于對物種中的一個或多個性狀進(jìn)行作圖的用途a)提供SDR-0生物體特別是植物的群體，所述生物體每一個起源于由第二次分裂重建產(chǎn)生的未減數(shù)細(xì)胞群體特別是未減數(shù)孢子群體中的一個成員；和b)產(chǎn)生每個這些SDR-0生物體的SDR-1子代群體。無論釆用什么方法，均需要在分子水平上知道靶標(biāo)基因。已經(jīng)描述了導(dǎo)致SDR-類型的減數(shù)分裂的馬鈴薯(pcpc、osos、fcfc)和玉米(elongate)的許多隱性突變體。在這些特定實例中已經(jīng)突變的基因還沒有在分子水平上被鑒定，但是它們是使用分子抑制技術(shù)在靶物種中獲得SDR的極好候選物，盡管它們?nèi)耘f還未克隆。本發(fā)明涉及反向子代作圖的一般原理，并且不是所有可能的在供體生物體中誘導(dǎo)SDR的實施方案已經(jīng)得以描述這一事實對于本發(fā)明來說是無關(guān)的。備選方案可以在基因如DUET(VenkataReddy等人，(2003)Development130,5975-5987)和CYC1;2(Wang等人，(2004)PlantPhysiology(Jra6/^;^"Ma7/a/7a)中進(jìn)行了描述，并且所述基因在突變后導(dǎo)致異常形式的減數(shù)分裂。在這些突變體中的二倍體減數(shù)分裂產(chǎn)物是SDR樣的，并因而DUET和CYC1;2以及它們在其他植物物種中的功能同系物是獲得SDR減數(shù)分裂的候選耙基因。另外一個候選粑基因是TETRASPORE/STUD(Yang等人，(2003)PlantJ.34，229-240)，其在敲除后導(dǎo)致減數(shù)分裂后細(xì)胞分裂的缺失。tetraspore/stud突變體的小孢子的二倍體再生體可以是SDR樣的。2n孢子或配子的發(fā)生不限于雄配子體，而是還存在證據(jù)表明這也在雌配子體的水平上發(fā)生。ZagorchevaL報道了在黃瓜中出現(xiàn)大孢子發(fā)生和大酉己子發(fā)生的偏離，參見Macrosporgenesisandmacrogametogenesis((1976)GeneticsandPlantBreeding9(5)pp386-399)。此外，通過根據(jù)EPG374755在黃瓜中產(chǎn)生單倍體和雙單倍體，本發(fā)明者通過使用AFLP分析(根據(jù)EPG534858進(jìn)行)發(fā)現(xiàn)，在所預(yù)期的雙單倍體中，某一百分比不源于單倍體大孢子而是來源于未減數(shù)大孢子(2n)。這在圖5、6和7中證明。圖5顯示了黃瓜中典型F2系的AFLP模式。每條水平線代表1個單獨(dú)的植林。每一豎欄表示一連鎖群。淺灰色部分表示雜合區(qū)域，而黑色和暗色區(qū)域表示各自的純合區(qū)域。圖6顯示了黃瓜中典型DH系的AFLP分析。每條水平線代表1個個體植物。每一豎欄表示一連鎖群。正如在DH中所預(yù)期的，僅存在黑色和暗色區(qū)域，而不存在淺灰色部分。圖7顯示了黃瓜中典型SDR-O植物的AFLP分析。每條水平線代表l個單獨(dú)的植林。每一豎欄表示一連鎖群。淺灰色部分表示雜合區(qū)域，而黑色和暗色區(qū)域表示各自的純合區(qū)域。從這些附圖的比較可得出結(jié)論，這些植物中的雜合性比一般F2中的要低很多。因而，這些附圖顯示，最初推測的雙單倍體(圖7)仍然含有雜合部分，這根據(jù)定義在真正的雙單倍體(圖6)中是不可能的。為了比較，圖5顯示了典型的F2群體的AFLP分析。取決于起始材料的多態(tài)性的量，可以獲得未減數(shù)孢子/配子及其植物，其僅含有一個或十分有限數(shù)目的雜合區(qū)段。如果在這種情形中，SDR-1代中的分離性性狀和在SDR-0植物中的雜合區(qū)段位置之間存在因果關(guān)系，那么作圖是十分容易的并且可以進(jìn)行精細(xì)作圖以便通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)一步降低雜合區(qū)段的大小。為了獲得SDR配子，可以使用許多不同的方法。在許多物種中，二倍體配子自發(fā)產(chǎn)生，在雄性和雌性兩邊都產(chǎn)生，這可以通過特定的脅迫條件來增強(qiáng)。再生可以通過的孤雄發(fā)育、雌核發(fā)育或經(jīng)針刺授粉(pricklepollination)的孤雌生殖來進(jìn)行?？