專利名稱：慢病毒載體及其用途的制作方法
本申請(qǐng)要求2005年2月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/653,386；2005年3月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/660,310；2005年5月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/682,059；和2005年10月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/723,768的利益，它們被全文納入本文作為參考。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是以相反方向包含vsv-g和gag-pol的雙質(zhì)粒體系的輔助載體的示意圖。
圖2是表達(dá)綠熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)移載體的示意圖。
圖3是用于三質(zhì)粒體系的Tat和Rev表達(dá)示意圖，其中包膜和gag-pol序列位于另一個(gè)質(zhì)粒上。
圖4是本發(fā)明模塊轉(zhuǎn)移載體的實(shí)例。
發(fā)明描述 本發(fā)明提供了慢病毒載體、轉(zhuǎn)導(dǎo)載體、慢病毒體系、及它們?cè)诠δ苋旧w、藥物開發(fā)、靶體確認(rèn)、蛋白質(zhì)制備(例如治療性蛋白質(zhì)、疫苗、單克隆抗體)、基因治療和治療方法中的用途。使用本發(fā)明提供的新載體、或者使用本領(lǐng)域已知的慢病毒載體和體系，例如轉(zhuǎn)移載體(例如美國(guó)專利5,885,806或6,114,141)或非轉(zhuǎn)移或自失活載體(例如美國(guó)專利5,994,136或428,953)，可以實(shí)現(xiàn)本文公開的任何方法。
慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體 本發(fā)明涉及慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體及其制備構(gòu)件，它們可以用于將感興趣的可表達(dá)多核苷酸序列引入宿主細(xì)胞內(nèi)。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體是包膜的病毒顆粒，包含可表達(dá)的多核苷酸序列，可以滲入靶宿主細(xì)胞內(nèi)，從而將可表達(dá)的序列運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)。包膜顆粒優(yōu)選用工程化病毒包膜蛋白或來自另一病毒種類(包括非慢病毒)的天然病毒包膜蛋白質(zhì)假型化，以改變天然慢病毒的宿主范圍和傳染性。如下面詳述，轉(zhuǎn)導(dǎo)載體可以用于廣泛的用途，包括例如制備蛋白質(zhì)(包括制備疫苗)，用于基因療法，轉(zhuǎn)移治療性多肽，轉(zhuǎn)移siRNA、核酶、反義多核苷酸和其它功能性多核苷酸等。所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體可以運(yùn)送單個(gè)或雙基因，可以包含抑制序列(例如RNAi或反義)。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)載體還運(yùn)送包含修飾的3′LTR的核酸，其具有降低的但不是消失的轉(zhuǎn)錄活性。
慢病毒輔助構(gòu)件 本發(fā)明提供了慢病毒輔助構(gòu)件(例如質(zhì)?；蚍蛛x的核酸)。所述構(gòu)件包含如下元件其可用于在相容的宿主細(xì)胞內(nèi)制備功能性慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，并將可表達(dá)的異源序列包裝到其中。這些元件包括結(jié)構(gòu)蛋白(例如gag前體)、加工蛋白(例如pol前體)如蛋白酶、包膜蛋白質(zhì)、和在宿主細(xì)胞內(nèi)制備蛋白質(zhì)和組裝功能性病毒顆粒所需的表達(dá)和調(diào)整信號(hào)。盡管下述實(shí)施方案的同一質(zhì)粒上包含包膜和gag-pol前體，但是如果需要，它們可以被置于另外的質(zhì)粒上，包括gag、pol和包膜蛋白質(zhì)各自的獨(dú)立質(zhì)粒。
本發(fā)明的慢病毒輔助質(zhì)?？梢栽谌魏魏线m的順序或位置包含一種或多種下列元件，例如a)慢病毒5′LTR，其包含功能性天然啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可操作地聯(lián)接至編碼慢病毒gag和pol的多核苷酸序列(例如慢病毒gag-pol前體)；和b)可操作地聯(lián)接至包膜編碼序列的異源啟動(dòng)子。慢病毒5′LTR可以任選地含有位于天然序列上游的異源增強(qiáng)子序列。
任何合適的慢病毒5′LTR均能用于本發(fā)明，包括獲自任何慢病毒種類、亞種、菌株或進(jìn)化枝的LTR。其中包括靈長(zhǎng)類和非靈長(zhǎng)類慢病毒。種類等的具體實(shí)例包括但不限于例如HIV-1(包括亞種、進(jìn)化枝、或菌株，例如A、B、C、D、E、F和G、R5和R5X4病毒等)、HIV-2(包括亞種、進(jìn)化枝或菌株，例如R5和R5X4病毒等)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猿/人免疫缺陷病毒(SHIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊-關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒、Jembrana病病毒、綿羊慢病毒、綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎病毒和馬感染性貧血病毒?？梢詮V泛利用這些病毒的基因組序列，例如HIV-1(NC_001802)、HIV-2(NC_001722)、SIV(NC_001549)、SIV-2(NC_004455)、山羊-關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(NC_001463)、猿-人免疫缺陷病毒(NC_001870)、FIV(NC_001482)、Jembrana病病毒(NC_001654)、綿羊(NC_001511)、綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎病毒(NC_001452)、馬感染性貧血病毒(NC_001450)和BIV(NC_001413)。
慢病毒5′LTR包含用于基因表達(dá)的信號(hào)，包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄初始化(帽子)、轉(zhuǎn)錄終止子和多腺苷酸化。它們通常被描述為具有U3、R和U5區(qū)域。LTR的U3區(qū)域包含增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄調(diào)整信號(hào)，包括RBEIII、NF-kB、Sp1、AP-1和/或GABP基元。TATA框位于從R序列開始約25個(gè)堿基對(duì)處，這取決于5′LTR的來源種類和菌株?？梢岳猛耆暾?′LTR，或者利用修飾的拷貝。修飾優(yōu)選涉及R區(qū)域，其中TAR序列被取代(參見下面)、和/或刪除所有或部分U5區(qū)域。修飾的5′LTR優(yōu)選包含啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性，例如優(yōu)選是天然U3、具有被取代TAR的修飾的R、和天然U5。
5′LTR可以可操作地聯(lián)接至編碼慢病毒gag和pol的多核苷酸序列。術(shù)語“可操作地聯(lián)接”指LTR的定位方式可以驅(qū)動(dòng)所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄。在天然慢病毒中，gag和pol編碼序列被組織為Gag-Pol前體。編碼55-kD Gag前體蛋白的gag序列也稱為p55。在熟化為四個(gè)較小蛋白的過程中，p55被病毒編碼的蛋白酶4(pol基因的產(chǎn)物)裂解，四個(gè)較小蛋白名為MA(基質(zhì)[p17])、CA(殼體[p24])、NC(核殼體[p9])和p6。pol前體蛋白被病毒編碼的蛋白酶從Gag上裂解掉，進(jìn)一步消化以分離蛋白酶(p10)、RT(p50)、RNaseH(p15)、和整合酶(p31)活性。
輔助質(zhì)粒中可以存在一種或多種剪接供體(SD)位點(diǎn)。剪接提供位通常位于5′LTR的3′末端和包裝序列之間。也可能存在下游剪接受體(SA)，例如在pol序列的3′末端。SD位置可以在載體的任何有效位置以多個(gè)拷貝存在。SD可能包含天然慢病毒序列，或者它可能為其突變拷貝。
天然Gag-Pol序列可以用于輔助載體內(nèi)，或者可以進(jìn)行修飾。這些修飾(下面有更詳細(xì)的描述)包括嵌合Gag-Pol，其中Gag和Pol序列獲自不同的病毒(例如不同種類、亞種、菌株、進(jìn)化枝等)，和/或其中所述序列已經(jīng)被修飾以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，和/或降低重組。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，編碼gag和pol前體的序列可以被分離并置于不同的載體構(gòu)件中，其中各序列具有其自身的表達(dá)信號(hào)。
HIV-1的RNA基因組包含約120個(gè)核苷ψ包裝信號(hào)，在病毒組裝過程中，它由Gag多蛋白的核殼體(NC)區(qū)域識(shí)別。如果HIV前病毒遠(yuǎn)離5′LTRU5區(qū)域，則包裝信號(hào)的關(guān)鍵部分位于主要剪接供體(SD)位點(diǎn)和gag初始化密碼子之間。輔助質(zhì)粒的包裝信號(hào)功能性缺失，以避免將功能活性的gag-pol前體包裝到病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體內(nèi)。參見例如美國(guó)專利5,981,276(Sodroski等人)，其中描述了包含gag、但缺少包裝信號(hào)的載體。
為了提高、改進(jìn)、增強(qiáng)等gag-pol前體的轉(zhuǎn)錄，額外的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列可以置于5′LTR的上游。有用啟動(dòng)子的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(例如結(jié)構(gòu)性、誘導(dǎo)性、組織特異性)，來自其它慢病毒種類的CMV、RSV、LTR，和如上面和下面所述的其它啟動(dòng)子。
此外，質(zhì)?？梢赃M(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，例如polyA信號(hào)，它可以有效地終止由啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄?？梢岳萌魏魏线m的polyA序列，例如來自β球蛋白的序列(哺乳動(dòng)物、人、兔等)、胸苷激酶、生長(zhǎng)激素、SV40、和許多其它種類。
輔助構(gòu)件可以進(jìn)一步包含含有異源啟動(dòng)子的包膜模塊，該啟動(dòng)子可操作地聯(lián)接至包膜編碼序列。包膜多肽位于病毒表面上，參與病毒顆粒對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別和感染。通過例如用由不同(異源)病毒種類或已經(jīng)用其它方式修飾的病毒表達(dá)的包膜修飾或取代包膜多肽，可以改變宿主范圍和特異性。這稱為假型化。參見例如Yee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919564-9568，1994。因?yàn)槠鋸V泛的種類和組織向性、提供物理穩(wěn)定性的能力和對(duì)載體顆粒的高度傳染性，已經(jīng)廣泛使用皰疹性口腔炎病毒(VSV)蛋白G(VSV G)。參見例如Yee等，Methods Cell Biol.，(1994)4399-112。
可以不受限制地利用包膜多肽，包括例如HIV gp120(包括天然和修飾的形式)、Moloney鼠類白血病病毒(MoMuLV or MMLV)、Harvey鼠類肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV或MMTV)、長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、肝炎病毒、流感病毒(VSV-G)、Moloka、狂犬病、線狀病毒(例如Ebola和Marburg，例如GP1/GP2包膜，包括NP 066246和Q05320)、雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒、α病毒等。其它實(shí)例包括例如來自Togaviridae、Rhabdoviridae、Retroviridae、Poxviridae、Paramyxoviridae的包膜蛋白，和其它包膜的病毒家族。其它示例包膜來自位于全球性網(wǎng)絡(luò)ncbi.nlm.nih.gov/genomes/VIRUSES/virases.html上的下列數(shù)據(jù)庫(kù)所列的病毒。
而且，可以將病毒包膜蛋白修飾或工程化以包含下述多肽序列，該序列允許轉(zhuǎn)導(dǎo)載體靶向和感染其正常范圍以外的宿主細(xì)胞或?qū)⑥D(zhuǎn)導(dǎo)更特異性地限制到細(xì)胞或組織類型上。例如，包膜蛋白可以與導(dǎo)向序列一起加入框內(nèi)，導(dǎo)向序列例如受體配體、抗體(使用抗體或重組抗體型分子的抗原結(jié)合部分，例如單鏈抗體)、及其多肽分子的一部分或其修飾物(例如其中糖基化位置存在于目標(biāo)序列內(nèi))，當(dāng)該導(dǎo)向序列位于轉(zhuǎn)導(dǎo)載體外殼上時(shí)，有利于將病毒顆粒定向輸送至感興趣的靶細(xì)胞內(nèi)。而且，包膜蛋白可以進(jìn)一步包含調(diào)整細(xì)胞功能的序列。在混合細(xì)胞群中，用轉(zhuǎn)導(dǎo)載體調(diào)整細(xì)胞功能可以增加或降低對(duì)某些細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。例如，用含有可特異性結(jié)合干細(xì)胞的配體或結(jié)合伙伴的包膜序列可以更特異性地轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞，而不是在血液或骨髓中發(fā)現(xiàn)的其它細(xì)胞類型。這些配體在本領(lǐng)域中是已知的。非限制性實(shí)例為干細(xì)胞因子(SCF)和Flt-3配體。其它實(shí)例包括例如抗體(例如細(xì)胞類型特異性單鏈抗體)、和對(duì)組織如肺、肝、胰腺、心臟、內(nèi)皮、平滑肌、乳腺、前列腺、上皮、血管癌癥等特異性的其它任何抗原(包括受體)。
當(dāng)可操作地聯(lián)接時(shí)，可以利用任何異源啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)病毒包膜編碼序列的表達(dá)。實(shí)例包括例如CMV、E1Fα、E1Fα-HTLV-1雜合啟動(dòng)子、鐵蛋白啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、和本文所述的其它啟動(dòng)子等。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，gag和pol序列位于包膜序列的相反轉(zhuǎn)錄方向。后者意味著轉(zhuǎn)錄的方向是相反或逆轉(zhuǎn)的。通過將相應(yīng)的啟動(dòng)子放在相反的方向(例如相互面對(duì))或使用雙向啟動(dòng)子(例如Trinklein等，GenomeResearch 1462-66，2004)，可以實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)。這種排列可以用于安全的目的，例如用于降低功能性重組HIV基因組的重組和/或制備的風(fēng)險(xiǎn)。所述載體的安全性得到提高，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄連讀將不可能導(dǎo)致即包含功能gag-pol也包含包膜序列的RNA。通過利用可終止轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)多腺苷酸化序列，可以防止轉(zhuǎn)錄干擾。強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列的實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的，包括例如兔β-球蛋白多腺苷酸化信號(hào)(Lanoix和Acheson，EMBO J.1988 Aug；7(8)2515-22)。還參見Plant等，Molecular and Cellular Biology，April 2005，第3276-3285頁，Vol.25，No.8。此外，可以將其它元件插入和gag-pol和包膜編碼序列之間，以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止，例如靶向任何假定連讀序列的順式作用核酶或RNAi序列。類似地，可以將不穩(wěn)定序列、終止序列和停頓位點(diǎn)放置在編碼序列之間。
除了其中存在的5′LTR和/或gag和pol序列，輔助質(zhì)?？梢赃M(jìn)一步包括獲自不同慢病毒種類、組、亞種、亞組、菌株或進(jìn)化枝的TAR元件，即它對(duì)于質(zhì)粒構(gòu)件所含的其它慢病毒元件是異源的。在5′LTR中，TAR優(yōu)選位于其正常位置，例如在LTR的U3和U5元件之間，例如當(dāng)天然R被異源慢病毒種類的R′代替時(shí)。各種慢病毒種類的實(shí)例列于上面，從中可以獲得異源TAR元件。
TAR元件是反式活化響應(yīng)區(qū)域或響應(yīng)元件，位于病毒DNA的5′LTR(例如R)并處于相應(yīng)RNA的5′末端。當(dāng)存在于慢病毒RNA中時(shí)，轉(zhuǎn)錄反式活化劑Tat與之結(jié)合，從而多倍地激活從HIVLTR的轉(zhuǎn)錄。Tat是RNA結(jié)合蛋白，可結(jié)合至由TAR元件形成的短干回路結(jié)構(gòu)。
當(dāng)利用異源TAR元件時(shí)，通過用來自另一種類的TAR序列代替其天然TAR，可以常規(guī)地修飾的5′LTR。TAR區(qū)域的實(shí)例是公知的。參見例如DeAreliano等，AIDS Res.Human Retro.，21-.949-954，2005。這種修飾的的慢病毒5′LTR可以包括完整的U3和U5區(qū)域，從而LTR是完整功能的。TAR區(qū)域或完整的R可以被取代。
如上所述，Tat多肽與TAR序列結(jié)合。Tat編碼序列可能存在于輔助質(zhì)粒內(nèi)，或者它可能位于包裝體系的另一元件上。例如，可以將它整合到用于制備病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的細(xì)胞系基因組內(nèi)，或者位于引入細(xì)胞系內(nèi)的另一質(zhì)?；蜉d體構(gòu)件上?？梢允褂萌魏蜹at多肽，只要它可以與TAR結(jié)合并活化RNA的轉(zhuǎn)錄。其中包括獲自相同或不同種類作為同源TAR元件的天然Tat序列，以及工程化的或修飾的的Tat序列。
輔助質(zhì)粒可以進(jìn)一步包含RRE元件，包括獲自與5′LTR或gag和pol序列不同的慢病毒種類的RRE元件。RRE元件是rev多肽的結(jié)合位點(diǎn)，rev多肽是13-kD序列特異性RNA結(jié)合蛋白。包含RRE序列的構(gòu)件的有效表達(dá)取決于rev多肽。Rev結(jié)合至rev響應(yīng)元件(“RRE”)的復(fù)合RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的240堿基區(qū)域，rev響應(yīng)元件位于HIV的第二內(nèi)含子中，遠(yuǎn)離pol和gag編碼序列。rev與RRE的結(jié)合有利于將未剪接和不完全剪接的病毒RNA從核輸出到細(xì)胞質(zhì)，從而調(diào)整HIV蛋白質(zhì)的表達(dá)。RRE元件可以位于構(gòu)件的任何適當(dāng)位置上，優(yōu)選在Gag-Pol前體后面，在其大概天然位置內(nèi)。類似地，對(duì)于Tat多肽，可以利用任何合適的rev多肽，只要它保留著與RRE結(jié)合的能力。Rev編碼序列可以存在于輔助質(zhì)粒、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、獨(dú)立質(zhì)粒內(nèi)，或者整合到用于制備轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的宿主細(xì)胞系內(nèi)。類似地，tat編碼編碼序列可以存在于輔助質(zhì)粒、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、獨(dú)立質(zhì)粒內(nèi)，或者整合到用于制備轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的宿主細(xì)胞系內(nèi)。
本發(fā)明構(gòu)件所含的任何序列都可以是從其天然形式修飾得到以例如提高轉(zhuǎn)錄、提高翻譯、降低或改變二級(jí)RNA結(jié)構(gòu)、和/或降低重組。修飾包括例如核苷的添加、刪除、取代和置換。例如，通過用非天然密碼子代替天然密碼子，可以修飾gag、pol、rev和tat編碼序列，例如通過用在宿主細(xì)胞內(nèi)翻譯更有效的密碼子取代它們，來提高宿主細(xì)胞的翻譯。宿主細(xì)胞可以被稱為相容性細(xì)胞，例如來表明當(dāng)序列在特定宿主細(xì)胞類型中表達(dá)時(shí)，序列修飾具有其效果。此外，可以修飾序列以除去調(diào)整元件，例如包裝序列。還能改變序列以消除重組位點(diǎn)。重組點(diǎn)的實(shí)例為例如Zhuang等，J.Virol，7611273-11282，2002所公開的。