梢酝ㄟ^用二倍體花粉進(jìn)行授粉并確定后代的倍性水平來進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)SDR性母細(xì)胞通過雄性減數(shù)分裂產(chǎn)生時，有可能通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光激活細(xì)胞分選術(shù)來富集雙倍體細(xì)胞。這些技術(shù)本身是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且過去已經(jīng)應(yīng)用到小孢子上(參見例如DeslauriersC等人，(1991)Biochem.Biophys.Acta1091，165-172)，但這些技術(shù)還沒有用于本發(fā)明的作圖方法中。未減數(shù)孢子或花粉比它們的單倍體同等物要大。令人驚訝地，2n孢子在物理上不同于n孢子這一僅有的事實使得有可能通過流式細(xì)胞術(shù)來特異地富集2n孢子。圖8顯示了試驗的結(jié)果，在所述試驗中將來自四倍體植物(產(chǎn)生二倍體(2n)孢子)的甘藍(lán)小孢子與來自二倍體植物(產(chǎn)生單倍體(n)孢子)的小孢子相混合。較大的孢子是2n。因而，根據(jù)它的進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用于富集細(xì)胞特別是孢子或配子的群體中的SDR細(xì)胞特別是SDR孢子或配子的方法，所述方法包括基于大小、質(zhì)量或DNA含量來分選細(xì)胞特別是孢子或配子的群體，并選擇具有增加的大小、質(zhì)量或DNA含量的細(xì)胞特別是孢子或配子作為未減數(shù)細(xì)胞特別是未減數(shù)孢子或配子。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了用于富集孢子或配子群體中的SDR孢子或配子的方法，所述方法包括借助于分選設(shè)備，特別是借助于FACS來分選孢子或配子群體的成員。因此，本發(fā)明涉及從SDR或SDR-樣未減數(shù)配子再生的植物和它們的子代用于對多基因性狀或效應(yīng)進(jìn)行作圖，用于對數(shù)量性狀作圖或效應(yīng)進(jìn)行作圖，用于對相互依賴的基因座進(jìn)行作圖，用于對顯示出上位相互作用的基因座進(jìn)行作圖，用于對效應(yīng)如雜種優(yōu)勢或配合進(jìn)行作圖力，以及用于對單或寡基因性狀進(jìn)行作圖的用途。在此特別涉及植物地描述了本發(fā)明，但所述技術(shù)不限于植物而是也可以用于對其他生物體例如真菌或動物中的性狀進(jìn)行作圖。當(dāng)在本申請中使用術(shù)語"未減數(shù)細(xì)胞"時，旨在指"未減數(shù)的生殖細(xì)胞"，例如孢子或配子。本發(fā)明將在后面的實施例中進(jìn)一步舉例說明，并且無意于以任何方式限制本發(fā)明。實施例實施例1通過引入Elongatel在玉米中產(chǎn)生SDR-0生物體將核酸整合入玉米的基因組中是常規(guī)程序，并且如何完成這一過程的方法已經(jīng)在例如EP-801134、US-5，489，520中描述。EP-97114654.3教導(dǎo)了DSM6009玉米原生質(zhì)體的土壤桿菌轉(zhuǎn)化。Elongatel(Barell，PJ和Grossniklaus，U.(2005)PlantL43，309-320)是一種擾亂減數(shù)分裂從而導(dǎo)致省略笫二次減數(shù)分裂的核因而，獲得了SDR類型的異常孢子。由于轉(zhuǎn)基因核酸序列整合的不同基因組位點(diǎn)，所形成的SDR孢子的頻率有時候在獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體之間不同。由于SDR-事件而產(chǎn)生的小孢子或大孢子含有一套二倍染色體。這些二倍體小孢子或大孢子是用于產(chǎn)生SDR-0再生體的起始材料。按常規(guī)從小孢子獲得玉米中的單倍體PescitelliS和PetolinoJ(1988)PlantCellReports7:441-444;Co畫nsM等人，(1989)PlantCel1Reports7:618-621;Pescitel1iS等人，(1989)PlantCel1Reports7:673-676;ButerB(1997)Invitrohaploidproductioninmaize.In:InVitroHaploidProductioninHigherplants,vol4，37-71，KluwerAcademicPublishers.Eds.SJain，SSopory&RVeilleux。備選地，單倍體玉米植物可以在用單倍體誘導(dǎo)者進(jìn)行天然和人工授粉后獲得。在這種情形中，根椐RotarencoV(2002)MaizeGeneticsCooperationNewsLetter76:16獲得含有單倍體胚的種子。將上面用于產(chǎn)生DH玉米植物的方案也應(yīng)用于從SDR-0細(xì)胞產(chǎn)生SDR-0玉米胚，所述SDR-0細(xì)胞的形成是通過將Elongatel整合入基因組中來誘導(dǎo)。為了在SDR-0谷粒的胚乳范圍內(nèi)于母本和父本基因組之間獲得正確的平衡，優(yōu)選將所述誘導(dǎo)者品系用作四倍體傳粉者。實施例2通過低溫或一氧化氮?dú)怏w處理在玉米中產(chǎn)生SDR-0生物體如Kato，A和Birchler，JA(2006)J,Hered.1，39-44所描述的，通過用低溫處理玉米植物或通過施加一氧化氮增加了SDR孢子的頻率。由于應(yīng)用了低溫或一氧化氮處理，產(chǎn)生了許多SDR類型的小孢子或大孢子?；赟DR小孢子在大小上與正常單倍體小孢子相比較而言較大這一事實，通過使用流式細(xì)胞術(shù)或熒光激活細(xì)胞分選術(shù)富集了孢子群體中的SDR小孢子。由于SDR-事件而產(chǎn)生的小孢子或大孢子含有一套二倍染色體。這些二倍體小孢子或大孢子是用于產(chǎn)生SDR-O再生體的起始材料。如實施例l中所描述的，按常規(guī)從小孢子獲得玉米中的單倍體。在用所謂的單倍體誘導(dǎo)者進(jìn)行天然或人工授粉后還獲得了單倍體玉米植物。在這種情形中，根據(jù)Rotare'ncoVQ002)(如上)獲得了含有單倍體胚的種子。將上面產(chǎn)生DH玉米植物的方法也應(yīng)用于從SDR-O細(xì)胞產(chǎn)生SDR-O玉米胚，所述SDR-0細(xì)胞的形成是通過該實施例中詳細(xì)說明的處理來誘導(dǎo)。如實施例1中提到的，優(yōu)選使用所謂的單倍體誘導(dǎo)者作為四倍體傳粉者以便在胚乳水平上平衡父本和母本基因組。實施例3SDR-0生物體的鑒定和表征可以將來自實施例1和2的SDR-0玉米植物與未經(jīng)歷SDR的DH植物(或與FDR(第一次分裂重建)植物)相區(qū)分，因為它們是部分雜合的但具有純合的著絲粒區(qū)。如實施例5中對黃瓜所描述的，使用AFLP分析，未經(jīng)歷SDR的DH-O玉米植物將顯示出沒有雜合區(qū)域的AFLP標(biāo)記沖莫式，而已經(jīng)經(jīng)歷SDR的DH玉米植物將在AFLP標(biāo)記才莫式中顯示出雜合區(qū)域。然后，如實施例5中對黃瓜所描述的，進(jìn)行圖譜構(gòu)建和統(tǒng)計學(xué)分析。實施例4玉米中SDR-1群體的分析和性狀的精細(xì)作圖在一致的條件下觀察每個在它們基因組中攜帶雜合區(qū)域的SDR-0植物的子代，并且根據(jù)發(fā)生分離的性狀將分離性子代分類。將導(dǎo)致產(chǎn)生對于特定性狀來說出現(xiàn)分離的SDR-1子代的SDR-O植物相互比較，以及與對于該性狀來說不分離的品系進(jìn)行比較。SDR-1代中的分離可能與SDR-O植物基因組的雜合區(qū)段相關(guān)聯(lián)。這可以通過經(jīng)典的QTL分析來確證，所述QTL分析確定大多數(shù)的側(cè)翼標(biāo)記和性狀基因座之間的最大似然間隔。負(fù)責(zé)SDR-1代中的分離的基因座的精細(xì)作圖根據(jù)Peleman，J等人，(1995)Genetics171:1341-1352來進(jìn)行。實施例5用于在黃瓜SDR-0植物中進(jìn)行作圖的雜合區(qū)段的產(chǎn)生和鑒定1.雙單倍體和SDR-G植物從來源于2個純合(純的)黃瓜品系之間的雜交的Fl再生出雙單倍體和SDR-0植物。所有單獨(dú)的DH和SDR-0植物通過AFLP進(jìn)行基因型分析。雙單倍體和SDR-0植物的產(chǎn)生根據(jù)EP0374755來進(jìn)行。2.AFLP分析如VosP等人，(1995)NucleicacidsResearch23(21):4407-4414所描述的，進(jìn)行對DH-0和SDR-0植物的AFLP分析。