進(jìn)一步的實(shí)施方案包括開發(fā)用于制備慢病毒載體和包裝細(xì)胞系的輔助體系，然后將其進(jìn)一步開發(fā)成用于任何給定載體構(gòu)件的制備體細(xì)胞系。一個(gè)所述實(shí)施方案是使用細(xì)胞蛋白來提高慢病毒載體的制備。Sam68屬于包含KH區(qū)域的蛋白質(zhì)家族。一些KH蛋白質(zhì)是翻譯調(diào)節(jié)劑，而認(rèn)為其它KH蛋白質(zhì)可以介導(dǎo)可選擇的剪接。Sam68在體外和體內(nèi)結(jié)合HIV-1的Rev響應(yīng)元件(RRE)，在RRE介導(dǎo)的基因表達(dá)和病毒復(fù)制中，可以功能性代替HIV-1 Rev和/或與HIV-1 Rev協(xié)同(Modem等Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，873-879)。此外，還顯示Sam68可增強(qiáng)其它復(fù)合逆轉(zhuǎn)錄病毒的Rev樣蛋白的活性。近期，證實(shí)Sam68可增強(qiáng)要輸出至細(xì)胞質(zhì)的未剪接HIV-1RNA的3最初末端加工。除Sam68(即SLM-1、SLM-2、QKI-5、QKI-6和QKI-7)之外的其它KH蛋白還可以增加Rev/RRE介導(dǎo)的基因表達(dá)。然而，在所測(cè)試的KH蛋白中，只有Sam68可以活化組成型轉(zhuǎn)移元件(CTE)介導(dǎo)的gag基因在人細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。當(dāng)Rev過度表達(dá)時(shí)，Sam68與Rev協(xié)同以充分提高包含RRE的RNA從核的輸出。Rev不存在時(shí)Sam68的過度表達(dá)還有利于包含RRE的mRNA的核輸出。因此為了提高基于HIV的慢病毒載體從制備體細(xì)胞的制備，可以從輔助構(gòu)件表達(dá)Sam 68，以促進(jìn)將慢病毒載體RNA輸出到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并提高慢病毒載體顆粒的制備?？梢詮膔ev依賴型或rev非依賴型輔助構(gòu)件表達(dá)Sam68。本發(fā)明不限于Sam68，還可以靶向與HIV RNA相關(guān)的其它蛋白質(zhì)，例如SF2/ASF、hRIP、hRNP A1、p54nrb/PSF和RRE BP49。相反，靶向Sam68或這些其它蛋白質(zhì)的RNAi可以被插入慢病毒載內(nèi)，作為針對(duì)HIV感染的基因治療方法抑制野生型HIV RNA作為基因形式的輸出。參見下面詳述的HIV療法。
慢病毒轉(zhuǎn)移載體 本發(fā)明還提供了慢病毒轉(zhuǎn)移載體。轉(zhuǎn)移載體是包含多核苷酸序列的構(gòu)件，被包裝在轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒載體內(nèi)。當(dāng)包含5′LTR和3′LTR時(shí)，轉(zhuǎn)移載體可以用于制備可整合到宿主基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。這種整合可以通過例如使pol序列輔助質(zhì)粒上存在的整合酶分子突變而加以防止。然而，整合載體優(yōu)選用于長(zhǎng)期基因遞送。
本發(fā)明的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體可以包括一種或多種下列組分a)慢病毒5′LTR多核苷酸序列；b)遠(yuǎn)離所述5′LTR的包裝序列(ψ)；和c)修飾的包含TATA框序列的慢病毒3′LTR，但所述TATA框序列缺少3′U3序列5′。至少一種可表達(dá)的異源多核苷酸序列可以插入轉(zhuǎn)移載體內(nèi)，例如在包裝序列和3′LTR的U5區(qū)域之間。
任何適當(dāng)?shù)穆《?′LTR序列均可以被置于轉(zhuǎn)移載體內(nèi)。這樣的序列可以是完整和完全天然的，或者它可以如上所述被修飾，例如通過用異源TAR序列(R)代替TAR序列，或者通過用非天然發(fā)生的核苷代替其中的核苷，以使重組事件最小化。前述5′LTR具有U3、R和U5區(qū)域，這些區(qū)域存在，但可能以一定的方式修飾以使它們保留其功能性質(zhì)。
遠(yuǎn)離所述5′LFR的包裝序列(ψ)也可以存在于轉(zhuǎn)移載體內(nèi)。該序列(約110個(gè)核苷)由Gag的NC區(qū)域識(shí)別，順式地用于促進(jìn)將感興趣的異源序列包裝到轉(zhuǎn)導(dǎo)載體內(nèi)。參見例如Lever等，J.Virol.(1989)，634085-4087；Amarasinghe等，J Mol.Bio.(2001)，314(5)961-970。ψ包封序列相對(duì)鄰近序列是自治的。可以常規(guī)地確定它在轉(zhuǎn)移載體中的位置。參見例如Man andBaltimore，J Virol.，54(2)401-407，1985，其中使用報(bào)告基因來優(yōu)化包裝序列的位置。
轉(zhuǎn)移載體還可以包括慢病毒3′LTR。3′LTR具有U3、R5和U5區(qū)域，其兩側(cè)分別為TTP和PBS序列。3′LTR可能是完整和天然的，但優(yōu)選是被修飾的。修飾優(yōu)選地包括產(chǎn)生下述LTR的修飾，所述LTR保留最少量功能活性例如轉(zhuǎn)錄(啟動(dòng)子-增強(qiáng)子)功能活性。可以常規(guī)地確定所述轉(zhuǎn)錄活性，例如使用報(bào)告基因。生成具有降低的(與天然3′LTR相比)和最小功能活性的修飾的實(shí)例包括例如刪除U3區(qū)域內(nèi)TATA框的5′(上游)。這種刪除可以包括例如刪除或修飾一個(gè)或多個(gè)下列轉(zhuǎn)錄調(diào)整位點(diǎn)，例如RBEIII、NF-kB、和/或Sp1、以及PPT位點(diǎn)。具有最小轉(zhuǎn)錄活性的3′LTR的實(shí)例包括修飾的慢病毒3′LTR，該3′LTR包含TATA框序列，但所述TATA框序列缺少3′U3序列5′，或者其中5′序列被修飾(刪除、替代、添加)，從而使它們不是功能活性的。例如，可以將NF-kB和Sp1位點(diǎn)誘變成失活和/或不能結(jié)合至調(diào)整蛋白的位點(diǎn)。5′上游區(qū)域的刪除包括從TATA框的T核苷刪除約5、10、15、20、25、30、40、50等個(gè)核苷。保留的轉(zhuǎn)錄活性量可以為例如約0.1-1％、0.1-2％、0.1-5％、0.1-10％、0.1-20％、0.1-25％、0.5-5％、0.5-10％、0.5-20％、0.5-25％；約0.1％；約0.5％；約1％；約2％；約5％；約7％、約10％等。
U3區(qū)域的5′末端對(duì)于整合是必需的(末端二核苷酸+att序列)。因此，末端二核苷酸和att序列可以代表可以被刪除的U3序列的5′邊界。此外，轉(zhuǎn)移載體可以包括RRE序列，該序列可以位于中心多嘌呤追蹤序列的上游或下游。RRE或中心多嘌呤追蹤序列可以來自天然或非天然(異源)慢病毒載體序列。
通過插入異源序列，包括可表達(dá)的編碼序列如可表達(dá)的shRNA、核酶、反義、微小RNA′s和aptamer序列，可以功能性地打斷3′LTR的5′區(qū)域(例如U3)。這些序列可以由pol II和pol III(例如人U6、鼠U6和人H1、7SK)啟動(dòng)子表達(dá)，在載體基因組中可以位于3′LTR內(nèi)或LTR上游和5′LTR下游。關(guān)于啟動(dòng)子，參見例如Werner，T.(1999).Models for prediction and recognitionof eukaryotic promoters.Mammalian Genome 10，168-175。
然而，修飾的3′LTR可以保留著啟動(dòng)U3區(qū)域以外的序列，例如PPT、R和U5。對(duì)于5′LTR，可以用來自不同慢病毒種類或亞種的異源TAR序列代替R區(qū)域內(nèi)的TAR元件。
由于病毒轉(zhuǎn)錄在5′LTR U3區(qū)域的3′末端處開始，所以這些序列不是病毒mRNA的一部分，其來自3′LTR的拷貝作為模板用于產(chǎn)生整合的前病毒內(nèi)的兩種LTR。如果U3區(qū)域內(nèi)的3′LTR拷貝在載體構(gòu)件內(nèi)改變，則載體RNA仍然由制備體細(xì)胞內(nèi)的完整5′LTR產(chǎn)生，但不能在靶細(xì)胞內(nèi)再生。這樣的載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致后代病毒內(nèi)兩種LTR的失活。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒是自失活的(SIN)，所述載體被稱為SIN轉(zhuǎn)移載體。參見例如Mirta等，Nucl.AcidRes.，30(21)ell3，2002；Zufferey等，J.Virol，729873-9880，1998；美國(guó)專利6,428,953(Naldini等)。
可以將可表達(dá)的異源多核苷酸序列插入轉(zhuǎn)移載體內(nèi)，例如在包裝序列和3′LTR之間。可表達(dá)的序列是基本上以其有效負(fù)荷包裝在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體內(nèi)的序列。任何感興趣的異源序列均可以不受限制地插入轉(zhuǎn)移載體內(nèi)，包括編碼治療蛋白質(zhì)、酶、和抗體等的序列，siRNA，反義、微小RNA、aptamer、核酶、任何基因抑制或沉默序列；和要通過慢病毒轉(zhuǎn)錄載體遞送至宿主細(xì)胞的任何序列。
術(shù)語“可表達(dá)的”指所述多核苷酸序列可以在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和翻譯。賦予可表達(dá)性的序列包括例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、核酶附著位點(diǎn)、剪接供體位點(diǎn)和剪接受體位點(diǎn)、多腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄初始化和終止序列等。
當(dāng)可操作地聯(lián)接時(shí)，上述任何啟動(dòng)子均可以用于驅(qū)動(dòng)異源序列的表達(dá)。當(dāng)本發(fā)明的載體編碼細(xì)胞毒性或細(xì)胞靜止多肽(即表達(dá)損害宿主細(xì)胞的產(chǎn)物的基因)時(shí)，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子體系優(yōu)選可操作地聯(lián)接其編碼序列，從而在不需要基因表達(dá)時(shí)，可以調(diào)整其表達(dá)，以使宿主毒性最小化。例如，當(dāng)四環(huán)素從轉(zhuǎn)移細(xì)胞中去除時(shí)，四環(huán)素可調(diào)整的基因表達(dá)體系(GossenandBujard，Proc.Natl.Acad.Sd.，895547-5551，1992)可以用于提供可誘導(dǎo)的基因表達(dá)。
可以用于誘導(dǎo)控制基因表達(dá)的其它體系是利用啟動(dòng)子包含響應(yīng)元件的體系。在這樣的體系中，當(dāng)被啟動(dòng)子包含元件結(jié)合時(shí)，啟動(dòng)子失活。誘導(dǎo)物配體例如以定量的方式開啟啟動(dòng)子，其中誘導(dǎo)物的高濃度與較高的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。例如，RheoSwitch基因調(diào)節(jié)體系具有三種主要成分結(jié)合至靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的所有RheoCept蛋白受體、要調(diào)整的靶基因、和所有有機(jī)小分子配體誘導(dǎo)物。啟動(dòng)子包含受體結(jié)合的特有響應(yīng)元件，只有在誘導(dǎo)物結(jié)合至受體并活化轉(zhuǎn)錄時(shí)，才開啟靶基因表達(dá)。參見例如Kumar等，J.Biol.Chem.，Vol.279，Issue 26，27211-27218，2004年6月25日，″Highly FlexibleLigand Binding Pocket of Ecdysone ReceptorA single amino acid change leadsto discrimination between two groups of nonsteroidal ecdysone agonists″。通過整合可以殺滅載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的基因，可誘導(dǎo)的體系還可以用于提高載體的安全性。在所述應(yīng)用中，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子表達(dá)第二基因，該基因調(diào)整第二可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的表達(dá)，然后該第二可誘導(dǎo)啟動(dòng)子在活化后將表達(dá)“自殺”或安全基因，從而導(dǎo)致殺滅被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。雙重調(diào)整“開關(guān)”的優(yōu)點(diǎn)是自殺或安全基因不會(huì)表達(dá)，直到它第一次被誘導(dǎo)，因此如果具有免疫原性，將不會(huì)表達(dá)所述基因，直到添加至少一種前藥以刺激一種所述可誘導(dǎo)基因的表達(dá)。雙重調(diào)整開關(guān)的其它優(yōu)點(diǎn)是缺少前藥時(shí)的背景表達(dá)將遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于使用單開關(guān)時(shí)的表達(dá)。在表達(dá)自殺或安全基因時(shí)，將需要至少第二前藥來真正殺滅細(xì)胞。非限制性實(shí)例是來自第一可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，然后第一可誘導(dǎo)啟動(dòng)子結(jié)合并強(qiáng)化第二可誘導(dǎo)體系，然后第二可誘導(dǎo)體系表達(dá)任何感興趣的基因，優(yōu)選自殺或安全基因。對(duì)于本身由添加前藥而活化的自殺或安全基因的表達(dá)，這種非限制性實(shí)例并非意味著限制單個(gè)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子體系的用途。而且上述實(shí)例并非意味著限制安全或自殺基因的應(yīng)用，但任何感興趣的基因或序列均可以由這樣的雙重可誘導(dǎo)表達(dá)體系來表達(dá)。
為了提高轉(zhuǎn)移載體的靈活性和產(chǎn)生模塊載體體系，可以進(jìn)一步將多重克隆位點(diǎn)(MCS)包含在載體內(nèi)，以促進(jìn)感興趣的異源序列的插入。所述MCS可促進(jìn)引入任何啟動(dòng)子、單基因、雙基因和任選的基因抑制序列，例如反義、核酶、shRNA、RNAi、微小RNA、aptamer、反式顯性突變蛋白等。優(yōu)選的實(shí)施方案是表達(dá)已經(jīng)被修飾的感興趣的基因，從而使其核苷序列是相對(duì)于細(xì)胞內(nèi)源性基因的簡(jiǎn)并密碼子，另外，相同的載體表達(dá)能夠抑制或沉默感興趣的天然基因的基因抑制或沉默序列。通過表達(dá)已經(jīng)在這些區(qū)域內(nèi)被修飾的感興趣的蛋白質(zhì)，同時(shí)表達(dá)抑制或沉默感興趣的天然未修飾基因表達(dá)的基因抑制或沉默序列，這種方法在理解各種蛋白質(zhì)區(qū)域功能的方面具有巨大用途。這種應(yīng)用還可以用于基因治療法，用于治療疾病。例如，表達(dá)靶向β-血紅蛋白的RNAi的慢病毒載體可以抑制或沉默鐮刀細(xì)胞貧血患者的鐮刀血紅蛋白。相同的慢病毒載體還可以表達(dá)正常的血紅蛋白分子，該分子的密碼子已經(jīng)在RNAi靶向的位點(diǎn)被簡(jiǎn)并。通過這種方法，表達(dá)鐮刀球蛋白的紅細(xì)胞可以抑制鐮刀球蛋白的表達(dá)，同時(shí)表達(dá)天然血紅蛋白并校正基因變異。慢病毒載體將被遞送到干細(xì)胞群內(nèi)，干細(xì)胞群將產(chǎn)生表達(dá)血紅蛋白的紅細(xì)胞，并最終將變成紅細(xì)胞。這種方法可以用于治療各種疾病，包括癌癥、基因病和感染性疾病。
轉(zhuǎn)移載體可以進(jìn)一步包含其它額外的元件，例如以下列順序排列(上述元件)5′LTR、PBS、包裝序列、剪接供體(SD)、復(fù)制起點(diǎn)、任選的中心多嘌呤束(PPT)、RRE、MCS、剪接受體(SA)、和修飾的最少功能的3′LTR?？杀磉_(dá)的異源多核苷酸序列可以插入剪接供體位點(diǎn)和3′LTR的U5區(qū)域之間。轉(zhuǎn)移載體還可以包含一個(gè)或多個(gè)SD(天然或修飾的)位點(diǎn)，如上面描述時(shí)輔助載體所述。
當(dāng)存在于宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)，復(fù)制起點(diǎn)可以用于提高構(gòu)件的復(fù)件數(shù)。SV40ori通常用于該目的，例如在制備SV40大T抗原的細(xì)胞內(nèi)，例如HEK293-T細(xì)胞。
轉(zhuǎn)移載體中可以含有位于MCS 3′的其它元件，包括例如用于穩(wěn)定mRNA的合成內(nèi)含子或其它序列、用于促進(jìn)翻譯來自單個(gè)mRNA的兩個(gè)開放讀取框的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、可選擇的標(biāo)記物、和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(例如多腺苷酸化位點(diǎn))。
可以使用其它元件來促進(jìn)兩個(gè)開放讀取框的表達(dá)。一個(gè)實(shí)例是2A/2B肽序列，它促進(jìn)多肽在預(yù)定位置的裂解(Szymczak等，Nature Biotechnology，22589594，2004)。通過這種方法，可以由來自單個(gè)開放讀取框的慢病毒載體制備由自裂解2A序列分離的兩個(gè)多肽序列。另一個(gè)實(shí)例是使用內(nèi)部核糖體初始化序列或IRES元件，例如兩個(gè)非限制性實(shí)例來自小核糖核酸病毒或口足病病毒的那些。還參見Donnelly等，J.Gen.Virol.，821013-1025，2001。
本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)移載體構(gòu)件，包含例如a)慢病毒5′LTR，其包含可操作地聯(lián)接至編碼天然慢病毒gag和pol(或其片段)的多核苷酸序列的功能性天然啟動(dòng)子，和有效終止由所述天然啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄的異源polyA信號(hào)，其中轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)存在于gag-pol序列起點(diǎn)的下游，和b)可操作地聯(lián)接位于gag-pol序列下游的異源多核苷酸序列的異源啟動(dòng)子。
本發(fā)明還提供了表達(dá)構(gòu)件，包括a)慢病毒5′LTR，其包含可操作地聯(lián)接編碼天然慢病毒gag和pol(或其片段)的多核苷酸序列的功能性天然啟動(dòng)子，和有效終止由所述天然啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄的異源polyA信號(hào)，其中翻譯終止信號(hào)存在于gag-pol序列起點(diǎn)的下游，b)位于gag-pol序列下游的剪接受體，和c)位于gag-pol序列下游的異源多核苷酸序列，gag-pol序列可操作地聯(lián)接至5′LTR啟動(dòng)子。
轉(zhuǎn)移載體可以包含任何上述用于轉(zhuǎn)移載體的元件和/或典型地包含慢病毒轉(zhuǎn)移載體。gag-pol序列不但可以是基本上完全的，其中插入上述轉(zhuǎn)錄終止子，而且還可以利用其部分片段，例如包含包裝序列的片段。終止信號(hào)可以放置在gag-pol編碼序列的任何地方，但優(yōu)選位置是僅產(chǎn)生不完全gag編碼序列拷貝并且不產(chǎn)生pol編碼序列的地方。異源多核苷酸序列可以位于gag-pol序列的初始密碼子的下游，其位點(diǎn)能可操作地聯(lián)接5′LTR啟動(dòng)子?？梢猿Ｒ?guī)確定該位置，例如使用報(bào)告基因來確定哪個(gè)位置有利于可操作地聯(lián)接?？梢詫愒葱蛄胁迦胪耆膅ag-pol編碼序列中，位于轉(zhuǎn)錄終止子的下游?？蛇x擇地，gag-pol序列可以是部分序列，異源序列可以在部分序列和3′轉(zhuǎn)錄終止子后面。
微小RNA、shRNA和其它異源序列的載體表達(dá)的任選模板是如下載體，該載體含有通過修飾5′LTR下游的gag-pol序列而包含完整但無功能的gag-pol序列。這種修飾產(chǎn)生gag-pol多肽ATG起始位置下游的終止密碼子，但不會(huì)干擾用于包裝的順式作用元件。RNAi、微小RNA序列被插入gag-pol序列下游。含有額外的順式元件將穩(wěn)定載體，從而導(dǎo)致提高功能效應(yīng)子序列的滴度和制備。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體表達(dá)靶向至多個(gè)位點(diǎn)的RNAi、微小RNAs或shRNA(反義等)，以提高信號(hào)效應(yīng)子RNAi有效抑制靶序列表達(dá)的可能性。
要使pol序列的翻譯或轉(zhuǎn)錄失活，還可以將多核苷酸插入gag和pol編碼序列之間，例如異源序列、異源表達(dá)盒(例如啟動(dòng)子、編碼序列和polyA)、siRNA、反義、翻譯(例如終止密碼子)和/或轉(zhuǎn)錄終止序列。作為對(duì)終止密碼子的響應(yīng)，蛋白質(zhì)合成或釋放的終止發(fā)生于核糖體上。終止密碼子的實(shí)例包括例如UAG、UAA和UGA。還參見Cassan和Rousset，″UAG readthroughin mammalian cellsEffect of upstream and downstream stop codon contextsreveal different signals，″BMC Molecular Biology 2001，23。
慢病毒包裝體系 本發(fā)明還提供了用于制備慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的慢病毒包裝體系。包裝體系指可用于制備完全包裝的和功能性慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的多種構(gòu)件。它們包括例如上面詳述的慢病毒輔助構(gòu)件和轉(zhuǎn)移構(gòu)件(例如以質(zhì)粒的形式，即雙質(zhì)粒、三質(zhì)?；蚨噘|(zhì)粒體系)。輔助構(gòu)件優(yōu)選包含gag-pol前體和包膜蛋白，但它們各自也可以存在于不同構(gòu)件上。在這種情況下，所述體系可以包括兩種輔助構(gòu)件。
此外，所述體系可以進(jìn)一步包括用于表達(dá)多肽的構(gòu)件，所述多肽反式作用以增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的制備。它們優(yōu)選包括質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有分別與RRE和TAR序列相互作用的可表達(dá)rev和tat多肽。而且，它們可以存在于相同質(zhì)粒上，例如其中每個(gè)包含其自身的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，或者其中編碼序列被IRES序列分離，以使用相同的信使RNA實(shí)現(xiàn)翻譯。例如，所述體系可以包括三種質(zhì)?；驑?gòu)件，包括輔助質(zhì)粒、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和用于表達(dá)rev和/或tat多肽的質(zhì)粒。
優(yōu)選不在轉(zhuǎn)錄體系所含的任何構(gòu)件上表達(dá)通常存在于慢病毒內(nèi)的其它多肽，如附助蛋白質(zhì)nef、vif、vpr和vpu。任選地，來自SIV的vpx蛋白可以由載體質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒或輔助質(zhì)粒之一表達(dá)，或者由質(zhì)粒單獨(dú)或與其它序列組合表達(dá)。vpx蛋白可以促進(jìn)基于HIV或其它慢病毒的載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的提高。
本發(fā)明的構(gòu)件還可以包含復(fù)制起點(diǎn)(例如pUC以利于大腸桿菌內(nèi)的高拷貝復(fù)制和保留)、可選擇的標(biāo)記物、和其它序列，例如用于在細(xì)菌內(nèi)制備輔助構(gòu)件和轉(zhuǎn)移構(gòu)件。此外，可以用標(biāo)記物檢驗(yàn)載體的存在，因此可用于證實(shí)感染和整合。標(biāo)記物基因的存在還確保了只有表達(dá)插入物的那些宿主細(xì)胞的選擇和生長(zhǎng)。典型的選擇基因編碼針對(duì)抗體和其它毒性物質(zhì)如組氨醇、嘌呤霉素、勻霉素、新霉素、甲氨蝶呤等和細(xì)胞表面標(biāo)記物提供耐受的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的輔助載體和轉(zhuǎn)移載體可以排除例如下專利描述或主張的載體及其一個(gè)或多個(gè)元件美國(guó)專利5,994,136、6,165,782和6,428,953(Naldini)；美國(guó)專利6,013,516(Verma)；美國(guó)專利5,665,577和5,981,276(Sodroski)；美國(guó)專利5,817,491(Yee)；美國(guó)專利6,555,107；美國(guó)專利6,627,442；美國(guó)專利U.S.6,051,427(Finer等)；美國(guó)專利6,924,123(Kingsman等)；美國(guó)專利5,591,264(Barber等)。
載體構(gòu)成 進(jìn)一步提供了通過將輔助序列包含在慢病毒載體構(gòu)件內(nèi)，來提高慢病毒載體安全性的機(jī)制。已知包含直接重復(fù)的逆轉(zhuǎn)錄病毒是不穩(wěn)定的，不穩(wěn)定水平直接與直接重復(fù)序列的長(zhǎng)度成比例。大于200個(gè)堿基的直接重復(fù)序列能非常有效地從人逆轉(zhuǎn)錄病毒如人慢病毒切除。通過在載體和輔助序列之間的可能重組位置的上游提供來自不需要的輔助構(gòu)件的輔助序列，可以改進(jìn)慢病毒載體的安全性。例如，將VSV-G序列摻入慢病毒載體內(nèi)是不合適的。優(yōu)選實(shí)施方案是將VSV-G(優(yōu)選不包括poly A位點(diǎn))的3′或遠(yuǎn)端區(qū)域的500-1000個(gè)堿基置于載體內(nèi)，位于潛在重組位點(diǎn)上游的(例如恰好遠(yuǎn)離慢病毒載體包裝位點(diǎn))。如果來自輔助構(gòu)件的VSV-G序列與載體之間發(fā)生重組，則將形成直接重復(fù)序列，從而導(dǎo)致不穩(wěn)定性、和隨后在逆轉(zhuǎn)錄過程中其被從載體刪除。
其它實(shí)施方案是可誘導(dǎo)的制備體系，其包含以可誘導(dǎo)的方式用RNA序列穩(wěn)定的靶蛋白mRNA。例如，作為對(duì)血清的響應(yīng)，3′RhoB未翻譯區(qū)域(UTR)可以穩(wěn)定表達(dá)毒性蛋白質(zhì)或其它感興趣的蛋白質(zhì)的靶RNA。另一個(gè)實(shí)例是將eotaxin 3′未翻譯區(qū)域聯(lián)接至感興趣的靶區(qū)域，其通常具有低半衰期，但將TNF-α和IL-4添加到細(xì)胞中可以穩(wěn)定它。可選擇地，在胰島素存在的情況下，CYP2E1和CYP2B1 mRNA的5′編碼區(qū)域內(nèi)的16 mer序列所含的序列可以將靶RAN去穩(wěn)定。在除去胰島素后，靶RNA被去穩(wěn)定化，蛋白質(zhì)可以被表達(dá)(Trong等Biochem J.2004年12月23)。優(yōu)選的發(fā)明是使用這種去穩(wěn)定序列來制備包裝細(xì)胞系，該細(xì)胞系可以以可誘導(dǎo)的方式制備毒性蛋白質(zhì)如VSV-G。通過將去穩(wěn)定序列與VSV-G或其它蛋白質(zhì)聯(lián)接并且添加或除去穩(wěn)定因子，可以獲得VSV-G或其它蛋白質(zhì)的可誘導(dǎo)表達(dá)。優(yōu)選實(shí)施方案是表達(dá)毒性蛋白質(zhì)的輔助構(gòu)件，該輔助構(gòu)件含有使編碼毒性蛋白質(zhì)的mRNA去穩(wěn)定的RNA序列，但在響應(yīng)一些穩(wěn)定因子時(shí)被穩(wěn)定。進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼聯(lián)接至RNA不穩(wěn)定序列的感興趣的蛋白質(zhì)基因的慢病毒載體，在添加穩(wěn)定mRNA的一些因子后，所述RNA不穩(wěn)定序列可以被穩(wěn)定地表達(dá)。
另一個(gè)實(shí)施方案是慢病毒載體包裝細(xì)胞系，它在可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子體系下表達(dá)靶向VSV-G蛋白質(zhì)的RNAi。在選擇細(xì)胞系的過程中，抗VSV-GRNAi是有活性的，然后被誘導(dǎo)關(guān)閉以啟動(dòng)慢病毒載體的制備。這種可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子在本領(lǐng)域中是已知的，在本申請(qǐng)中也做了描述(Gossen，M.，和Bujard，H.，″Tight Control of Gene Expression in Mammalian Cells byTetracycline-responsive Promoters，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)895547-5551)。其他人已經(jīng)使用可誘導(dǎo)的體系來誘導(dǎo)VSV-G在包裝細(xì)胞系中的表達(dá)(Yang等人，美國(guó)專利5,750,396；Verma，美國(guó)專利6,218,181)。然而，可選擇的控制毒性蛋白質(zhì)如VSV-G的表達(dá)的方法是通過放置基因表達(dá)抑制物從而在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子如四環(huán)素響應(yīng)性啟動(dòng)子的控制下靶向毒性蛋白質(zhì)，但這種特定的可誘導(dǎo)體系是非限制性的，可以使用其它可誘導(dǎo)的體系?；虮磉_(dá)的抑制物可以為反義、RNAi(其中存在幾種變體，上面描述了一些)、核酶或本身無毒的反式顯性突變蛋白質(zhì)。優(yōu)選實(shí)施方案是ddRNAi的可誘導(dǎo)表達(dá)，以在保持細(xì)胞系的過程中抑制VSV-G表達(dá)，然后在載體制備過程中將其“關(guān)閉”。在細(xì)胞生長(zhǎng)的具體相中和載體制備以外的應(yīng)用中，可以使用相同的方法來誘導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如，可以用細(xì)胞周期抑制劑或靶向促進(jìn)細(xì)胞周期或細(xì)胞分化的基因的第二RNAi的表達(dá)來定時(shí)RNAi的表達(dá)。在其它潛在的靶基因中，可以靶向的其它序列是涉及細(xì)胞死亡、分裂、代謝、蛋白合成和代謝、細(xì)胞周期、核酸合成和代謝以及細(xì)胞分化的基因。通過使用內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(IRES)或本領(lǐng)域已知的類似序列，將靶向毒性或有害蛋白質(zhì)的RNAi可操作地與基因聯(lián)接，可以實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)。僅僅通過用緩沖序列分離兩個(gè)RNAi序列，還能將RNAi與第二RNAi聯(lián)接。緩沖序列在本領(lǐng)域中是已知的，它們是不干擾RNAi序列功能的任何序列。
上述方法可以用于制備更安全的輔助載體體系，來制備慢病毒載體，其中RNAi或RNA不穩(wěn)定序列用于防止慢病毒載體的毒性或有害重組。RNAi可以靶向輔助構(gòu)件的開放讀取框架之間的單個(gè)或多個(gè)潛在的連讀區(qū)域。RNA不穩(wěn)定序列(也稱為mRNA-和蛋白質(zhì)去穩(wěn)定元件)，例如PEST序列、P1、P2、cUb和Ub、九聚物UUAUUUAUU(SEQ ID NO1)的1、2或4拷貝(分別為N1、N2和N4)、來自c-fos和c-myc 3′-UTR的富含AU的元件(ARE)。優(yōu)選的實(shí)施方案是雙去穩(wěn)定的構(gòu)件，其由以下構(gòu)成至少一個(gè)RNA去穩(wěn)定元件和至少一個(gè)蛋白質(zhì)去穩(wěn)定元件，該構(gòu)件可以被插入不希望具有連讀的基因之間的區(qū)域。例如，不希望VSV-G包膜和Gag或Pol蛋白位于同一mRNA上，因此靶向輔助構(gòu)件的VSV-G和Gag或Pol開放讀取框架之間(或假定重組區(qū)域)的單個(gè)或多個(gè)區(qū)域的RNAi將是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。優(yōu)選實(shí)施方案是使用shRNAi或ddRNAi靶向輔助構(gòu)件區(qū)域，如果連讀，該區(qū)域可能產(chǎn)生包含Gag和/或Pol和VSV-G包膜蛋白的RNA。通過在不希望發(fā)生連讀RNA和/或蛋白質(zhì)序列的編碼序列之間插入所述不穩(wěn)定元件或降解序列，可以用RNA或蛋白質(zhì)不穩(wěn)定或降解序列防止連讀轉(zhuǎn)錄或連讀蛋白序列。可以將降解序列放在所有開放連讀框架中，因此可以重復(fù)至少三次；因?yàn)樵谧x取或重組事件之前要不必要預(yù)先知道所使用的真實(shí)讀取框架。還提供方法，通過確保gag-pol和vsv-g處于三雙密碼子序列的不同相內(nèi)，來防止膜和gag-pol開放連讀框架產(chǎn)生連讀多蛋白。優(yōu)選vsv-g處于gag-pol的下游和gag-pol密碼子三重序列的1相。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過插入可誘導(dǎo)的RNAi或反義序列，可以提高慢病毒載體的安全性，該序列靶向任何下述序列，如果它與載體重組將有害。例如抗vsv-g序列(即抗包膜多核苷酸序列，如RNAi或反義)可以插入主要剪接受體位點(diǎn)的上游，從而它只在載體制備過程的后期和只在基因組載體RNA中表達(dá)。通過這種方法，將不會(huì)顯著影響載體滴度。然而，如果應(yīng)該接著發(fā)生重組事件，則RNAi或反義序列將結(jié)合VSV序列并破壞重組。因此，輔助載體(或轉(zhuǎn)移載體)可以進(jìn)一步包括可有效抑制所述包膜編碼序列翻譯的反義多核苷酸。反義的設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域中是公知的，可以包括插入載體的完全反義序列，或者足夠與包膜正義RNA雜交并抑制其翻譯的部分反義序列。
另一個(gè)實(shí)施方案是存在于慢病毒載體或輔助表達(dá)構(gòu)件內(nèi)的下述肽序列KETWETWWTE(SEQ ID NO2)。該肽序列是逆轉(zhuǎn)錄酶二聚化的有力抑制物。該肽可以以兩種方式使用用于從包裝體系制備更安全的慢病毒載體，或者用于HIV/AIDS基因療法。對(duì)于制備更安全的包裝體系，將肽插入gag-pol和包膜(如VSV-G)編碼序列之間，只在兩個(gè)開放讀取框架之間連讀時(shí)表達(dá)。然后制備該肽，以通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶二聚化和包裝到病毒顆粒內(nèi)，來抑制載體的存活力。在第二種方式中，它由基于HIV的慢病毒載體表達(dá)，用于治療HIV/AIDS。包含表達(dá)所述肽的載體的細(xì)胞制備缺陷顆粒，該顆粒在用野生型HIV感染時(shí)沒有二聚化的逆轉(zhuǎn)錄酶。這允許用體內(nèi)存在的抗原決定簇刺激免疫響應(yīng)，而不產(chǎn)生感染性病毒。在第三方式中，所述肽可以從慢病毒載體作為第二基因表達(dá)，來防止載體在初始轉(zhuǎn)導(dǎo)后的任何進(jìn)一步代謝。所述肽序列或多個(gè)序列將只在靶細(xì)胞內(nèi)而不在制備過程中表達(dá)，因?yàn)樵谥苽溥^程中所述肽將脫離其在載體內(nèi)的啟動(dòng)子序列，但作為干涉性直接重復(fù)序列將啟動(dòng)子與要表達(dá)的肽序列再連接的結(jié)果，將在靶細(xì)胞中制備肽。相同的方法可以用于表達(dá)毒性蛋白質(zhì)，而不是抑制逆轉(zhuǎn)錄酶二聚化的肽。臨時(shí)性地，如下組織載體源自慢病毒的5′LTR、包裝序列、內(nèi)部啟動(dòng)子、不小于500個(gè)堿基(優(yōu)選但不限于)的序列(包含位于其5′邊界的剪接供體位點(diǎn)和強(qiáng)的剪接受體位點(diǎn))、干擾序列、同樣不小于500個(gè)堿基的序列(不包含剪接供體位點(diǎn)但具有單個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變的剪接受體位點(diǎn)，該位點(diǎn)弱于強(qiáng)剪接受體位點(diǎn))、密碼子初始化序列、肽編碼序列(或毒性蛋白質(zhì))、密碼子停止序列、poly A、和源自慢病毒的3′LTR。
近期，暗示LMO2基因參與白血病的發(fā)生，但顯示該基因在T細(xì)胞發(fā)展過程中不重要(McCormack MP，F(xiàn)orster A，Drynan L，Pannell R，Rabbitts THMoI Cell Biol.2003 Dec；23(24)9003-13)。優(yōu)選實(shí)施方案是表達(dá)反義、核酶、RNAi或抑制物L(fēng)MO2基因表達(dá)的慢病毒載體，來提高慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在治療下述人類疾病基因過程中的安全性，在所述疾病中CD34或血細(xì)胞類型由慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒整合到所述細(xì)胞的染色體內(nèi)。
除了LMO2外，已經(jīng)顯示當(dāng)由HIV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，其它基因?qū)⒈簧险{(diào)或下調(diào)(Zhao等，Gene Therapy，12311-319，2005)。例如，EEF1α在人臍帶靜脈上皮細(xì)胞中上調(diào)了10倍，而Clusterin上調(diào)了3倍。要防止由這些基因的過度表達(dá)引起的任何有害作用，可以構(gòu)建慢病毒載體以表達(dá)針對(duì)過度表達(dá)基因的RNAi，或者編碼和表達(dá)過低表達(dá)基因。通過這種方式，可以提高慢病毒載體的安全性。
此外，詳述了慢病毒載體，在該慢病毒載體中，在慢病毒蛋白的密碼子初始化序列周圍和包含該密碼子初始化序列處使用點(diǎn)刪除、兩堿基刪除、三堿基刪除或大于三堿基刪除來刪除所有密碼子初始化位點(diǎn)。通過這種方式，載體保留著最大殼體化所需的順式作用序列，但不能制備野生型慢病毒。而且，隱藏密碼子初始化位點(diǎn)也被刪除。在優(yōu)選實(shí)施方案中，刪除了密碼子初始化位點(diǎn)周圍的足夠多序列，以產(chǎn)生空間來插入上述基因或RNAi，從而提高載體治療作用或所需非治療作用的強(qiáng)度，例如提高細(xì)胞系的蛋白質(zhì)制備。
其優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞蛋白質(zhì)不是免疫原的，因此它們的過度表達(dá)將不會(huì)導(dǎo)致針對(duì)包含載體而且還沒有被野生型慢病毒感染的細(xì)胞的免疫響應(yīng)。
進(jìn)一步提供了表達(dá)多種基因或RNAi的上述載體，所述多種基因或RNAi導(dǎo)致(1)活化細(xì)胞和提高由所述細(xì)胞制備的缺陷性載體顆粒；(2)刺激免疫響應(yīng)；(3)提高缺陷性顆粒的制備；和/或(4)降低感染性慢病病毒顆顆粒的產(chǎn)生。上面描述了這些基因或RNAi。
轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的制備 本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)導(dǎo)載體及其制備方法。上述具體實(shí)施方案可以短暫地用于宿主細(xì)胞以制備轉(zhuǎn)導(dǎo)載體?？梢杂糜谥苽漭d體的宿主細(xì)胞的實(shí)例包括任何哺乳動(dòng)物或人細(xì)胞系或基本細(xì)胞。非限制性實(shí)例包括例如293、HT1080、Jurkat和SupT1細(xì)胞。其它實(shí)例為CHO、293、Hela、VERO、L929、BHK、NIH 3T3、MRC-5、BAE-1、HEP-G2、NSO、U937、Namalwa、HL60、WEHI 231、YAC1、U266B1、SH-SY5Y、CHO如CHO-K1(CCL-61)、293(如CRL-1573)。
本發(fā)明提供了制備慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的方法，該方法包括例如a)用慢病毒輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，以產(chǎn)生制備細(xì)胞系；和b)在能有效制備慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的制備細(xì)胞。任何合適的轉(zhuǎn)染方法均可以用于載體制備過程，包括電穿孔、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、PEI聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、fecturin或基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染法。優(yōu)選將轉(zhuǎn)導(dǎo)載體分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中，它可以在那里被恢復(fù)和任選地富集或純化。
可以用下述任何方法修飾用于制備轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的細(xì)胞系，以增加載體蛋白質(zhì)的制備，例如通過將RNAi或反義序列引入敲除基因，該敲除基因降低限制載體制備的基因的表達(dá)，或者通過引入增加載體制備的序列。還可以將編碼細(xì)胞或病毒增強(qiáng)子的序列工程化到細(xì)胞系中(例如使用額外的質(zhì)粒載體)，例如皰疹病毒、乙型肝炎病毒，它們作用于HIVLTR以增加病毒產(chǎn)物或細(xì)胞反式激活蛋白質(zhì)的水平。細(xì)胞反式激活蛋白質(zhì)包括例如NF-kB、UV光響應(yīng)因子、和T細(xì)胞活化因子。
可以用組成型DNA常規(guī)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，例如使用電穿孔、磷酸鈣、脂質(zhì)體等，以將DNA引入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞可以被共轉(zhuǎn)化(即使用輔助載體和轉(zhuǎn)移載體)，或者可以在分別的步驟中轉(zhuǎn)換它們，其中每個(gè)步驟包括引入不同的載體。
在能有效制備轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。所述條件包括例如獲得蛋白質(zhì)制備所需的特定環(huán)境。所述環(huán)境包括例如適當(dāng)?shù)木彌_液、氧化劑、還原劑、pH、共因子、溫度、離子濃度、在細(xì)胞使用時(shí)的合適細(xì)胞年齡和/或階段(例如在細(xì)胞周期的特定部分，或處于表達(dá)特定基因的特定階段)、培育條件(包括細(xì)胞介質(zhì)、底物、氧、二氧化碳、葡萄糖和其它糖底物、血清、生長(zhǎng)因子等)。
轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 除了上述包膜修飾外，刺激細(xì)胞以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)不限于表達(dá)細(xì)胞表面上的配體。通過用至少兩種類型的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，可以進(jìn)一步提高體外或體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。第一載體稱為“促進(jìn)載體”，其中所述載體可制備蛋白質(zhì)或配體，它們可刺激靶細(xì)胞更易于接納摻入表達(dá)治療或其它相關(guān)序列的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。為了產(chǎn)生高效的載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，除了用于刺激靶細(xì)胞的蛋白質(zhì)、配體或因子外，促進(jìn)載體可以進(jìn)一步包括安全或自殺基因。這樣，促進(jìn)載體可以表達(dá)轉(zhuǎn)導(dǎo)載體高效轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的蛋白質(zhì)、表面配體、或因子，然后一旦轉(zhuǎn)導(dǎo)載體介導(dǎo)了靶細(xì)胞群的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)，就將它們從靶細(xì)胞混合物中去除。這種方法可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞，其中至少一種促進(jìn)載體可以表達(dá)SCF、TPO和Flt-3配體的組合，各促進(jìn)載體包含安全或自殺基因，一旦將前藥添加到細(xì)胞群中，所述基因就會(huì)減少群內(nèi)的細(xì)胞。安全或自殺基因在本領(lǐng)域中是已知的，在本申請(qǐng)下文中有更詳細(xì)的描述。任選地，促進(jìn)載體可以表達(dá)來自可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的蛋白質(zhì)、因子或配體，該啟動(dòng)子可以單獨(dú)或與安全或自殺基因組合聯(lián)合使用。將可誘導(dǎo)體系與安全或自殺基因分層可以用于提高蛋白質(zhì)/因子/配體/RNA/反義等制備的敏感性和特異性(可誘導(dǎo)體系可以被制成組織特異性的)、和安全或自殺基因的表達(dá)。來自促進(jìn)載體的蛋白質(zhì)/因子/配體/RNAi的表達(dá)可以任選地由組織特異性啟動(dòng)子表達(dá)，以限制促進(jìn)載體向特定細(xì)胞類型表達(dá)序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將促進(jìn)載體添加到具有最小刺激的細(xì)胞群內(nèi)，從而沒有靶細(xì)胞被優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)靶細(xì)胞刺激因子，但仍然用安全或自殺基因標(biāo)記，從而它們可以在后期被去除。在一段時(shí)間后(在添加促進(jìn)載體后至少1小時(shí)到長(zhǎng)達(dá)幾周，但優(yōu)選第二天)，為了高效介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)，將轉(zhuǎn)導(dǎo)載體添加到細(xì)胞中。