用QuantarPro(Keygene，Wageningen，TheNetherlands)處理和分析數(shù)據(jù)，允許AFLP標(biāo)記的共顯性打分。3.圖譜構(gòu)建和統(tǒng)計學(xué)分析用計算機(jī)程序包JoinMapversion2.0(Stam，P.，(1993)PlantJ.3:739-744)來計算遺傳圖i普。4.分離特征預(yù)期下面的特征發(fā)生分離。頂端分裂葉大小生長速率每節(jié)的果實數(shù)節(jié)間長度花的大小果實大小果實顏色5.結(jié)果圖10顯示了對SDR-0和DH-0植物的AFLP分析的結(jié)果。每條單獨(dú)的線表示單個DH-0植物和SDR-0植物。每一豎欄表示一連鎖群。在DH系和攜帶雜合區(qū)段(淺灰色區(qū)域)的品系之間可以作出明顯不同的分類。因此，上述性狀在SDR-1代中的分離與雜合區(qū)段相關(guān)聯(lián)。6.精細(xì)作圖負(fù)責(zé)SDR-1代中的分離的基因座的精細(xì)作圖根據(jù)Peleman，J等人，(2005)Genetics171:1341-1352來進(jìn)行。實施例6甜椒(Ca/^/c咖a"/u咖L.)中未減數(shù)孢子/配子形成的增強(qiáng)為了增加未減數(shù)孢子/配子形成的頻率，將冷脅迫作為誘導(dǎo)劑應(yīng)用，完全如ZhangX等人，(2002，同上)所描述的。為此，將含有成熟前的花芽并在23。C下生長的有花甜椒植林暴露于irc下2天。這種冷擊后，釆集花芽并且通過用解剖鑷和解剖刀打開花藥來提取花粉。隨后將花粉轉(zhuǎn)移至顯微鏡栽玻片上，并用一滴乙酸洋紅就生存力進(jìn)行染色。將蓋玻片放在懸浮液上面，并用光學(xué)顯微鏡觀察所述懸浮液。作為對照，從在23。C下生長的甜椒植林收集花粉。圖9顯示了從冷處理的植物(9A)相對于從對照植物(9B)收集的花粉的形態(tài)學(xué)的代表性實例。可以看出，對于經(jīng)冷處理的植物，具有更大的大小(表明來源于未減數(shù)孢子)的花粉的數(shù)目大大增加。在這個特定的實例中，據(jù)估計，由于冷處理，變大的孢子的°/。升高至25。因此，顯示出，通過溫度脅迫來增強(qiáng)未減數(shù)孢子的形成是十分可行的。權(quán)利要求1.用于對在生物體中，特別是在植物中的性狀進(jìn)行作圖的方法，所述方法包括以下步驟a)提供SDR-0生物體特別是植物的群體，所述生物體每一個起源于由第二次分裂重建產(chǎn)生的未減數(shù)細(xì)胞群體特別是未減數(shù)孢子群體中的一個成員；b)產(chǎn)生每個這些SDR-0生物體的SDR-1子代群體；c)對SDR-1子代群體進(jìn)行表型分析以鑒定每個SDR-1子代群體內(nèi)的分離性性狀；d)如果分離性子代存在于SDR-1子代群體中，則對相應(yīng)的SDR-0生物體進(jìn)行基因分型，并將其基因型與其他SDR-0生物體的基因型進(jìn)行比較以鑒定與在所述SDR-1子代群體中鑒定出的分離性性狀的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)的雜合染色體區(qū)域。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述未減數(shù)細(xì)胞群體通過下列方式來獲得，所述未減數(shù)細(xì)胞中的每一個產(chǎn)生SDR-O群體的植物，所述方式為基于大小、質(zhì)量或DNA含量來分選細(xì)胞特別是孢子的群體，并選擇具有增加的大小、質(zhì)量或DM含量的細(xì)胞特別是孢子作為未減數(shù)細(xì)胞特別是未減數(shù)孢子的群體的成員。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞特別是孢子借助于流式細(xì)胞儀、離心機(jī)進(jìn)行分選，或采用顯微操作器人工進(jìn)行分選。4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述SDR-l子代群體的表型分析借助于目視觀察或通過分析每個SDR-l生物體中的離子、轉(zhuǎn)錄物、蛋白質(zhì)、代謝物或其組合的含量和/或組成來進(jìn)行。5.