細(xì)胞系 本發(fā)明還提供了開發(fā)下述細(xì)胞系的方法，該細(xì)胞系的生長(zhǎng)性增強(qiáng)、對(duì)介質(zhì)所含昂貴因素的依賴減少、能產(chǎn)生更高的蛋白質(zhì)收率、并能產(chǎn)生更高的載體顆粒滴度。例如，近期已經(jīng)報(bào)道HEK 293細(xì)胞可特異性提高細(xì)胞受體的表達(dá)，通過向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加特異性配體，它們顯示出可提高增殖潛能(Allison等，Bioprocess International 31，38-45，2005)。優(yōu)選實(shí)施方案是表達(dá)有關(guān)HEK 293細(xì)胞的配體蛋白質(zhì)的最佳組合的多種慢病毒載體，然后通過高通量方法將細(xì)胞分類，以分離包含多個(gè)慢病毒載體拷貝的HEK 293細(xì)胞克隆。這些細(xì)胞包含HIV載體的組合，所述載體表達(dá)HIV載體內(nèi)所含的多種不同的配體基因拷貝。配體基因可以被密碼子優(yōu)化或添加突變，以進(jìn)一步提高它們的表達(dá)。優(yōu)選的組合包含在最終分離的克隆細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的多個(gè)配體蛋白質(zhì)拷貝，最終分離克隆細(xì)胞然后可能具有多種用途?？梢杂糜诘鞍踪|(zhì)或抗體(包括單克隆、人化、單鏈)制備。還可以用于制備載體，例如但不限于慢病毒載體?？梢詢H僅容易地從這些現(xiàn)在優(yōu)化的細(xì)胞系中制備其它載體如Adeno和Adeno相關(guān)載體、鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、SV40載體和其它載體。在HEK 293細(xì)胞中顯示表達(dá)/活性增加的受體及其配體的列表包括例如AXL受體(gas6)；EGF受體(EGF)、趨化因子受體(fractalline)；PDGF受體，β(PDGF)；IL-15R-α；IL-2R-α；趨化因子受體2(MCP1)；IL-2R、γ；IL-1R-1；CSF-1受體；制瘤素受體；IL-4R；維生素D3受體；neuropilin1(VEGF)；巨噬細(xì)胞刺激性受體1(MSP)；NGF-R；PDGFR-α受體；IL-11-R，例如α；IL-10-R，例如β；FGF-R-4(aFGF)；BMP受體，例如II型(BMP-2)；TGF-R，例如β受體II(TGF-β)；FGF-R-1(bFGF)；趨化因子受體4(SFD1a)；干擾因子γ受體1和2。參見BioProcess International，January 2005.表1，“Growth factor/cytokine receptors expressed by HEK-293”。這些細(xì)胞將具有更高的蛋白質(zhì)和載體制備潛能，將較少依賴于介質(zhì)中包含的配體因子的存在，因?yàn)榧?xì)胞本身將制備這些因子并將它們分泌到介質(zhì)中。
對(duì)于其它細(xì)胞類型如CHO細(xì)胞，其它受體-配體組合可能是重要的。例如認(rèn)為胰島素生長(zhǎng)受體I、胰島素生長(zhǎng)因子和胰島素在細(xì)胞內(nèi)具有抗凋亡活性。可以構(gòu)建多種慢病毒載體，從而將胰島素生長(zhǎng)因子受體(I或II)、胰島素生長(zhǎng)因子(I或II)、胰島素和需要制備的靶蛋白質(zhì)全部包含在載體內(nèi)，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)制備細(xì)胞如CHO細(xì)胞，并選擇適當(dāng)?shù)目寺?，?yōu)選使用高通量方法，以選擇顯示極高靶蛋白制備的克隆。最佳克隆不可以是高度表達(dá)所有工程化的基因或基因表達(dá)抑制物的細(xì)胞，而是各基因的最佳表達(dá)水平，對(duì)于一些可以是低水平表達(dá)。慢病毒載體體系和使用多種慢病毒載體來工程化所述細(xì)胞系的價(jià)值在于，各載體拷貝數(shù)目任意或隨機(jī)分布到用慢病毒載體混合物轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞群內(nèi)，因此通過改變混合物中各載體的量，可以優(yōu)化每個(gè)單獨(dú)的第二基因或抑制序列的拷貝數(shù)目。載體和第二基因或基因抑制序列的優(yōu)選組合是各慢病毒載體表達(dá)需要制備的感興趣的蛋白質(zhì)，此外任選地，表達(dá)通過影響制備細(xì)胞的存活力或一些方面直接或間接提高蛋白質(zhì)收率、或載體收率的至少一種RNAi或基因。然而，為了提高這些第二序列的作用，包含僅表達(dá)第二基因或基因表達(dá)抑制物的至少一種慢病毒載體也是有益的。
可以工程化到慢病毒載體內(nèi)以正面影響胰島素生長(zhǎng)因子受體途徑、細(xì)胞生長(zhǎng)和存活力的其它基因(或所述基因的抑制物)有Akt基因家族成員(Akt1、Akt2、Akt3)、p13K、Ras、Raf、MEK、MAPK p42、MAPK p44、14-3-3蛋白質(zhì)、Bad、和Grb/SOS。為了刺激相關(guān)途徑，結(jié)合至所述途徑適當(dāng)受體的配體可以由慢病毒載體表達(dá)，從而為細(xì)胞提供適當(dāng)?shù)男盘?hào)，來正面影響細(xì)胞的蛋白質(zhì)、載體(不限于慢病毒載體)或疫苗制備。在一些情況下，可能優(yōu)選的是慢病毒載體既表達(dá)受體和也表達(dá)配體，以刺激特定的途徑。還可以構(gòu)建嵌合受體，以產(chǎn)生特定途徑的特定刺激。這樣還可以減少需要在細(xì)胞內(nèi)生成的配體數(shù)目，因?yàn)橐环N配體可以通過嵌合受體刺激多種途徑，嵌合受體具有相同的配體結(jié)構(gòu)區(qū)域但不同的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)域。相反，還可以使用包含不同結(jié)合區(qū)域和相同信號(hào)區(qū)域的嵌合受體來調(diào)整所刺激的途徑類型。嵌合受體在本領(lǐng)域中是已知的，本發(fā)明不僅能用于蛋白質(zhì)、疫苗或載體制備，而且能用于基因療法。其它基因在由慢病毒載體過度表達(dá)(或由RNAi、反義、核酶等抑制)后也可以正面影響細(xì)胞如CHO或293細(xì)胞(非限制性實(shí)例)內(nèi)蛋白質(zhì)、疫苗或載體制備，這些基因有骨巨噬細(xì)胞蛋白質(zhì)-2、PACEsol、磷脂酶D PBK(磷酸肌醇3-激酶)、p70S6K(p70 S6激酶)和ERK(胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶)、CDKN1、CCNB1、CDC20、CDK20、CDK4、CDKN3、CCNC、BMP1、MADH4、GA4、RCA、ATPS、HAT4、GAPDH、SP3、TCEBIL、TFAP2B、SMARCA4、EIF4E、RAB2、D1 S155E、SSI-1、WT1、MYC、TSG101、SHC3、PHB、TCF 12、NHX、E2F4、TAF3C、STAT6、BCL2、NERF-2、POU2F1、NFKB1、EIF4E、BMI1、MYBL2、PIM1、KRAS2、RPA1A、JUNB、ABL1、TIM、SAS、AKT1、CSF3R、BCR、MXI1、TNFAIP6、AIP1、ILK、PTK2、CSK、CSNK2B、GK、PRKCA、MADH2、LIMK1、PIK3CA、PRKCd、PPP6C、細(xì)胞PrP，和參與生長(zhǎng)、代謝、細(xì)胞周期和發(fā)生的其它蛋白質(zhì)類型。優(yōu)選實(shí)施方案是在慢病毒載體包裝或制備細(xì)胞中，表達(dá)靶向細(xì)胞朊病毒蛋白質(zhì)(PrP)、BSE或可以損害細(xì)胞系的其它不利物質(zhì)的RNAi。作為非限制性實(shí)例，進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是表達(dá)細(xì)胞PrP抑制物如抗PrP RNAi的輔助構(gòu)件或包裝細(xì)胞系。相反，所述蛋白質(zhì)可以由RNAi等過度表達(dá)或抑制，以用于疾病如遺傳疾病、HIV/AIDS或癌癥的基因療法。用于治療用途的優(yōu)選慢病毒載體組合物是可正面影響體內(nèi)蛋白質(zhì)制備的單克隆抗體或蛋白質(zhì)(或多種蛋白質(zhì))和至少第二基因(或基因抑制物如RNAi)的表達(dá)。第二基因或基因抑制物不限于用于體內(nèi)蛋白質(zhì)制備的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，而可以是影響免疫響應(yīng)、身體代謝、激素或細(xì)胞因子制備的蛋白質(zhì)。作為對(duì)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子體系或體內(nèi)所含一些因子如蛋白質(zhì)、病毒或在疾病過程中產(chǎn)生的因子的響應(yīng)，可以產(chǎn)生第二基因(至少一種第二基因)或基因抑制物(至少一種第二基因抑制物)。這樣，通過制備第二基因，可以調(diào)整第一蛋白質(zhì)或抗體(例如單克隆、人化、單鏈)的制備。參與人蛋白質(zhì)正確糖基化的蛋白質(zhì)也可以由慢病毒載體在需要制備的蛋白質(zhì)之后表達(dá)。來自某些物種類的糖基化可以引起對(duì)蛋白質(zhì)如單克隆抗體的有害作用，因此表達(dá)產(chǎn)生那些特定糖基化模式的那些酶的抑制物將增加重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物的安全性和效率。例如，源自小鼠和其它哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系糖基化與人糖基化非常相似。然而，幾個(gè)顯著的區(qū)別可能影響產(chǎn)物的質(zhì)量以及生物活性。大多數(shù)鼠源細(xì)胞系(例如NSO細(xì)胞)包含額外的糖基化酶。將該酶稱為α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；它介導(dǎo)將來自α構(gòu)型UDPGal的Gal殘基轉(zhuǎn)移到內(nèi)部和/或暴露的Gal殘基。人具有針對(duì)α-Gal抗原決定簇的抗體。盡管沒有文獻(xiàn)證據(jù)提出rIgG上α-Gal抗原決定簇的存在能對(duì)人產(chǎn)生免疫性，但管理機(jī)構(gòu)可能會(huì)對(duì)包含α-Gal殘基的治療性糖蛋白產(chǎn)生關(guān)注。因此要增強(qiáng)更優(yōu)化的人用蛋白糖基化，可以將靶向鼠α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的RNAi(或類似抑制物)插入慢病毒載體內(nèi)，以產(chǎn)生缺少鼠α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)或鼠α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)水平降低的細(xì)胞系，從而使治療性糖蛋白上不存在α-Gal殘基。另一個(gè)實(shí)例是存在于嚙齒動(dòng)物細(xì)胞如CHO細(xì)胞內(nèi)的CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶。該酶在人體內(nèi)不以活性形式表達(dá)，證據(jù)顯示重組治療糖蛋白中存在Neu5Gc可能導(dǎo)致免疫響應(yīng)。通過包含靶向該酶的RNAi或反義RAN序列，可以工程化慢病毒載體，使之即包含感興趣的蛋白質(zhì)基因，又降低中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系內(nèi)的CMP-Neu5 Ac羥化酶活性從而降低所得糖共軛物的Neu5Gc含量。所述兩個(gè)實(shí)例并不是限制性的，通過抑制不想要的酶/因子，或通過過度表達(dá)所需的酶以提高或優(yōu)化所需蛋白質(zhì)或待制備因子的性質(zhì)，還可以靶向參與糖基化或其它細(xì)胞過程的其它酶。
RNAi還可以靶向潛在的不需要的病毒或隨發(fā)性病毒，或者不希望在用于制備載體、蛋白質(zhì)、因子或疫苗的細(xì)胞系中有復(fù)制的任何病毒或細(xì)菌。例如，可以用RNAi技術(shù)靶向支原體核糖體或信使RNA，以防止支原體和污染物的復(fù)制。這種抑制細(xì)胞內(nèi)隨發(fā)性病毒或細(xì)胞復(fù)制的方法可以延伸用于制備其它病毒載體(例如腺病毒載體、Adeno感興趣的病毒載體、皰疹病毒載體、多瘤病毒基載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體)或疫苗(例如流感、天花、風(fēng)疹、埃博拉病毒、牛痘)。在ncbi.nlm.mh.gov/genomes/VIRUSES/viruses.html可以找到可用所述方法靶向的完整病毒列表。cDNAs和RNAi在載體制備體系中的表達(dá)可以用于進(jìn)一步提高HIV載體制備。例如刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的基因可以提高細(xì)胞的生物合成，并因此導(dǎo)致的更高的細(xì)胞HIV載體制備，和更高的滴度載體?？梢员贿^度表達(dá)的基因是如下基因它們能提高碳水化合物代謝、能量代謝、參與共棲生物的生物降解的蛋白質(zhì)、核酸和氨基酸代謝、mRNA的轉(zhuǎn)錄或可活化細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)或基因如BcL-2的翻譯。此外，通過抑制減緩或阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)的基因、或抑制HIV載體顆粒制備的基因，RNAi技術(shù)可以用于提高載體制備。例如，靶向蛋白質(zhì)的RNAi可以抑制細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞代謝、核酸和氨基酸代謝、mRNA轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)翻譯，從而提高HIV載體顆粒的制備?？梢栽趆ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/找到所述基因及其已知途徑的完整列表?？梢允褂脦追N方法來增加細(xì)胞系制備慢病毒載體。首先，可以將來自人或另一有機(jī)體的cDNA庫(kù)用包裝構(gòu)件共轉(zhuǎn)染或插入HIV載體中，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入包含制備HIV載體顆粒所需基因的包裝細(xì)胞內(nèi)?？梢栽诙嗫啄０逯凶詣?dòng)進(jìn)行所述方法的每個(gè)步驟，以進(jìn)一步提高體系的生產(chǎn)量。
另一個(gè)實(shí)施方案包括靶向慢病毒載體中除要表達(dá)的感興趣基因之外的蛋白酶基因的基因抑制物如RNAi，或者所述蛋白酶基因位于另外的慢病毒載體中，但該另外的慢病毒載體作為混合物添加到細(xì)胞中，從而使細(xì)胞被包含感興趣的基因的載體和表達(dá)RNAi的載體兩者轉(zhuǎn)導(dǎo)，優(yōu)選所述RNAi靶向所述蛋白酶基因或不想要的另一基因。被靶向的蛋白酶可以是任何單個(gè)蛋白酶或蛋白酶的組合，它們可以不利地影響所需蛋白質(zhì)或所需感興趣的因子的制備或純化。蛋白質(zhì)家族及具體的非限制實(shí)例為半胱氨酸蛋白酶如Caspases、組織蛋白酶；鋅蛋白酶(金屬蛋白酶)如羧肽酶、各種底物金屬蛋白酶；絲氨酸蛋白酶如胰島素、糜蛋白酶、和彈性蛋白酶。在細(xì)胞系的蛋白質(zhì)制備相過程中，泛素途徑也可以是有用的靶。可以將RNAi插入靶向泛素、泛素活化酶(E1)、泛素共軛酶(E2)和/或泛素蛋白連接酶(E3)的慢病毒載體中。優(yōu)選靶向泛素途徑的RNAi由可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子表達(dá)，從而僅在特定的時(shí)間段過程中發(fā)生泛素化的抑制。對(duì)靶向泛素的RNAi的誘導(dǎo)并非對(duì)本發(fā)明的限制，慢病毒載體結(jié)構(gòu)性地表達(dá)靶向蛋白酶的RNAi，優(yōu)選參與細(xì)胞死亡的蛋白酶是理想的。所述蛋白酶包括但不限于天冬氨酸鹽特異性半胱氨酸蛋白酶(ASCPs)、絲氨酸蛋白酶如Omi/HtrA2、capases、硫醇蛋白酶的ICE家族如ICE/CED-3蛋白酶、粒酶B?？蛇x擇地，載體可以表達(dá)抑制凋亡的基因如IAP蛋白質(zhì)。所述用于調(diào)整細(xì)胞表現(xiàn)型的方法并不限于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)制備，還可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及用于疫苗和治療目的。這些申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案是由組織特異性啟動(dòng)子表達(dá)第二基因或基因抑制序列。
關(guān)于慢病毒載體內(nèi)存在的任何第二基因，進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案是用氨基酸序列標(biāo)記蛋白質(zhì)，從而允許從包含需要純化的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)混合物中迅速除去該第二蛋白質(zhì)。這樣，通過使用一個(gè)普通氨基酸序列標(biāo)記，可以迅速除去第二蛋白質(zhì)的任何蛋白質(zhì)組合，從而可以迅速純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。目標(biāo)蛋白質(zhì)可以具有不同的標(biāo)記，或者可以根本沒有標(biāo)記，如果目的是制備和純化天然蛋白質(zhì)，則這樣是優(yōu)選的。相反，感興趣的蛋白質(zhì)可以被單獨(dú)標(biāo)記。而且，所述載體可以在體內(nèi)用于人基因療法和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠；并不只限于用于體外體系。
制備多肽的方法 本發(fā)明還提供了利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體(如本文公開的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體)來制備多肽的方法、和所述方法的產(chǎn)物。該方法可以包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟，例如用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，以形成經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，其中所述載體包含編碼感興趣的異源多肽的可表達(dá)形異源多核苷酸；在能有效制備所述感興趣的多肽的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；從所述宿主分離多肽，當(dāng)多肽被分泌到培養(yǎng)基中時(shí)，從培養(yǎng)基中分離。編碼多肽的異源多核苷酸序列可以包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、和/或分泌到介質(zhì)內(nèi)(例如分泌序列)所必需的任何其它序列。根據(jù)本發(fā)明，可以轉(zhuǎn)導(dǎo)任何細(xì)胞系，包括本文所述的任何細(xì)胞系，尤其是例如CHO(例如CHO DG44)和HEK293(例如HEK293F)。
可以常規(guī)制備轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，包括按照本文所述的方法。例如，在能有效制備功能性轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的條件下，可以用輔助質(zhì)粒(包含合適的包膜和gag/pol前體)和包含異源編碼序列的轉(zhuǎn)移載體來轉(zhuǎn)化制備細(xì)胞系?？梢愿鶕?jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)宿主細(xì)胞的能力選擇包膜蛋白質(zhì)，在該宿主細(xì)胞中不會(huì)制備該多肽。對(duì)于制備流感疫苗，優(yōu)選下列細(xì)胞系和相應(yīng)的包膜蛋白質(zhì)，例如293或CHO；VSV-G、ampho、Mokola、和Paramyxoviridae(例如參見互聯(lián)網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/fs jaram.htm)。
宿主細(xì)胞的實(shí)例包括例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞；人細(xì)胞如A2058黑素瘤、C3A肝、G-402腎、C8166T-細(xì)胞、Caco-2克隆、和K562骨髓；CHO；293F、293 FT等，包括上文和下文所述、ATCC網(wǎng)址(www.atcc.org)上存在的其它細(xì)胞系、和其它細(xì)胞來源。
可以表達(dá)任何合適或所需的異源序列，包括例如疫苗、干擾素(α、β、γ、ε)、紅細(xì)胞生成素、因子III、凝結(jié)因子、抗體及其片段(例如包括單鏈、Fab、和人化的)、胰島素、趨化因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、血管生成調(diào)節(jié)因子、凋亡調(diào)節(jié)因子等。可以常規(guī)制備單鏈抗體(例如單鏈可變片段或“scFv”)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體可以用于制備用作疫苗的抗原制劑?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明制備任何合適的抗原，包括獲自朊病毒、病毒、分支桿菌、原生動(dòng)物(例如瘧原蟲(瘧疾))、錐體蟲、細(xì)菌(例如鏈球菌、Neisseria等)的抗原。
可以用包含一個(gè)或多個(gè)異源多核苷酸序列的單一慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，或者使用多個(gè)慢病毒載體，其中每個(gè)載體包含相同或不同的異源多核苷酸序列。例如，通過在單獨(dú)載體上表達(dá)單獨(dú)的亞單位，但用所有載體感染相同的宿主細(xì)胞，從而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生組裝，可以制備多亞單位抗原(包括細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面的多個(gè)亞單位成分)。
疫苗通常包含多種抗原成分，例如源自不同蛋白質(zhì)、和/或源自相同蛋白質(zhì)的不同抗原決定簇。例如，對(duì)抗病毒疾病的疫苗可以包含獲自該病毒的一種或多種多肽序列，其中當(dāng)施用至宿主時(shí)，該疫苗能引發(fā)免疫或保護(hù)響應(yīng)來對(duì)抗病毒。
如上所述，本發(fā)明還可以用于制備多肽多聚體，例如其中制備的抗原制劑包括不止一種多肽。例如，病毒殼體可以由多于一種多肽亞單位組成。用攜帶不同病毒包膜序列的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)可以自組裝成包含多于一種蛋白質(zhì)亞單位的三維結(jié)構(gòu)(例如以其天然構(gòu)型)。該結(jié)構(gòu)可以擁有功能活性，包括抗原活性、酶活性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)活性等。此外，當(dāng)在合適的細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)時(shí)，它們可以被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，從而促進(jìn)純化。例如，當(dāng)使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體將流感N和H衣殼蛋白質(zhì)、和任選的M蛋白質(zhì)(參見下面)引入制備細(xì)胞系內(nèi)時(shí)，可以在細(xì)胞內(nèi)形成空衣殼或病毒樣顆粒(VLP)，然后分泌到培養(yǎng)基內(nèi)?？梢猿Ｒ?guī)分離和純化所述VLP，然后作為流感疫苗施用。VLP是例如自組裝的衣殼，其中不包含實(shí)質(zhì)量(例如沒有)的病毒RNA。VLP優(yōu)選可以引發(fā)免疫響應(yīng)，該響應(yīng)可有效地提供至少一定程度的保護(hù)來對(duì)抗天然的感染性病毒顆粒，或至少引發(fā)針對(duì)其的抗體。
目前，有許多可利用的病毒疫苗，包括用于疾病如麻疹、腮腺炎、肝炎(甲型和乙型)、風(fēng)疹、流感、polio、天花、水痘、腺病毒、日本腦炎、狂犬病、埃博拉等的疫苗。本發(fā)明可以用來制備針對(duì)任何上述疾病的疫苗。
慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)體系是特別有益的，因?yàn)樗鼈兛煽s短開發(fā)和制備有效流感疫苗的時(shí)間，從而使得公共健康部門更快速地對(duì)變化中的流感疾病模式作出反應(yīng)。目前，流感病毒，尤其是A型和B型菌株是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重疾病和死亡的主要原因。在美國(guó)，流感在所有死亡原因中排列第七，導(dǎo)致高數(shù)目的住院(200,000)、工作損失天數(shù)(7千萬)、和受限的活動(dòng)天數(shù)(34億6千萬)，從而造成顯著的經(jīng)濟(jì)影響。參見例如dhhs.gov/nvpo/influenza vaccines.html。流感A病毒的表面抗原頻繁變化，而B型流感病毒的改變不那么頻繁。一種菌株感染后的免疫性不能完全對(duì)抗隨后的抗原變體。結(jié)果是，每年必須設(shè)計(jì)對(duì)抗流感的新疫苗來匹配最可能引起下一次流行的循環(huán)菌株。世界衛(wèi)生組織建立了流感監(jiān)視網(wǎng)絡(luò)，每年推薦流感疫苗組合物。與目前使用的標(biāo)準(zhǔn)雞蛋技術(shù)相比，本發(fā)明的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)體系可顯著降低制備有效疫苗所需的時(shí)間，例如前者可能用八個(gè)月，而使用本文所述的方法只占用例如五周或更少時(shí)間。
可根據(jù)本發(fā)明為其制備疫苗的病毒實(shí)例包括例如正粘病毒、流感病毒A(包括HA和NA蛋白質(zhì)不同的所有菌株，例如(非限制性實(shí)例)H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H7N7和H3N8)；流感B、流感C、thogoto病毒(包括hori、Batken病毒、SiAR 126病毒)、和isavirus(例如感染性大馬哈魚貧血病毒)。其中包括從所有物種分離出或傳播的流感，包括來自無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、人類、非人靈長(zhǎng)類、猴子、豬、牛、和其它家畜、鳥類、馴養(yǎng)家畜如火雞、雞、鵪鶉和鴨、野鳥(包括水生和陸生鳥類)、爬蟲等的分離物。其中還包括已經(jīng)通過例如突變、抗原漂移、抗原轉(zhuǎn)變、重組等改變的已有菌株，尤其是毒性和/或種間傳播(例如人對(duì)人)已經(jīng)增加的菌株。
特別感興趣的是如下流感病毒，它們是動(dòng)物共患病的和/或跨物種的，因?yàn)樗鼈冇袕V闊的宿主范圍，或者因?yàn)樵谑芩拗黧w內(nèi)的重組，和/或由于天然或直接的突變。例如，H5N1(參考病毒上存在的表面抗原亞型，血凝素5型和神經(jīng)氨酸酶1型)是鳥流感A的亞型，它引起亞洲馴養(yǎng)鳥類中的流感暴發(fā)。到2005年11月為止，超過1億2千萬鳥類受感染而死，或者被殺死以防止進(jìn)一步傳播。這種病毒還會(huì)傳感給人類宿主(“鳥流感”)，在人類宿主中具有很高的致命性。
流感抗原制劑(例如疫苗)可以包含天然存在于流感病病毒顆粒中的一種或多種多肽。然而，優(yōu)選不包含能產(chǎn)生天然致病病毒的任何多肽基因。這些多肽基因包括例如血凝素(由HA基本編碼)、神經(jīng)氨酸酶(由NA基因編碼)、核蛋白(由NA基因編碼)、基質(zhì)(M1)蛋白(由M基因編碼)、M2(由M基因編碼)、非結(jié)構(gòu)蛋白(由NS基因編碼)、和聚合酶。天然病病毒顆粒覆蓋在脂質(zhì)雙層中，脂質(zhì)雙層“鑲滿”完整蛋白質(zhì)H和N(“衣殼層”)?；|(zhì)蛋白(M1)在病毒膜下形成蛋白質(zhì)層(“基質(zhì)層”)，這些蛋白質(zhì)涉及病毒組裝、穩(wěn)定性和完整性。參見例如Harris等，Virol.28934-44，2001。M2蛋白質(zhì)是膜蛋白離子通道。本發(fā)明的VLP可以包含H、N、和任選的M1和M2蛋白。所述蛋白的序列在本領(lǐng)域中是已知的，和/或可以在GenBank中鑒定。參見例如Widjaja等J Virol，788771-8779，2004關(guān)于M1和M2序列。
可以將它們分別克隆到不同的轉(zhuǎn)移載體上或位于同一質(zhì)粒上，并用于制備轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以制備多個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，它們分別包含獨(dú)特的流感基因序列(例如編碼H、N、M1，以形成三種不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體)。當(dāng)這些載體在同一宿主細(xì)胞內(nèi)共同表達(dá)時(shí)(例如CHO或293)，就形成可以分泌到介質(zhì)中的自組裝VLP，離心分離它，然后作為疫苗施用。
流感A H5.已經(jīng)鑒別了至少九種H5亞型。已經(jīng)在人群中記載有H5感染，例如目前在亞洲和歐洲流行的HPAI H5N1，它們可以引起嚴(yán)重的疾病或死亡。
流感AH7.已經(jīng)鑒別了至少九種H7亞型。H7感染在人中很少見，但可以在直接接觸過感染鳥類的人中發(fā)生。癥狀包括結(jié)膜炎和/或上呼吸癥狀。H7病毒包括例如H7N2、H7N7和H7N3，已經(jīng)在人類中引起過中等至嚴(yán)重的致命疾病。H亞型在流行病學(xué)上最重要，因?yàn)樗鼈兛刂浦《窘Y(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞的能力，然后病毒會(huì)在那里增殖。N亞型控制著新形成的病毒從細(xì)胞中的釋放。
流感A H9.已經(jīng)鑒別了至少九種H9亞型。極少報(bào)告流感A H9感染人類。然而有報(bào)道當(dāng)感染H9菌株時(shí)兒童具有流感樣癥狀。
本發(fā)明提供了疫苗來對(duì)抗所有鳥流感亞型(例如H和N亞型)，包括已有亞型、其衍生物、及其重組物，例如可以從人傳播至人的亞型和重組物。已經(jīng)描繪了各種分離物，尤其是H5亞型。參見例如Stem-Ramirez，J.Virol，2004，78，4892-4901；Guan等，Proc.Nat l.Acad.Sci，2004，101，81 56-8161。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體可以用于高水平制備異源蛋白，例如當(dāng)所述蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中時(shí)，每毫升未處理的培養(yǎng)基可制備約0.1至約0.3mg/ml或更高的重組異源蛋白。
本發(fā)明還提供了制備抗體的方法。例如，提供了制備單克隆抗體(例如人、小鼠和其它哺乳動(dòng)物類型)的方法，而不需要雜交瘤細(xì)胞或動(dòng)物模型。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，將表達(dá)致瘤蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到前面已經(jīng)用抗原刺激的小鼠外周血B細(xì)胞上。這些載體可有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠細(xì)胞，使得它們成為抗原制備細(xì)胞。在第二個(gè)非限制性實(shí)例中，制備了兩種慢病毒載體，一種表達(dá)抗體重鏈，而第二載體表達(dá)抗體輕鏈。基因的恒定區(qū)域源自人(或如果需要，來自其它物種)的免疫球蛋白基因(例如IgG、IgM或免疫球蛋白的其它類型)?；虻目勺儏^(qū)域被修飾的或退化以產(chǎn)生差異。通過本領(lǐng)域已知的任何合適技術(shù)可以獲得退化序列并克隆到慢病毒載體內(nèi)，以產(chǎn)生表達(dá)重或輕免疫球蛋白分子的慢病毒載體庫(kù)。通過用兩種載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以產(chǎn)生包含重鏈和輕鏈的功能抗體，可以制備抗體。可以篩選經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的并進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞，與抗原結(jié)合，然后可以分離陽性抗原并進(jìn)行多輪親和力成熟。
所述方法的優(yōu)點(diǎn)是以無偏好方法制備了抗體。其它方法如常規(guī)的雜交瘤細(xì)胞和Xenomouse技術(shù)依賴于B細(xì)胞，該B細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)行了克隆選擇并刪除了特定的抗體克隆，因?yàn)樗鼈儗?duì)內(nèi)生的例如小鼠組織有反應(yīng)性。一些這些被刪除的克隆可能作為抗體是有價(jià)值的，因?yàn)樗鼈兛梢耘c人抗原相互反應(yīng)。所述方法的優(yōu)點(diǎn)在于沒有刪除分子抗體克隆，它們?nèi)恳詿o偏倚的方法分析，并且不是完全人化(如果需要人化)的抗體分子。慢病毒載體的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于可以以高度多樣性將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，以在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)制備多種抗體類型。這減少了需要制備形成包含極多樣抗原結(jié)合位置庫(kù)的細(xì)胞數(shù)目。第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是將重鏈基因和輕鏈基因置于不同的慢病毒載體內(nèi)，從而通過以高于1的感染多樣性轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，可以產(chǎn)生額外的多樣性。例如，如果使用MOI為10來將分別表達(dá)重鏈和輕鏈的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)給細(xì)胞，則在各細(xì)胞中制備的抗體組合數(shù)目為100。因此在96孔板中，當(dāng)單個(gè)孔中存在約10,000個(gè)細(xì)胞時(shí)，則在96孔板的單個(gè)孔中，用該方法可以產(chǎn)生的可能變種數(shù)目為1,000,000。因此，按照比例，使用該方法可以產(chǎn)生大量抗體變種。該方法不限于對(duì)于細(xì)胞的各構(gòu)件應(yīng)用MOI為10，如果需要，也可以使用更高的MOI。例如，如果使MOI為100，則各細(xì)胞可以制備10,000個(gè)變種抗體，96孔板的各孔可以制備10,000,000,000個(gè)變種。因此每個(gè)96孔板可以制備1×1012個(gè)變種抗體分子，這些分子可以進(jìn)行篩選對(duì)抗靶抗原，在本領(lǐng)域中有許多已知篩選方法(例如ELISA)。一旦已經(jīng)鑒定特定的孔產(chǎn)生了所需的抗體反應(yīng)，則通過限制稀釋可以克隆抗體，以找到表達(dá)正確抗體的細(xì)胞。一旦鑒定了該克隆，則可以使用PCR克隆出表達(dá)重和輕抗體鏈的載體。然后可以用輔助構(gòu)件轉(zhuǎn)染載體DNA以制備載體?？蛇x擇地，可以直接用輔助構(gòu)件轉(zhuǎn)染該細(xì)胞克隆(PEI、磷酸鈣、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、或本領(lǐng)域已知的其它轉(zhuǎn)染方法)，以制備變種慢病毒載體。然后可以將所制備的載體滴定，然后以較低MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，但細(xì)胞的量更大，以分離制備相關(guān)抗體的克隆。一旦分離了細(xì)胞克隆，就可以通過用較高感染多樣性轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，將抗體制備成較高滴度，相同的方法不限于完整的抗體分子，還可以用于單鏈抗體、抗體片段、噬菌體展示和其它抗體樣分子，所有這些在本領(lǐng)域中均是已知的。除了表達(dá)抗體外，載體還能表達(dá)其它基因以提高單克隆抗體的制備，或者提高它們的收率。這些基因可能是致癌基因，例如ras和myc，也可以使用其它基因，例如抗凋亡基因如Bcl-2。而且，這些載體可以用于從已經(jīng)暴露于抗原的動(dòng)物的血B細(xì)胞中產(chǎn)生單克隆抗體。例如通過使用致癌基因組合或基因沉默RNA，可以將來自暴露于抗原的小鼠的B細(xì)胞轉(zhuǎn)換為骨髓瘤細(xì)胞。這些基因包括例如生長(zhǎng)因子，包括例如雙調(diào)蛋白、B-淋巴細(xì)胞刺激劑、白介素16(IL 16)、胸腺生成素、TRAIL、Apo-2、Pre B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子、表皮分化感興趣的因子1(EDF1)、表皮單核細(xì)胞活化多肽II、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子MIF、天然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子(NKEFA)、骨生成蛋白8(骨生成蛋白2)、骨生成蛋白6、連接因子生長(zhǎng)因子(CTGF)、CGI-149蛋白(神經(jīng)內(nèi)分泌分化因子)、細(xì)胞因子A3(巨噬細(xì)胞炎性蛋白1-α)、Glialblastoma細(xì)胞分化感興趣的蛋白(GBDR1)、肝細(xì)胞瘤源生長(zhǎng)因子、神經(jīng)介肽U-25前體、任何腫瘤基因、致癌基因、原致癌基因或細(xì)胞調(diào)節(jié)基因(可以在condor.bcm.tmc.edu/oncogene中找到)、血管表皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管表皮生長(zhǎng)因子B(VEGF-B)、T-細(xì)胞特異性RANTES前體、胸腺樹枝細(xì)胞源因子1；受體，例如Activin A受體II型(ACVR2)、β-信號(hào)序列受體(SSR2)、CD 14單核細(xì)胞LPS受體、CD36(膠原型1/血小板反應(yīng)蛋白受體)樣2、CD44R(Hermes抗原gp90自導(dǎo)受體)、G蛋白偶聯(lián)受體9、趨化因子C×C受體4、克隆刺激因子2受體β(CSF2RB)、FLT-3受體酪氨酸激酶、類似于暫時(shí)受體的潛在C受體、殺傷細(xì)胞血凝素樣受體亞族B、低密度脂蛋白受體基因、低親和力Fc-γ受體HC、MCP-1受體、單核細(xì)胞化學(xué)趨化物1受體(CCR2)、核受體亞族4、組A、成員1、孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPRC5D、過氧化物酶增殖活化受體γ-Pheromore相關(guān)受體(rat)、后葉加壓素活化的鈣遷移假定受體(Vasopression-activated calcium mobilizing putative receptor)、視黃酸x受體、Toll-樣受體6、透膜活化劑和CAML相互作用劑(TACI)、B細(xì)胞成熟肽(BCMA)、CSF-1受體、干擾素(α、β和γ)受體1(IFNAR1)?？梢哉{(diào)整以增加抗體制備的途徑包括例如泛素/蛋白體；telpmerase；FGFR3；和McI-1?？梢员话邢蛞蕴岣呖贵w制備的其它基因包括下表所列的那些 制備慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的方法 本發(fā)明還提供了使用流通超速離心法(flow-through ultracentrifugation)和高速離心法、和切向流過濾來濃縮和純化慢病毒載體的方法。流通超速離心法在過去已經(jīng)用于純化RNA腫瘤病毒(Toplin等，Applied Microbiology15582-589，1967；Burger等，Journal of the National Cancer Institute 45499-503，1970)。本發(fā)明提供了使用流通超速離心法來純化慢病毒載體的方法。該方法可以包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟。例如，可以使用細(xì)胞工廠或生物反應(yīng)器體系由細(xì)胞制備慢病毒載體?？梢允褂盟矔r(shí)轉(zhuǎn)染體系(見上)，或者還可以類似地使用包裝或制備細(xì)胞系。如果需要，可以在將材料裝載到超速離心機(jī)之前采用預(yù)凈化步驟。可以使用連續(xù)流動(dòng)或批量沉淀進(jìn)行流通超速離心。用于沉淀的材料為例如氯化銫、酒石酸鉀和溴化鉀，它們可產(chǎn)生高密度和低粘度，盡管它們?nèi)渴歉g性的。CsCl經(jīng)常用于工藝開發(fā)，因?yàn)樗a(chǎn)生的廣泛密度梯度(1.0至1.9g/cm3)可以獲得高純度。溴化鉀可以以高密度使用，但能只在升高的溫度下，即25℃下使用，這與一些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性不相容。蔗糖被廣泛使用，因?yàn)槠淞畠r(jià)、無毒和可以形成適于分離大多數(shù)蛋白質(zhì)、亞細(xì)胞部分和完整細(xì)胞的梯度。典型的最大密度為約1.3g/cm3。蔗糖的滲透性可能對(duì)細(xì)胞是有毒的，在這種情況下可以使用復(fù)合梯度材料，例如Nycodenz。梯度內(nèi)可以具有1個(gè)或多個(gè)梯級(jí)。優(yōu)選實(shí)施方案使用梯級(jí)蔗糖梯度。材料的體積優(yōu)選為每輪0.5至約200升，流速優(yōu)選每小時(shí)5至約25升。優(yōu)選操作速度為25,000至40,500rpm，從而產(chǎn)生高至122,000×g的力。轉(zhuǎn)子可以以所需體積部分靜態(tài)卸載。優(yōu)選實(shí)施方案以每份100ml卸載經(jīng)離心的材料。然后可以使用凝膠過濾或尺寸排阻色譜法在所需的緩沖液中交換包含經(jīng)純化的和經(jīng)濃縮的慢病毒載體的分離部分?？蛇x擇地，還可以使用陰離子或陽離子交換色譜，或者進(jìn)行緩沖液交換或進(jìn)一步純化的其它方法。而且，如果需要，還可以將切向流動(dòng)過濾用于緩沖液交換和最后的劑型。切向流動(dòng)過濾(TFF)還可以用作替代步驟進(jìn)行超速或高速離心，其中應(yīng)該進(jìn)行兩步驟TFF程序。第一步驟將減少載體上清液的體積，而第二步驟將用于緩沖液交換、最后配方和更進(jìn)一步濃縮材料。TFF膜的膜尺寸應(yīng)為100至500千道爾頓，其中TFF第一步驟的優(yōu)選膜尺寸應(yīng)為500千道爾頓，而第二TFF的優(yōu)選膜尺寸應(yīng)為300至500千道爾頓。最后的緩沖液應(yīng)包含允許載體長(zhǎng)期貯存的材料。