權(quán)利要求4的方法，其中表型分析借助于表型組學(xué)、離子組學(xué)、轉(zhuǎn)錄物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)或其組合來進(jìn)行。6.權(quán)利要求l-5中任一項的方法，其中所述SDR-0生物體的基因分型借助于揭示核酸多態(tài)性的方法來進(jìn)行。7.權(quán)利要求6的方法，其中'所述揭示核酸多態(tài)性的方法選自AFLP、RFLP、SNP、SFP、SSR、RAPD。8.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述SDR-1子代群體的產(chǎn)生在變化的條件下，特別是在變化的環(huán)境條件下進(jìn)行。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述變化的環(huán)境條件選自實驗室條件和野外條件，并且其中這兩種類型的條件根據(jù)天氣條件而發(fā)生變化。10.權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述未減數(shù)SDR-0細(xì)胞群體由經(jīng)選擇而顯示出高于平均值的第二次分裂重建的生物體產(chǎn)生。11.權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述SDR-0細(xì)胞群體由經(jīng)遺傳修飾而顯示出高于平均值的第二次分裂重建的生物體產(chǎn)生。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述遺傳修飾是暫時的。13.權(quán)利要求11的方法，其中所述遺傳修飾是通過將增加生物體中第二次分裂重建事件數(shù)目的遺傳元件穩(wěn)定整合入基因組中。14.權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述未減數(shù)SDR-O細(xì)胞群體由受到環(huán)境脅迫而顯示出高于平均值的第二次分裂重建的生物體產(chǎn)生。15.權(quán)利要求14中的方法，其中所述環(huán)境脅迫選自溫度脅迫、即2、一氧化二氮N20或它們的組合。16.可通過以下步驟獲得的作圖群體用于對物種中的一個或多個性狀進(jìn)行作圖的用途a)提供SDR-0生物體特別是植物的群體，所述生物體每一個起源于由第二次分裂重建產(chǎn)生的未減數(shù)細(xì)胞群體特別是未減數(shù)孢子群體中的一個成員；和b)產(chǎn)生每個這些SDR-0生物體的SDR-1子代群體。17.用于富集細(xì)胞特別是孢子或配子的群體中的SDR細(xì)胞特別是SDR孢子或配子的方法，所述方法包括基于大小、質(zhì)量或DNA含量來分選細(xì)胞特別是孢子或配子的群體，并選擇具有增加的大小、質(zhì)量或DNA含量的細(xì)胞特別是孢子或配子作為未減數(shù)細(xì)胞特別是未減數(shù)孢子或配子。18.權(quán)利要求17的方法，其中分選所述群體借助于熒光激活細(xì)胞分選儀來進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明涉及用于對在生物體中，特別是在植物中的性狀進(jìn)行作圖的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法包括a)提供SDR-0生物體特別是植物的群體，所述生物體每一個起源于由第二次分裂重建產(chǎn)生的未減數(shù)細(xì)胞群體特別是未減數(shù)孢子群體中的一個成員；b)產(chǎn)生每個這些SDR-0生物體的SDR-1子代群體；c)對SDR-1子代群體進(jìn)行表型分析以鑒定每個SDR-1子代群體內(nèi)的分離性性狀；d)如果分離性子代存在于SDR-1子代群體中，則對相應(yīng)的SDR-0生物體進(jìn)行基因分型，并將其基因型與其他SDR-0生物體的基因型進(jìn)行比較以鑒定與在所述SDR-1子代群體中鑒定出的分離性性狀的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)的雜合染色體區(qū)域。文檔編號A01H1/00GK101160043SQ200680012374公開日2008年4月9日申請日期2006年3月2日優(yōu)先權(quán)日2005年3月3日發(fā)明者J·W·舒特,R·H·G·迪克斯申請人:瑞克斯旺種苗集團(tuán)公司