本發(fā)明還提供了方法來濃縮和純化慢病毒載體。該方法使用包含粘附細(xì)胞的細(xì)胞工廠，或者包含懸浮細(xì)胞的生物反應(yīng)器，用載體和輔助構(gòu)件將它們轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)以產(chǎn)生慢病毒載體。生物反應(yīng)器的非限制性實(shí)例包括Wave生物反應(yīng)器體系和Xcellerex生物反應(yīng)器。兩種都是拋棄型體系。然而也可以使用非拋棄型體系。構(gòu)件可以是本文所述的那些，以及其它慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體?？蛇x擇地，可以制備細(xì)胞系以產(chǎn)生慢病毒載體，而不需要轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后，可以收獲并過濾慢病毒載體，以除去顆粒，然后使用連續(xù)流動(dòng)高速或超速離心機(jī)來離心。優(yōu)選實(shí)施方案使用高速連續(xù)流動(dòng)裝置如JCF-A帶和具有高速離心機(jī)的連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)子。還優(yōu)選將Contifuge Stratus離心機(jī)用于中等規(guī)模的慢病毒載體制備。還優(yōu)選任何連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)，其中離心速度大于5,000×g RCF并小于26,000×g RCF。優(yōu)選地，連續(xù)流動(dòng)離心力為約10,500×g至23,500×g RCF，旋轉(zhuǎn)時(shí)間為20小時(shí)至4小時(shí)，將較長(zhǎng)的離心時(shí)間用于較慢的離心力?？梢栽诟芗牧系囊r墊(其非限制性實(shí)例為蔗糖，但可以使用其它試劑來形成襯墊，這在本領(lǐng)域中是公知的)上離心慢病毒載體，從而使慢病毒載體不會(huì)形成不可過濾的聚集物，聚集物是直接離心載體所面臨的問題，會(huì)導(dǎo)致病毒載體球。連續(xù)流動(dòng)離心到襯墊上使得載體避免形成大聚集物，并仍可以從產(chǎn)生慢病毒載體的大體積轉(zhuǎn)染材料中將載體濃縮至高水平。而且，可以使用第二層較小密度的蔗糖來聯(lián)合慢病毒載體制備物。連續(xù)流速離心機(jī)的流速優(yōu)選為1至100ml/分鐘，但也可以使用更高和更低的流速。調(diào)整流速以提供充足的時(shí)間使載體進(jìn)入離心機(jī)核心，從而沒有顯著量的載體由于高流速而損失。如果需要更高的流速，可以然后將離開連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)的材料再循環(huán)，使它第二次經(jīng)過離心機(jī)。在使用連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)濃縮載體后，可以使用切向流動(dòng)過濾(TFF)進(jìn)一步濃縮載體，或者TFF體系可以只用于緩沖液交換。TFF體系的非限制性實(shí)例是由GF-Healthcare制備的Xampler過濾器體系。優(yōu)選的過濾器是MW限度為500,000MW或更少的過濾器。優(yōu)選地，使用MW限度為300,000MW的過濾器。還可以使用100,000MW限度的過濾器。對(duì)于更大的體積，可以使用更大的過濾器，本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于發(fā)現(xiàn)在最后填充載體制備物之前用于該最后緩沖液交換和/或濃縮步驟的正確的TFF體系。最后的填充制備物可以包含能穩(wěn)定載體的因子-糖是常用的，也是本領(lǐng)域中已知的。
疫苗和HIV治療 已知腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)腫瘤特異性抗原。相信這些抗原具有差的免疫原性，主要因?yàn)樗鼈兇碇掳┗蚧蛲ǔ４嬖谟谒拗黧w內(nèi)的其它細(xì)胞基因的基因產(chǎn)物，因此不能清楚地被識(shí)別為非自身。盡管許多研究者已經(jīng)試圖靶向針對(duì)來自各種腫瘤特異性抗原的抗原決定簇的免疫響應(yīng)，但沒有人成功地激發(fā)足夠的體內(nèi)腫瘤免疫性。在過去30年中，記載有數(shù)千患者施用腫瘤細(xì)胞抗原作為疫苗制劑，但這些努力的結(jié)果證明腫瘤細(xì)胞免疫不能提供合理的基礎(chǔ)來設(shè)計(jì)或構(gòu)建有效的疫苗。即使當(dāng)患者表達(dá)腫瘤特異性抗體或細(xì)胞毒性T細(xì)胞時(shí)，這種免疫響應(yīng)也與相關(guān)疾病的抑制無關(guān)。免疫體系保護(hù)宿主的這種失敗可能是由于免疫原性差的腫瘤抗原的表達(dá)，或者是由于各種腫瘤細(xì)胞特異性抗原的異源表達(dá)。適宜地呈遞腫瘤抗原激發(fā)以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的免疫響應(yīng)仍然是開發(fā)有交癌癥疫苗的關(guān)鍵問題。而且，非慢病毒載體不會(huì)優(yōu)化這種呈遞，抗原表達(dá)的數(shù)量和持續(xù)時(shí)間也很重要。仍然極為需要方法以下述方式向個(gè)體的免疫體系呈遞免疫原性差的作為“自身”抗原的腫瘤抗原，該呈遞方式可激發(fā)足夠有力的免疫響應(yīng)來抑制受體體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明通過提供包含趨化因子和腫瘤抗原的融合蛋白，克服了本領(lǐng)域前述的限制和缺點(diǎn)，該蛋白可以產(chǎn)生體內(nèi)免疫響應(yīng)，從而導(dǎo)致抑制腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明還通過提供包含趨化因子和HIV抗原的融合蛋白，克服了前述HIV疫苗開發(fā)領(lǐng)域的缺點(diǎn)，該蛋白能有效作為疫苗來治療或防止HIV感染。還提供了構(gòu)造更安全的慢病毒載體的方法、純化慢病毒載體的方法和使用慢病毒載體檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法。
本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防個(gè)體HIV感染的方法，該方法包括向個(gè)體施用源自下列蛋白質(zhì)的下列肽的任何組合趨化因子、自殺基因、HIV蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、腫瘤抗原、或影響細(xì)胞產(chǎn)生HIV的任何細(xì)胞基因(通過過度表達(dá)細(xì)胞基因或通過RNAi抑制其表達(dá)等)，它們均由慢病毒載體提供和表達(dá)。
另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是用于治療的慢病毒載體，它表達(dá)天然或融合多肽，所述多肽包含任何單獨(dú)或組合的人趨化因子和病毒或細(xì)胞抗原(例如HIV、白喉毒素抗原)、趨化因子(例如IP-10、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP1、RANTES、SDF-1、MIG和/或MDC)或促凋亡蛋白質(zhì)、自殺基因蛋白質(zhì)或促進(jìn)炎性響應(yīng)的蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明提供了在個(gè)體體內(nèi)產(chǎn)生免疫響應(yīng)的方法，該方法包括向個(gè)體施用本發(fā)明的任何單獨(dú)或融合多肽，包括趨化因子和人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、或趨化因子、促凋亡基因、自殺基因和腫瘤抗原，作為蛋白質(zhì)或編碼由慢病毒載體表達(dá)的單獨(dú)或融合多肽的核酸。還提供了治療個(gè)體癌癥的方法，該方法包括向個(gè)體施用表達(dá)本發(fā)明的任何單獨(dú)或融合多肽的慢病毒載體，包括趨化因子和腫瘤抗原，作為蛋白質(zhì)或編碼融合多肽的核酸。
還提供了治療或預(yù)防個(gè)體HIV感染的方法，該方法包括向個(gè)體施用源自下列蛋白質(zhì)的下列肽的任何組合趨化因子、自殺基因、HIV蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面蛋白、腫瘤抗原、或影響細(xì)胞產(chǎn)生HIV的任何細(xì)胞基因(通過過度表達(dá)細(xì)胞基因或由RNAi抑制其表達(dá)等)，它們均由慢病毒載體提供和表達(dá)。
本發(fā)明還提供了HIV載體，當(dāng)用感染了HIV個(gè)體體內(nèi)的感染性或缺陷性HIV顆粒感染HIV載體細(xì)胞時(shí)，所述HIV載體可以產(chǎn)生HIV顆粒。所述載體包含抑制或過度表達(dá)細(xì)胞宿主因子的下列天然或突變形式的序列，從而導(dǎo)致病毒顆粒與野生型HIV顆粒相比致病性較少，或者優(yōu)選是無致病性的。它們包括例如APOBEC家族成員(APOBEC1、2、3A、3B、3C、3D、3E、3F、CEM15/Apobec-3G)、AID、ACF、Tsg101、Vps 4、Vps 28、Vps 37、Vps 32、ESCRT-1、ESCRT-2、ESCRT-3、TRBP-1、Sam68、包含KH區(qū)域的蛋白質(zhì)、參與病毒顆粒二聚化和成熟的細(xì)胞蛋白質(zhì)、Hck、胞內(nèi)細(xì)胞粘著分子(ICAMs)例如ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、ICAM-4和ICAM-5；白細(xì)胞功能相關(guān)的抗原-1(LFA-1)和巨噬細(xì)胞抗原1(Mac-1)、Trim5-α、Trim1、人CRM1、細(xì)胞朊病毒蛋白(PrP)、E2F-4、親環(huán)蛋白A、成員或JAK/STAT途徑、TIP30、人Rev-相互作用蛋白質(zhì)(hRIP)、糖基磷-脂酰基肌糖(GPI)-錨定蛋白、CD4、CD36、PRP4、HSP27、HSP70、p38 MAPK、任何絲裂原活化蛋白(MAP)激酶超家族的成員、Tip 110、TGFβ-1、MCP-1、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)、IRF-1、IRF-2、IRF-3、IRF-4、IRF-5、IRF-6、IRF-7；RA5、SDF-1α、CCR5、CXCR4、TNF受體超家族(TNFRSF)、CD40配體(CD40L，也稱為CD 154或TNFSF5)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、TNF-α、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、干細(xì)胞因子、flk2/flt3配體和異源核蛋白A2。慢病毒載體可以包含本專利申請(qǐng)其它地方討論的任何基因組合或基因表達(dá)抑制物。慢病毒載體內(nèi)表達(dá)的優(yōu)選基因組合是IFN-α和IFN-β。更優(yōu)選的組合是表達(dá)IFN-α和IFN-β的慢病毒載體，由IRES元件或移碼突變分離，允許從相同的mRNA翻譯兩種基因。
除去細(xì)胞的方法 本發(fā)明還提供了利用慢病毒載體去除(例如凈化)細(xì)胞(例如體內(nèi)或體外)的方法。所述慢病毒載體可以包含細(xì)胞毒性、細(xì)胞靜止、或自殺基因，當(dāng)在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，它們可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
例如，本發(fā)明提供了選擇性感染和整合到腫瘤細(xì)胞內(nèi)而不是正常細(xì)胞內(nèi)的慢病毒載體，尤其是極難用任何載體、包括慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血干細(xì)胞。事實(shí)上，只有在特定干細(xì)胞因子存在的情況下，才能用多次轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)大于85％功效的造血干細(xì)胞有效轉(zhuǎn)導(dǎo)(Davis等，Blood，2004)。只能在用特定因子刺激T細(xì)胞后才能獲得大于90％的T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)(Humeau等2004)。因此，本發(fā)明使用慢病毒載體將基因選擇性遞送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)而不是正常細(xì)胞內(nèi)，以從造血細(xì)胞(和其它細(xì)胞)移植物中清除腫瘤細(xì)胞，從而減少疾病復(fù)發(fā)的可能性。基因可以是“自殺基因”，即可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因或刺激免疫響應(yīng)的基因?？蛇x擇地，可以選擇其產(chǎn)物提供條件性殺滅機(jī)理的基因或序列來分化細(xì)胞。通過這種方式，表達(dá)特定蛋白質(zhì)然后進(jìn)行后續(xù)處理可以有效地殺滅腫瘤細(xì)胞。后續(xù)處理包括化學(xué)和物理處理。用于化學(xué)處理的試劑包括使用酶或與基因產(chǎn)物反應(yīng)以殺滅宿主細(xì)胞的其它化合物。物理處理包括使細(xì)胞經(jīng)受輻射、UV光等。該方法具體使用表達(dá)感興趣的基因的慢病毒載體，該基因可以凈化或刺激免疫響應(yīng)來對(duì)抗污染性細(xì)胞(包括但不限于可能妨礙制備或可能引起有害事件的細(xì)胞或腫瘤或惡性細(xì)胞、前惡性細(xì)胞、原癌細(xì)胞、致瘤性細(xì)胞或任何異常細(xì)胞類型)，該方法包括(1)在一段時(shí)間內(nèi)，將載體添加到要需要清除污染細(xì)胞的細(xì)胞制劑中，導(dǎo)致超過99％的污染細(xì)胞被慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中移植物內(nèi)的正常細(xì)胞被慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率小于污染細(xì)胞的頻率；和(2)將細(xì)胞制劑施用至需要該細(xì)胞制劑的患者?？蛇x擇地洗滌細(xì)胞以除去過量的載體，但這不是必需的。在腫瘤細(xì)胞更特異表達(dá)或具有順式作用序列的啟動(dòng)子存在下，載體可以額外地表達(dá)慢病毒載體所含的“感興趣的凈化基因(GOI)”，增加致瘤細(xì)胞而不是正常細(xì)胞內(nèi)GOI mRNA的穩(wěn)定性，或者順式作用序列促進(jìn)正常細(xì)胞內(nèi)而不是致瘤細(xì)胞內(nèi)GOI mRNA不穩(wěn)定性的。其它啟動(dòng)子體系也可以順序應(yīng)用，例如可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子體系。其實(shí)例為四環(huán)素可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子體系。
有幾種基因類型可以用于本發(fā)明。例如，單純皰疹病毒1型(HSV-I)，胸苷激酶(TK)基因提供了這種條件性殺滅機(jī)理來分化細(xì)胞。使用HSV-1-TK的選擇性優(yōu)點(diǎn)源自如下事實(shí)即與哺乳動(dòng)物TK相比，該酶對(duì)某些核苷類似物具有更高的親和力，例如無環(huán)鳥苷、更昔洛韋和FIAU(McLaren at al.，nHerpes Virus and Virus Chemotherapy,R.Kono，ed.，第57-61頁，Amsterdam，Elsevier(1985))。這些藥物轉(zhuǎn)化為核苷樣前體，摻入復(fù)制細(xì)胞的DNA中，從而破壞基因組的完整性，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。幾項(xiàng)研究已經(jīng)成功地將TK的條件性毒性用于轉(zhuǎn)基因小鼠的開發(fā)研究(Borrelli等，Nature339538-541(1983)；Heyman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA862698-2702(1989))，作為針對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的非同源重組事件的可選擇標(biāo)記物(Capecchi，M.R.，Trends in Genetics 5(3)70-76(1989))，用于殺滅細(xì)胞培養(yǎng)的野生型皰疹病毒(Corey和Spear，N.Engl.J.Med.314686-691(1986)；Corey和Spear，N.Engl.J.Med.314749-756(1986))，和選擇缺少TK活性的皰疹病毒突變物(Coen等，Science 23453-59(1986))。可利用其它“自殺基因”(例如http://www.zgene.net/technology.html)，使用TK并不是限制性實(shí)例。還可以組合或單獨(dú)使用凋亡基因。實(shí)例包括TNF配體家族LTA(TNF-b)、LTB(LT-b)、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配體)、TNFSF5(CD40配體)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配體)、TNFSF8(CD30配體)、TNFSF9(4-1BB配體)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(Apo3L)、TNFSF13(APRIL)、TNFSF14(HVEM-L)。TNF受體家族LTBR、TNFRSF1A(TNFR1)、TNFRSF1B(TNFR2)、TNFRSF4(OX40)、TNFRSF5(CD40)、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB)、TNFRSF10A(DR4)、TNFRSF10B(DR5)、TNFRSF10C(DcR1)、TNFRSF10D(DcR2)、TNFRSF12(DR3)、TNFRSF14(HVEM)。Bcl-2家族BAD、BAK1、BAX、BCL2、BCL2A1(bfl-1)、BCL2L1(bcl-x)、BCL2L11(bim-樣蛋白質(zhì))、BCL2L2(bcl-w)、BIK、BLK、BNIP3(nip3)、BOK(Mtd)、HRK、MCL-1。Caspase家族CASP1、CASP2、CASP3、CASP4、CASP5、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、CASP13、CASP14。IAP家族BIRC1(NIAP)、BIRC2(IAP2)、BIRC3(IAP1)、BIRC4(XIAP)、BIRC5(Survivin)、BIRC6(Bruce)。TRAF家族TANK(1-TRAF)、TRAF1、TRAF2、TRAF3(CRAF1)、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRIP。CARD家族APAF1、ASC、BCL10(HuE10)、NOD1(CARD4)、NOL3(Nop30)、RIPK2(CARDIAC)。死亡結(jié)構(gòu)域家族CRADD、DAPK2、FADD、MYD88、RIPK1。死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域家族CASP8AP2(FLASH)、CFLAR(CASPER)、FADD、LOC51283(BAR)。CIDE結(jié)構(gòu)域家族CIDEA、CIDEB、DFFA、DFFB。p53和ATM途徑ATM、CHEK1(chk1)、CHEK2(chk2、Rad53)、GADD45A、MDM2、P63、RPA3、TP53(p53)。
免疫原性或細(xì)胞因子基因也可以單獨(dú)使用或與自殺基因或凋亡基因組合使用。所述基因的實(shí)例為接頭蛋白FADD、IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6。細(xì)胞表面受體ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3F、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA4、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10。趨化因子和受體BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1。細(xì)胞因子和受體AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、C19orf10(IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFB1、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2、RNF110(ZNF144)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白CABIN1、CALM1、CALM2、CALM3、CAMK2B、CAMK4、CDC25A、CDKN1A、CDKN2B、CHUK、CSNK2A1、CSNK2B、ENG、EVI1、GSK3A、GSK3B、IKBKB、IKBKE、IKBKG、IL18BP、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、KPNA5、KPNB3、LAG3、LAT、MADH1、MADH2、MADH3、MADH4、MADH5、MADH6、MADH7、MADH9、MAP2K4、MAP2K7、MAP3K1、MAP3K2、MAP3K7、MAP3K7IP1、MAP3K14、MAPK3、MAPK8、MAPK9、MAPK10、MAPK14、MHC2TA、NAP4、NBL1、NMA、NUP214、PAK1、PLAU、PPP3CB、PPP3CC、PPP3R1、PTPRC、RIPK1、SERPINE1、SLA、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、TBK1、TIMP1、TRPV6、TSC22、TYK2、VAV1、VAV2、VAV3、XPO5。響應(yīng)基因和其它相關(guān)基因AGT、BAD、BCL2、BCL3、BF、C3、CHRD、CKTSF1B1、COL1A1、COL1A2、COL3A1、FST、HRAS、ICAM1、ICAM2、ICAM3、ICAM4、ICAM5、IGFBP3、IGSF6、ITGB5、ITGB7、IVL、MGC27165、MYF5、NCAM1、NOS2A、ORM1、PIN1、RFX1、RFX2、RFX3、RFX4、RFX5、RFXANK、RFXAP、RFXDC1、SAA1、SELE、SELL、SELPLG、SFN、TGIF、VCAM。轉(zhuǎn)錄因子ATF2、CEBPB、CREB1、CREBBP、EGR1、EGR2、EGR3、ELK1、ELK3、EP300、FKBP1B、FLJ14639(NIP45)、FOS、FOSL1、FOSL2、FOXP3、GATA3、GATA4、GRLF1、ICOS、IRF1、JUN、JUNB、JUND、MAF、MAX、MEF2A、MEF2B、MEF2D、MYC、NFAT5、NFATC1、NFATC2、NFATC3、NFATC4、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NFKBIB、NFKBIE、NFKBIL1、NFKBIL2、NFRKB、RAF1、REL、RELA、RELB、RUNX1、RUNX2、SP1、SP3、SRF、STAT1、STAT4、STAT6、TFCP2、YY1。
自殺基因療法還可以稱為前藥活化基因療法，其可以用于提高靶細(xì)胞對(duì)前藥誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。使用慢病毒載體引入自殺基因使得腫瘤細(xì)胞可以局部活化前藥，從而限制向靶組織產(chǎn)生有毒的藥物代謝物。自殺基因療法體系包括例如HSV-tk與抗病毒前藥更昔洛韋組合，和細(xì)菌基因胞核嘧啶脫氨酶與前藥5-氟胞核嘧啶組合。還可以使用細(xì)胞色素P-450酶，它可以與各種抗癌前藥組合，例如環(huán)磷酰胺及其異構(gòu)體ifosfamide。
過去曾試圖使用載體來治療移植物抗宿主(“GVH”)病，該病是異源移植的副作用，具有很高的死亡率。這些努力都失敗了，因?yàn)榧炔荒軐?shí)現(xiàn)供體淋巴細(xì)胞的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，也不能有效靶向引起移植物抗宿主病的細(xì)胞。本發(fā)明提供使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體來解決上述缺陷。本發(fā)明提供了新策略來治療異源移植過程中的移植物抗宿主病(GVHD)。目前，異源移植導(dǎo)致由移植物抗宿主病引起的高死亡率，其中來自供體的淋巴細(xì)胞將宿主識(shí)別為外來物，并開始破壞正常宿主組織。盡管來自供體的淋巴細(xì)胞可以有效破壞腫瘤細(xì)胞，但GVHD副作用阻礙將異源和無關(guān)供體移植作為治療各種癌癥形式的手段。本方法使用慢病毒載體來治療或防止移植物抗宿主病。該方法使用表達(dá)自殺基因的慢病毒載體，該自殺基因用于轉(zhuǎn)導(dǎo)供體淋巴細(xì)胞群。
其它策略包括表達(dá)凋亡基因或表達(dá)由可誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)的存活因子的RNAi。所述有效負(fù)荷是非限制性實(shí)例，任何基因或基因沉默序列都可以用于調(diào)節(jié)異源T細(xì)胞的功能，而不是在將來簡(jiǎn)單殺滅相同位置的細(xì)胞。在用表達(dá)自殺基因或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的基因或RNAi的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)之前或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，該方法用抗CD3和抗CD28抗體(或其它刺激物，如促有絲分裂素、細(xì)胞因子、其它因子)刺激供體淋巴細(xì)胞。刺激將允許慢病毒載體更高地和甚至完全地轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞群。因此，一旦轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞被輸注到患者體內(nèi)，則如果異源移植物引起GVHD，則可以用前藥治療，以誘導(dǎo)細(xì)胞殺滅介導(dǎo)GVHD的淋巴細(xì)胞。前藥的水平還可以以劑量依賴的方式降低GVHD，從而可以保持移植物對(duì)抗腫瘤的效果。
由于同種活性T細(xì)胞是GVHD的調(diào)節(jié)物，所以處理淋巴細(xì)胞或外周血細(xì)胞群的優(yōu)選方法是用載體更特異性地靶向這些細(xì)胞。由于已知慢病毒載體能更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)活性更高的細(xì)胞，所以如果相對(duì)于與非同源活性T細(xì)胞更選擇性地活化同源活性T細(xì)胞，則慢病毒載體將更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)同源活性T細(xì)胞。可以如下特異性活化異源活性T細(xì)胞將供體淋巴細(xì)胞(或白細(xì)胞、或CD4 T細(xì)胞)與受者細(xì)胞(白細(xì)胞、紅細(xì)胞或其它受體細(xì)胞；細(xì)胞可以被輻射或處理以殺滅或防止細(xì)胞生長(zhǎng))或受者細(xì)胞提取物混合，同時(shí)以適當(dāng)?shù)腗OI(感染復(fù)數(shù))將載體添加到細(xì)胞群中，以選擇性地轉(zhuǎn)導(dǎo)異源活性細(xì)胞而不轉(zhuǎn)導(dǎo)不被混合細(xì)胞刺激的非異源活性細(xì)胞。優(yōu)選方法是將受者的紅細(xì)胞與供者淋巴細(xì)胞混合，因?yàn)檫@些細(xì)胞表達(dá)MHC抗原，包括次要MHC抗原(Zimring等，Blood.2006 Jan 1；107(1)187-9)，并且它們不能用載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，因?yàn)樗鼈兪菬o核的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定該MOI，其中可以用表達(dá)報(bào)告子的載體確定哪種細(xì)胞已經(jīng)被轉(zhuǎn)導(dǎo)。在將紅血細(xì)胞與供者淋巴細(xì)胞混合并用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后，將淋巴細(xì)胞洗滌并優(yōu)選與紅血細(xì)胞分離，然后輸注至患者體內(nèi)?？赏ㄟ^幾種技術(shù)將紅血細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分離，這些技術(shù)包括球分離或ficoll梯度離心，這在本領(lǐng)域中是已知的。將分離的紅血細(xì)胞而非其它細(xì)胞類型用于刺激的優(yōu)點(diǎn)在于(1)它們易于獲得(2)它們?cè)诖碳ず笠子诔?3)它們不會(huì)生長(zhǎng)，因此不會(huì)持續(xù)刺激供者淋巴細(xì)胞，和(4)它們不會(huì)由載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異源活性細(xì)胞可以在輸注前在體外被破壞，或者在輸注至患者后被破壞?？蛇x擇地，可以用細(xì)胞提取物或肽刺激細(xì)胞，細(xì)胞提取物或肽是患者特異性的，源自患者的特定次要或主要組織相容性抗原復(fù)合物(MHC)基因。表達(dá)特異性MHC基因的提取物或肽/蛋白質(zhì)的制備在本領(lǐng)域中是已知的。優(yōu)選地，提取物源自非腫瘤組織，從而更特異性地轉(zhuǎn)導(dǎo)同種特異性細(xì)胞而不是與疾病相關(guān)抗原特異性的細(xì)胞。將提取物或肽/蛋白質(zhì)脈沖加入供者細(xì)胞，以刺激異源活性細(xì)胞，使慢病毒載體產(chǎn)生有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后，可以將細(xì)胞洗滌，然后冷凍儲(chǔ)藏或輸注給患者?？梢詢?yōu)選在IL-2中短期培養(yǎng)細(xì)胞，然后輸注給患者。
用于T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的替代方法使用混合淋巴細(xì)胞群中的可溶性CD3、IL-2(或兩種可溶因子的組合，或者一種可溶因子和一種固定因子或配體的組合)。在可溶CD3和IL-2存在的情況下，將慢病毒載體添加到淋巴細(xì)胞群中，特別不能加到純化的CD4 T細(xì)胞群中?？蛇x擇地，可由輔助載體表達(dá)可溶性CD3和IL-2，如本申請(qǐng)其它地方所述?；旌狭馨图?xì)胞環(huán)境的作用是刺激除CD3和IL-2以外的細(xì)胞，從而當(dāng)慢病毒載體添加到細(xì)胞中時(shí)，可以高度有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的方法可廣泛用于各種用途，包括但不限于治療遺傳性、感染性和致瘤性疾病。
而且，細(xì)胞中任選地?fù)饺胱詺⒒蚧虬踩虻姆椒ň哂袕V泛的用途。一個(gè)非限制性應(yīng)用是慢病毒載體組合介導(dǎo)的天然或嵌合T細(xì)胞報(bào)告子表達(dá)，該報(bào)告子與自殺基因一起靶向患病細(xì)胞。這種基因修飾的的細(xì)胞(可能是自體固有的，或者源自永生化細(xì)胞)可以靶向疾病細(xì)胞，例如癌細(xì)胞或感染了病原體的細(xì)胞，然后可以用前藥治療患者以消除T細(xì)胞并且以旁觀者效應(yīng)消滅癌癥、感染細(xì)胞或疾病細(xì)胞。這種方法可以單獨(dú)使用，或者與本申請(qǐng)所述的任何其它方法組合使用。
該方法的一個(gè)非限制性實(shí)例使用包含下述基因的慢病毒載體，該基因可以殺滅或破壞慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。優(yōu)選地，該基因是以可誘導(dǎo)的方式表達(dá)的，和/或該基因只有在前藥存在的情況下才活化。有許多誘導(dǎo)性啟動(dòng)子可利用，非限制性實(shí)例是四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。有許多自殺基因可利用，包括皰疹病毒胸苷激酶基因和果蠅Dm-dNK激酶基因，它使被這些基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)前藥敏感，從而在體外或體內(nèi)引入藥物后誘導(dǎo)細(xì)胞殺滅或死亡。還可以使用啟動(dòng)子誘導(dǎo)的基因沉默序列來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
本發(fā)明還提供了通過啟動(dòng)子特異性的自殺基因表達(dá)來治療血液病的方法。有許多自殺基因可利用，包括皰疹病毒胸苷激酶基因和果蠅Dm-dNK激酶基因，它使被這些基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)前藥敏感，從而在體外或體內(nèi)引入藥物后誘導(dǎo)細(xì)胞殺滅或死亡。功能性染色體組的新方法已經(jīng)識(shí)別出在擊疾病細(xì)胞內(nèi)具有提高轉(zhuǎn)錄活性或轉(zhuǎn)錄后mRNA存活力的基因。這些疾病細(xì)胞的獨(dú)特性質(zhì)可以用于開發(fā)慢病毒載體方案來治療這些疾病。該方法使用以組織特異性方式表達(dá)自殺基因的慢病毒載體。非限制性實(shí)例為在CD19 B細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)果蠅Dm-dNK激酶基因的慢病毒載體，可用于治療B細(xì)胞相關(guān)的白血病和淋巴瘤。通過骨髓移植將這種慢病毒載體遞送到干細(xì)胞中。在白血病復(fù)發(fā)時(shí)，患者服用前藥，表達(dá)CD19的所有細(xì)胞(所有B細(xì)胞)將被殺滅。在具有進(jìn)展性癌癥的患者中，要忍受功能性B淋巴細(xì)胞的損失，可以用免疫球蛋白靜脈施用給患者。通過殺滅復(fù)發(fā)的B細(xì)胞相關(guān)腫瘤細(xì)胞，挽救了患者的生命。通過使用只在腫瘤中而不在正常B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄后元件，可以使得這種方案對(duì)腫瘤細(xì)胞類型的特異性更強(qiáng)。
使用將基因盒轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的慢病毒載體，也可以消除靶細(xì)胞，該基因盒包含可操作地聯(lián)接至自殺基因、細(xì)胞毒性基因、和細(xì)胞靜止基因的組織特異性啟動(dòng)子。例如，可以用由內(nèi)皮細(xì)胞啟動(dòng)子特異性表達(dá)的自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞。當(dāng)一些干細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞可以被活化自殺基因的前藥特異性地殺滅。近期，發(fā)現(xiàn)在治療癌癥的骨髓移植過程中，來自癌癥細(xì)胞的血管內(nèi)皮源自骨髓細(xì)胞。因此，通過像特洛伊木馬一樣標(biāo)記它們，可以殺滅需要生長(zhǎng)和形成轉(zhuǎn)移的內(nèi)皮腫瘤。類似地，當(dāng)將干細(xì)胞用于治療時(shí)(例如用于再生心臟、胰腺、肝、神經(jīng)、血管等組織)，通過用基因盒轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞，可以控制在不希望的細(xì)胞類型中表達(dá)時(shí)出現(xiàn)的不希望的分化轉(zhuǎn)移事件，這種分化轉(zhuǎn)移導(dǎo)致干細(xì)胞死亡。
慢病毒載體的用途 慢病毒載體、尤其是HIV載體，可以實(shí)現(xiàn)這些體系的潛能，以產(chǎn)生具有各種表型的細(xì)胞庫(kù)，以特異性地測(cè)試各種藥物和生物制劑的特異性和安全性。
在這里提供了使用HIV載體、包裝質(zhì)?；虬b細(xì)胞系的方法和組合物，以在高通量設(shè)置中直接、迅速和明確地測(cè)量未知功能樣本核酸的功能。該方法包括如下步驟通過將一組cDNA、DNA、EST、基因、合成寡核苷酸、shRNAi、ddRNAi或核酸庫(kù)插入到HIV載體質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒形式的載體，該HIV載體質(zhì)粒沒有表達(dá)功能性HIV蛋白質(zhì)的HIV基因；用一種或多種輔助質(zhì)粒將HIV載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系或包裝細(xì)胞系中，所述細(xì)胞系或包裝細(xì)胞系具有復(fù)制和包裝HIV載體必需的補(bǔ)充成分。結(jié)果是優(yōu)選以小型化、高通量設(shè)置產(chǎn)生一組重組HIV載體或重組HIV載體庫(kù)，包括但不限于96和384孔模板模式、矩陣、將載體印刷到載玻片和類似的方法。為了識(shí)別和確定樣本核酸編碼產(chǎn)物的功能，用表達(dá)樣本核酸產(chǎn)物的重組HIV載體以高通量設(shè)置轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主或宿主細(xì)胞，從而改變宿主的表型。
優(yōu)選實(shí)施方案是包含cDNA或RNAi庫(kù)的HIV載體，它們被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞或包裝細(xì)胞系內(nèi)，其中輔助載體表達(dá)包膜基因，允許將載體顆粒包裝以感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)鄰近的細(xì)胞，以擴(kuò)增載體。如果最初轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入包裝細(xì)胞或包裝細(xì)胞系的各載體是同樣的，則與不能有效產(chǎn)生的那些載體相比，那些更有效產(chǎn)生的載體將更迅速地?cái)U(kuò)增。然后可以通過許多方法測(cè)定各樣品的載體滴度。一種所述方法是ELISA測(cè)定法，該方法在本領(lǐng)域中是公知的，其中被測(cè)定的蛋白質(zhì)是來自細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的HIV的p24抗原。可以用于確定哪個(gè)克隆更有效地產(chǎn)生HIV載體的其它方法是熒光測(cè)定法，例如載體內(nèi)編碼綠熒光蛋白。使用熒光蛋白的優(yōu)選實(shí)施方案是在由同一啟動(dòng)子表達(dá)cDNA和熒光蛋白質(zhì)，二者位于相同mRNA以內(nèi)，并被翻譯初始化序列分離以引起翻譯第二基因產(chǎn)物。這種翻譯初始化序列在本領(lǐng)域中是已知的。例如，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)是常用的一種。通常，從IRES下游基因表達(dá)不如從上游基因表達(dá)有效。如果下游基因的表達(dá)水平低于可接受的水平，則為了提高其表達(dá)，可能將轉(zhuǎn)錄后調(diào)整元件(PRE)插入下游基因的遠(yuǎn)端。由于HIV內(nèi)的易錯(cuò)型逆轉(zhuǎn)錄酶分子和HIV重組的能力，可以將該方法改良以產(chǎn)生具有向性改變的載體包膜蛋白質(zhì)。在每輪擴(kuò)增過程中，HIV載體在其基因組內(nèi)產(chǎn)生錯(cuò)誤，從而可以改變其中所含的包膜序列，從而改變病毒載體的結(jié)合親和力和可能的向性。通過使用靶細(xì)胞作為包含輔助成分的包裝細(xì)胞系(例如特定的癌細(xì)胞類型)，與向性降低或有缺陷而不能復(fù)制的載體相反，對(duì)所述細(xì)胞系的向性增高的載體將在每輪復(fù)制過程中被優(yōu)先選擇。在選擇后，通過PCR，使用位于包膜序列5′和3′的載體特異性引物，可以分離改變的包膜并描繪其特征。包膜序列不需要以天然包膜序列開始，但可以包括由本領(lǐng)域已知的幾種技術(shù)產(chǎn)生的包膜蛋白質(zhì)變體庫(kù)。選擇程序不需要限制細(xì)胞培養(yǎng)基。
可以用包裝組分產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，用于在動(dòng)物中對(duì)HIV載體進(jìn)行全部動(dòng)物的選擇。包裝組分可能需要設(shè)計(jì)成種屬特異性的；例如對(duì)于猴體內(nèi)的復(fù)制，可能優(yōu)選SIV包裝基因(例如gag、pol、調(diào)整或附屬基因)為HIV包裝基因，不過仍然使用HIV基因組作為轉(zhuǎn)移載體(例如，HIV gag非編碼部分上方的5′HIV-LTR，包含包裝序列、任選的rre元件及其剪接接受序列、包膜基因、和3′HIV-LTR)。在組織特異性啟動(dòng)子下，在將載體施用至動(dòng)物后，包膜基因可以在特定的器官或組織中表達(dá)。通過這種方法，使用包含某些包裝基因用于包裝和遷移載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以產(chǎn)生高度特異性的靶載體。
另一個(gè)實(shí)施方案是用慢病毒載體確定基因功能時(shí)的自動(dòng)過程。要確定基因的功能，將一套cDNA或RNAi插入到HIV載體內(nèi)，以產(chǎn)生HIV載體庫(kù)，分別表達(dá)一個(gè)cDNA、一個(gè)RNAi、或一個(gè)cDNA和一個(gè)RNAi、兩個(gè)cDNA、兩個(gè)cDNA和一個(gè)RNAi、一個(gè)cDNA和兩個(gè)RNAi、或靶向感興趣的特定基因的至少兩個(gè)RNAi。該方法的每個(gè)步驟可以在多孔模板中進(jìn)行并且自動(dòng)化，以進(jìn)一步提高體系的能力。這種高通量體系有利于體外和體內(nèi)表達(dá)分析來自人和其它有機(jī)體的大量樣本核酸，并且與本領(lǐng)域可利用的其它技術(shù)相比有顯著改進(jìn)。本發(fā)明使用高通量制備包含一種或多種樣本核酸的重組HIV載體庫(kù)，然后高通量篩選宿主體內(nèi)的腺病毒載體庫(kù)，以改變宿主的表型，作為確定樣本核酸表達(dá)產(chǎn)物以功能的方法。使用核酸構(gòu)件和補(bǔ)充包裝細(xì)胞，以高通量設(shè)置產(chǎn)生HIV載體庫(kù)。樣本核酸庫(kù)可以是一組清楚定義或未定義的序列，或者可以是一池(pool)未定義或已定義的序列。第一核酸構(gòu)件相對(duì)較小，易于操縱含有樣本核酸的接頭質(zhì)粒(adapter plasmid)和表達(dá)盒。第二核酸構(gòu)件包含一種或多種核酸分子，相互部分重疊和/或與第一構(gòu)件內(nèi)的序列重疊，包含復(fù)制和包裝重組HIV必需的至少全部HIV序列，接頭質(zhì)?；虬b構(gòu)件或細(xì)胞沒有提供這些序列。將第一和第二核酸構(gòu)件共同轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)它由多于一個(gè)核酸分子組成時(shí)，導(dǎo)致第一和第二核酸構(gòu)件內(nèi)的重疊序列之間的同源重組和第二核酸構(gòu)件之間的同源重組。以高通量設(shè)置將HIV載體庫(kù)引入宿主體內(nèi)，它生長(zhǎng)以允許充分表達(dá)由樣本核酸編碼的產(chǎn)物，從而允許檢測(cè)并分析其生物學(xué)活性。宿主可以是體外培養(yǎng)的細(xì)胞或動(dòng)物或植物模型。充分表達(dá)由樣本核酸編碼的產(chǎn)物改變了宿主的表型。使用任何一種測(cè)定體外和/或體內(nèi)生物學(xué)活性的方法，鑒別并分析被改變的表型，從而確定樣本核酸產(chǎn)物的功能。
本發(fā)明與目前使用技術(shù)相比有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。全部過程是自動(dòng)化的，尤其當(dāng)在96孔或其它多孔模式中執(zhí)行時(shí)。用多種不同體外方法進(jìn)行高通量篩選提供了在相對(duì)短暫的時(shí)間內(nèi)有效獲得功能信息的方法。鑒定體外或原位顯示或誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生所需表型的重組HIV載體庫(kù)的成員，以將庫(kù)分成可操控的多種重組腺病毒載體，或者可以在體外動(dòng)物模型中檢驗(yàn)的克隆。本發(fā)明的另一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是該方法產(chǎn)生了不含可復(fù)制慢病毒(RCL)的腺病毒庫(kù)。RCL污染全部庫(kù)將是主要的阻礙，尤其是如果庫(kù)被連接擴(kuò)增用于多次篩選程序。
另一個(gè)實(shí)施方案是表達(dá)谷氨酸合成酶(GS)基因的慢病毒載體，具有所需的重組蛋白質(zhì)或單克隆抗體基因。已知GS是非常重要的代謝物，導(dǎo)致對(duì)高表達(dá)重組蛋白質(zhì)或單克隆抗體的細(xì)胞的強(qiáng)選擇。HIV載體將在同一載體內(nèi)包含重組蛋白質(zhì)基因和GS基因?？蛇x擇地，包含重組蛋白質(zhì)、GS或提高重組蛋白質(zhì)產(chǎn)率的另一種基因的多個(gè)載體也是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案?？赡苁褂闷渌x擇方法，包括但不限于嘌呤黃素、表面標(biāo)記基因表達(dá)和其它方法。
本發(fā)明還描述了一種方法，該方法使用上述高通量方法，來分離基因以提高蛋白質(zhì)、疫苗、或單克隆抗體的制備產(chǎn)率。表達(dá)cDNA或RNAi的慢病毒或HIV載體庫(kù)由重組蛋白質(zhì)或單克隆抗體構(gòu)成，它們?cè)趩为?dú)的慢病毒或HIV載體或包含cDNA或RNAi庫(kù)(包括shRNAi和ddRNAi、或其它基因表達(dá)抑制物，例如核酶、反義、aptamers、反式顯性突變蛋白質(zhì)等)的載體上表達(dá)。制備并添加載體到用于制備蛋白質(zhì)的細(xì)胞中和使用上述高通量模式表達(dá)重組蛋白質(zhì)的單獨(dú)細(xì)胞克隆。蛋白質(zhì)制備量可由本領(lǐng)域已知的方法測(cè)量，可以鑒別表達(dá)高水平蛋白質(zhì)的克隆?？梢允褂蒙鲜鲚d體特異性引物擴(kuò)增來自所述庫(kù)的具體cDNA或RNAi并鑒定序列。通過將它包含在每個(gè)HIV載體構(gòu)件中，或者通過構(gòu)建當(dāng)前結(jié)構(gòu)性表達(dá)已識(shí)別的cDNA或RNAi的細(xì)胞系，這種cDNA或RNAi然后可以用于提高其它蛋白質(zhì)或單克隆抗體的制備。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是慢病毒載體，它表達(dá)靶向蛋白酶基因的RNAi，具有所需的重組蛋白質(zhì)、單克隆抗體或疫苗基因。已知在純化過程中，蛋白酶顯著降低所需重組蛋白質(zhì)或單克隆抗體的收率。HIV載體將在同一載體中包含重組蛋白質(zhì)基因和用于一個(gè)或多個(gè)蛋白酶基因的RNAi?？蛇x擇地，包含重組蛋白質(zhì)、抗蛋白酶RNAi或另一種基因的多種載體也是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述另一種基因能促進(jìn)重組蛋白質(zhì)在純化過程中的收率。
本發(fā)明還提供了一種方法，該方法通過抑制影響純化過程收率的蛋白質(zhì)來分離基因，以提高下游純化過程中的蛋白質(zhì)或單克隆抗體的產(chǎn)率。這種方法對(duì)于上述高通量方法極為有用。表達(dá)cDNA或RNAi的至少一個(gè)慢病毒或HIV載體庫(kù)由重組蛋白質(zhì)或單克隆抗體構(gòu)成，在單獨(dú)的慢病毒或HIV載體或包含cDNAs或RNAi庫(kù)的載體上表達(dá)。制備并添加載體到用于制備蛋白質(zhì)的細(xì)胞中和使用上述高通量模式表達(dá)重組蛋白質(zhì)的單獨(dú)細(xì)胞克隆。然后通過本領(lǐng)域已知的方法純化重組蛋白質(zhì)或單克隆抗體并測(cè)量收率。鑒別包含高收率蛋白質(zhì)或重組抗體的具體細(xì)胞克隆。使用上述載體特異性引物可以擴(kuò)增來自所述庫(kù)的具體cDNA或RNAi并鑒定序列。通過將它包含在每個(gè)HIV載體構(gòu)件中，或者通過構(gòu)建當(dāng)前結(jié)構(gòu)性表達(dá)已識(shí)別的cDNA或RNAi的細(xì)胞系，這種cDNA或RNAi然后可以用于提高其它蛋白質(zhì)或單克隆抗體的產(chǎn)生。
另一個(gè)實(shí)施方案也是表達(dá)cDNA或RNAi的慢病毒載體，所述RNAi抑制產(chǎn)生單克隆抗體、蛋白質(zhì)或疫苗的細(xì)胞系中的潛在病毒、朊病毒或細(xì)菌污染物。一個(gè)非限制性實(shí)例是在表達(dá)蛋白質(zhì)的慢病毒載體中表達(dá)的RNAi，靶向牛海綿體腦病致病因子、或Creutzfeld-Jakob病(CJD)致病因子，它們是生物制劑制備過程中的潛在制備污染物?？笲SE或抗CJD RNAi的表達(dá)將使BSE或CJD致病因子污染制備的危險(xiǎn)最小化，從而提高這樣制備的生物學(xué)制劑的安全性。HIV載體可以包含重組蛋白質(zhì)和針對(duì)可能造成污染的一種或多種致病因子的RNAi?？蛇x擇地，包含重組蛋白質(zhì)、抗蛋白酶RNAi或另一種基因的多種載體也是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述另一種基因能促進(jìn)重組蛋白質(zhì)在純化過程中的收率。本發(fā)明還能被改良以包括基因或RNAi，使認(rèn)為對(duì)重組產(chǎn)物的制備和質(zhì)量有害或不利的任何基因的產(chǎn)生最小化。
慢病毒載體還可以用于制備在一種或多種基因的過度表達(dá)或抑制方面不相同的細(xì)胞系庫(kù)。為了獲得具有特定表型的所需細(xì)胞，將多種載體表達(dá)基因添加到細(xì)胞中。所述基因可以從熒光標(biāo)記物基因的上游克隆，例如使用上述元件如IRES，從而可以從相同的mRNA翻譯標(biāo)記物和感興趣的基因。優(yōu)選通過上述高通量方法克隆細(xì)胞，所述細(xì)胞具有過度表達(dá)的基因和由RNAi介導(dǎo)的表達(dá)下調(diào)的基因的正確組合。如果原材料是原代細(xì)胞，優(yōu)選基因之一可以是使細(xì)胞永生的基因，例如表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)，或?qū)＠兴龅钠渌椒?US6686159或6358739)。然而，任何細(xì)胞，包括已有細(xì)胞系都可以用作原材料。
另一個(gè)示例性實(shí)施方案是用多種慢病毒載體修飾細(xì)胞，所述慢病毒載體包含感興趣的表達(dá)的基因和/或基因表達(dá)的抑制物，然后使用高通量方法分離細(xì)胞克隆，以分離具有所需基因型和/或表型的細(xì)胞克隆。
本發(fā)明還提供了識(shí)別選擇性影響感興趣的基因或其表達(dá)產(chǎn)物或其途徑中下游基因或蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)化合物的方法，該方法包括與細(xì)胞一起培養(yǎng)多種慢病毒載體以對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，使它們包含下述基因其過度表達(dá)感興趣的基因、和過度表達(dá)至少一種第二基因或者至少感興趣的第二基因的抑制物序列，其中多種細(xì)胞然后通過高通量方法分離，以分離具有所需基因型和/或本型的細(xì)胞克隆。
本發(fā)明還提供了識(shí)別改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)或基因表達(dá)水平的制劑的方法，該方法包括與細(xì)胞一起培養(yǎng)多種慢病毒載體以對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，使它們包含下述基因其過度表達(dá)感興趣的基因、和過度表達(dá)至少一種第二基因或者至少相關(guān)第二基因的抑制物序列，其中多種細(xì)胞然后通過高通量方法分離，以分離具有所需基因型和/或表型的細(xì)胞克??；然后在候選制劑存在的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞并確定所述候制選劑對(duì)細(xì)胞的影響。
本發(fā)明的另一方面是表達(dá)刺激免疫響應(yīng)的cDNA或RNAi的慢病毒載體。優(yōu)選實(shí)施方案是表達(dá)GM-CSF、CD40L和/或任何細(xì)胞因子或免疫響應(yīng)刺激物的HIV載體。所述載體可能是遷移載體或非遷移載體，這取決于所需治療或疫苗用途。除了細(xì)胞因子基因外，自殺基因可插入載體內(nèi)，以誘導(dǎo)包含載體的細(xì)胞在施用前藥后凋亡。
另一個(gè)實(shí)施方案是用慢病毒載體來發(fā)現(xiàn)使用雙雜交技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)新的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。一個(gè)實(shí)例由Promega Corporation(www.promega.com)提供。雙雜交體系是檢測(cè)體內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的極有力的方法。雙雜交體系的基礎(chǔ)是在一些轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)發(fā)現(xiàn)的分子區(qū)域。在CheckMateTM哺乳動(dòng)物雙雜交體系中，pBIND載體在多種克隆區(qū)域上游包含酵母GAL4 DNA結(jié)合區(qū)域，pACT載體在多種克隆區(qū)域上游包含皰疹病毒VP 16活化區(qū)域。而且，pBIND載體表達(dá)Renilla腎形熒光素酶，這使得使用者可以使轉(zhuǎn)染效率標(biāo)準(zhǔn)化。編碼兩種潛在相互作用的感興趣的蛋白質(zhì)的兩種基因被克隆到pBIND和pACT載體中，以產(chǎn)生分別與GAL4的DNA結(jié)合區(qū)域和VP 16的活化區(qū)域的融合蛋白。pG51uc載體在最小TATA盒的上游包含五個(gè)GAL4結(jié)合位點(diǎn)，TATA盒位于螢火蟲熒光素酶基因(luc+)上游。pGAL4和pVP16融合結(jié)構(gòu)用pG51uc載體轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。在轉(zhuǎn)染兩到三天后，將細(xì)胞溶解，使用Dual-Luciferase報(bào)告子測(cè)定體系測(cè)定Renilla熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的量。作為GAL4和VP融合結(jié)構(gòu)的兩種測(cè)試蛋白質(zhì)之間的相互作用導(dǎo)致比陰性對(duì)照高的螢火蟲熒光素酶表達(dá)。這樣的雙雜交體系可以容易地用于慢病毒載體，以直接篩選哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
上列標(biāo)題作為指導(dǎo)，其中某些信息可以在本申請(qǐng)中找到，但所述標(biāo)題并非是在申請(qǐng)中這樣主題的信息的唯一來源。上面引用的所有申請(qǐng)、專利和公開的全部?jī)?nèi)容被全部引入本文作為參考。2005年2月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/653,386；2005年3月10日提交的60/660,310；2005年5月18日提交的60/682,059；和2005年10月5日提交的60/723,768被全文納入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.慢病毒輔助質(zhì)粒，其包含
a)慢病毒5′LTR，其含有可操作地聯(lián)接至編碼慢病毒gag和pol的多核苷酸序列的功能性天然啟動(dòng)子，和可有效終止由該天然啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄的異源polyA信號(hào)；
b)可操作地聯(lián)接至包膜編碼序列的異源啟動(dòng)子，和可有效終止由該異源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄的異源polyA信號(hào)；
其中所述天然啟動(dòng)子和異源啟動(dòng)子以相反的轉(zhuǎn)錄方向存在于所述質(zhì)粒中，而且所述質(zhì)粒缺少功能性包裝序列。
2.如權(quán)利要求1所述的慢病毒輔助質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒包括從所述5′LTR以外的不同慢病毒種獲得的TAR元件，并包括從所述5′LTR以外的不同慢病毒種獲得的RRE元件。
3.如權(quán)利要求1所述的慢病毒輔助質(zhì)粒，其中所述5′LTR是天然的。
4.如權(quán)利要求1所述的慢病毒輔助質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒還包括編碼Tat多肽或Rev多肽的可表達(dá)多核苷酸序列，該序列可操作地聯(lián)接至啟動(dòng)子。
5.如權(quán)利要求1所述的慢病毒輔助質(zhì)粒，其中所述5′LTR是HIV-1或HIV-2。
6.如權(quán)利要求1所述的慢病毒輔助質(zhì)粒，其中所述編碼慢病毒gag和pol的多核苷酸序列是HIV-1 gag和HIV-1 pol或HIV-2 gag和HIV-2 pol。
7.如權(quán)利要求1所述的慢病毒輔助質(zhì)粒，其中所述編碼gag和pol的多核苷酸序列包括至少一種非天然密碼子，以在相容性宿主體內(nèi)表達(dá)時(shí)提高所述編碼序列的翻譯。
8.如權(quán)利要求1所述的慢病毒輔助質(zhì)粒，其中在所述pol序列和包膜編碼序列之間存在多核苷酸序列，它是終止密碼子或p7 KETWETWWTE編碼序列。
9.如權(quán)利要求1所述的慢病毒輔助質(zhì)粒，其中所述包膜編碼序列用于VSV-G包膜或線狀病毒包膜。
10.如權(quán)利要求1所述的慢病毒輔助質(zhì)粒，還包含可有效抑制所述包膜編碼序列翻譯的反義多核苷酸。
11.慢病毒轉(zhuǎn)移載體，其包含
a)慢病毒5′LTR；
b)遠(yuǎn)離所述5′LTR的慢病毒包裝序列；
c)修飾的慢病毒3′LTR，其包含TATA框序列，但所述TATA框序列缺少3′U3序列5′，其中所述3′LTR的轉(zhuǎn)錄活性降低。
12.如權(quán)利要求12所述的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，還包含d)可操作地聯(lián)接至異源多核苷酸序列的異源啟動(dòng)子。
13.如權(quán)利要求12所述的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，其中缺少3′U3的序列是TATA框序列的5′至20個(gè)核苷之內(nèi)。
14.如權(quán)利要求12所述的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，其中所述3′LTR還包括可操作地聯(lián)接到第二異源多核苷酸序列的第二異源啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子和異源多核苷酸序列被插入到3′LTR內(nèi)，其插入位置可有效降低所述3′LTR的轉(zhuǎn)錄活性。
15.如權(quán)利要求12所述的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，還包含第二異源啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可操作地聯(lián)接至編碼感興趣的第二基因的異源序列。
16.如權(quán)利要求16所述的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，其中所述第一和第二異源編碼序列被內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)分隔開。
17.如權(quán)利要求16所述的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，其中每個(gè)所述異源編碼序列還包含可有效終止由所述天然啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄的異源polyA信號(hào)。
18.用于制備慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的慢病毒包裝體系，包括
a)權(quán)利要求1的慢病毒輔助質(zhì)粒，
b)權(quán)利要求12的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，和
c)質(zhì)粒，其包含可操作地聯(lián)接至異源啟動(dòng)子的rev多肽編碼序列，和可操作地聯(lián)接至異源啟動(dòng)子的tat多肽編碼序列。
19.含有權(quán)利要求1的輔助載體的分離細(xì)胞。
20.含有權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)移載體的分離細(xì)胞。
21.含有權(quán)利要求19的慢病毒包裝體系的分離細(xì)胞。
22.制備慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的方法，包括
在有效制備轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的條件下，在宿主細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)包含權(quán)利要求19的包裝體系的質(zhì)粒。
23.在宿主細(xì)胞內(nèi)制備感興趣的多肽的方法，包括
用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，以形成經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，其中所述載體包含可表達(dá)的異源多核苷酸，該異源多核苷酸編碼感興趣的分泌的異源多肽。
24.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是CHO或293細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，還包括在有效制備所述感興趣的多肽的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中用多種慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述宿主細(xì)胞，其中每個(gè)載體包含編碼不同多肽的不同異源多核苷酸。
27.如權(quán)利要求27所述的方法，其中各所述異源多核苷酸編碼病毒殼體的至少一種殼體多肽，當(dāng)該多肽在所述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)會(huì)自組裝成所述病毒殼體。
28.如權(quán)利要求28所述的方法，其中至少一種多核苷酸編碼流感病毒的血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽。
29.如權(quán)利要求24所述的方法，其中用編碼血凝素、神經(jīng)氨酸酶、和基質(zhì)(M1)多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)導(dǎo)所述宿主細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求30所述的方法，其中各個(gè)多核苷酸存在于不同病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體內(nèi)。
31.權(quán)利要求30的產(chǎn)物。
32.識(shí)別可提高多肽在宿主細(xì)胞內(nèi)的制備的多肽或基因的方法，該方法包括
制備多種經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，各細(xì)胞用至少兩種不同的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)子轉(zhuǎn)導(dǎo)，該轉(zhuǎn)導(dǎo)子包含序列相互不同的可表達(dá)的異源多核苷酸，和
依據(jù)與所述異源序列相關(guān)的功能活性篩選所述宿主細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述異源序列為RNAi序列、多肽編碼序列、或感興趣的基因的反義序列。
34.在慢病毒載體內(nèi)，所述改進(jìn)包括將異源多核苷酸插入3′LTR內(nèi)，其中所述插入導(dǎo)致3′LTR具有最小的轉(zhuǎn)錄活性。
35.治療與將供體淋巴細(xì)胞移植給宿主有關(guān)的GVHD疾病的方法，該方法包括
用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)供體淋巴細(xì)胞，該載體包含編碼細(xì)胞靜止元件或細(xì)胞毒性元件的可表達(dá)的多核苷酸序列或可選擇性表達(dá)的多核苷酸序列，
任選地，在接受者多肽或細(xì)胞存在的情況下轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，和
將所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞輸注到所述宿主體內(nèi)。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述可選擇性表達(dá)的基因可操作地聯(lián)接至可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，或聯(lián)結(jié)至在外源性導(dǎo)入化學(xué)品的情況下活化的啟動(dòng)子。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述可選擇性表達(dá)的基因編碼RNAi或促凋亡多肽。
38.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述細(xì)胞毒性元件是皰疹胸苷激酶或多底物激酶基因的編碼序列。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，還包括施用有效量的更昔洛韋、AZT、flurada或無環(huán)鳥苷，其中所述量可有效導(dǎo)致所述經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞的細(xì)胞死亡。
40.如權(quán)利要求35所述的方法，還包括在轉(zhuǎn)導(dǎo)所述供體細(xì)胞的同時(shí)或之前，使所述供體細(xì)胞與有效量的宿主自身抗原接觸。
41.表達(dá)載體，其包含
a)慢病毒5′LTR，其包含可操作地聯(lián)接至編碼天然慢病毒gag和pol的多核苷酸序列的功能性天然啟動(dòng)子，和可有效終止由所述天然啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄的異源polyA信號(hào)，其中在gag-pol序列起點(diǎn)的下游存在翻譯終止信號(hào)；
b)位于gag-pol序列下游的剪接受體，和
c)位于gag-pol序列下游的異源多核苷酸序列，其可操作地聯(lián)接至5′LTR啟動(dòng)子。
42.慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，其包含T細(xì)胞受體和細(xì)胞毒性元件。
43.慢病毒載體包裝或制備細(xì)胞系，其表達(dá)靶向VSV-G的可誘導(dǎo)基因抑制序列或沉默序列。
44.用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞群的方法，其中所述淋巴細(xì)胞群在用所述慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)前沒有純化為亞群。
45.用慢病毒載體治療癌癥的方法，其中用表達(dá)細(xì)胞毒性元件的慢病毒載體處理干細(xì)胞，該元件可操作地聯(lián)接至內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子，并且其中所述干細(xì)胞被輸注到癌癥患者體內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于基因治療、癌癥治療、制備重組蛋白如抗體和疫苗和其它治療目的的慢病毒載體。公開了新慢病毒載體，例如含有相反方向的輔助序列和/或最少功能的LTR序列，可用于制備高效轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。還設(shè)計(jì)了載體以表達(dá)沉默RNA和反義多核苷酸。
文檔編號(hào)A01N63/00GK101160055SQ200680012697
公開日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2006年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月16日
發(fā)明者博諾·卓普里克, 韻基·尼恩·張 申請(qǐng)人:萊蒂恩公司