專利名稱：水稻耐逆轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是來源于水稻的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
水稻作為最重要的糧食作物，弄清其耐逆機(jī)理，進(jìn)而改善其耐逆性，具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。
本發(fā)明所提供的抗逆轉(zhuǎn)錄因子來源于水稻，名稱為OsDREB1，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由238個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，是水稻中的一種DREB轉(zhuǎn)錄因子，含有保守的EREBP/AP2結(jié)構(gòu)域序列，為序列2中自氮端到碳端第51-117位氨基酸殘基。
抗逆轉(zhuǎn)錄因子OsDREB1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由727個堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第7到第723位堿基，其表達(dá)主要受低溫的誘導(dǎo)。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的編碼轉(zhuǎn)錄因子OsDREB1的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對低溫脅迫耐受力得到增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。攜帶有本發(fā)明OsDREB1基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤鼓嬷参锲贩N，特別是培育抗寒植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
圖2為Northern雜交分析結(jié)果。
水稻(Oryza sativa var.JX17)種子種在盆中一個月后分成二份，一份繼續(xù)生長，另一份進(jìn)行低溫脅迫處理，將水稻苗移入4℃光照箱，小時后取樣。收集新鮮葉片1g在液氮中研碎，懸于4mol/L硫氫酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無水乙醇沉淀總RNA，之后，溶于水。經(jīng)mRNA純化試劑盒處理得到mRNA。分別以上述正常和脅迫的mRNA為探針與點(diǎn)在Hybond-N+膜上的32個篩選到的EREBP/AP2類基因contig點(diǎn)雜交。將二次雜交有差異的基因選出，再進(jìn)行二輪雜交驗(yàn)證(結(jié)果如


圖1所示，圖中，第一輪點(diǎn)雜交 (A)低溫4℃處理5小時； (B)對照，第二輪點(diǎn)雜交(C)低溫4℃處理5小時；(D)對照。下劃線示出在兩輪點(diǎn)雜交中都受冷誘導(dǎo)的克隆。箭頭表示作為上樣內(nèi)對照的Actin基因。)，得到低溫誘導(dǎo)的DREB基因OsDREB1。
實(shí)施例2、水稻OsDREB1活性與環(huán)境脅迫的關(guān)系水稻(Oryza sativa var.JX17)種子種在盆中一個月后分成二份，一份繼續(xù)生長，另一份進(jìn)行下述各種脅迫處理4℃低溫處理將水稻苗移入4℃光照箱。
鹽處理將水稻苗移入200mM NaCl溶液中。
ABA處理將水稻苗移入50uM ABA溶液中。
旱處理用濾紙吸干水稻苗表面的水分后放于濾紙上使其自然脫水。
分別在各種處理后0、0.5、1、2、5、10、24、32小時取樣。收集新鮮葉片1g在液氮中研碎，懸于4mol/L硫氫酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無水乙醇沉淀總RNA，之后，溶于水，得到總RNA。分別以O(shè)sDREB1 DNA為探針進(jìn)行Northern分析。結(jié)果如圖2所示，圖中A為低溫處理；B為50umABA處理；C為200mM NaCl處理；D為干旱處理，Northern分析表明，OsDREB受低溫(4℃)誘導(dǎo)，但不受50uM ABA，200mM NaCl以及干旱誘導(dǎo)。
序列表<160>2<210>1<211>727<212>DNA<213>稻屬水稻(Orysa sativa L.)<400>1ccgaagatgt gcgggatcaa gcaggagatg agcggcgagt cgtcggggtc gccgtgcagc60tcggcgtcgg cggagcggca gcaccagacg gtgtggacgg cgccgccgaa gaggccggcg120gggcggacca agttcaggga gacgaggcac ccggtgttcc gcggcgtgcg gcggaggggc180aatgccggga ggtgggtgtg cgaggtacgg gtgcccgggc ggcgcggctg caggctctgg240ctcggcacgt tcgacaccgc cgagggcgcg gcgcgcgcgc acgacgccgc catgctcgcc300atcaacgccg gcggcggcgg cggcggggga gcatgctgcc tcaacttcgc cgactccgcg360tggctcctcg ccgtgccgcg ctcctaccgc accctcgccg acgtccgcca cgccgtcgcc420gaggccgtcg aggacttctt ccggcgccgc ctcgccgacg acgcgctgtc cgccacgtcg480tcgtcctcga cgacgccgtc caccccacgc accgacgacg aggaggagtc cgccgccacc540gacggcgacg agtcctcctc cccggccagc gacctggcgt tcgaactgga cgtcctgagt600gacatgggct gggacctgta ctacgcgagc ttggcgcagg ggatgctcat ggagccacca660tcggcggcgc tcggcgacga cggtgacgcc atcctcgccg acgtcccact ctggagctac720tagagct 727<210>2<211>238<212>PRT<213>稻屬水稻(Orysa sativa L.)<400>2Met Cys Gly Ile Lys Gln Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Gly Ser1 5 10 15Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ala Glu Arg Gln His Gln Thr Val Trp20 25 30Thr Ala Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu35 40 45Thr Arg His Pro Val Phe Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Asn Ala50 55 60Gly Arg Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Cys65 70 75Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Gly Ala Ala Arg80 85 90Ala His Asp Ala Ala Met Leu Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Gly95 100 105Gly Gly Gly Ala Cys Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Leu110 115 120Leu Ala Val Pro Arg Ser Tyr Arg Thr Leu Ala Asp Val Arg His125 130 135Ala Val Ala Glu Ala Val Glu Asp Phe Phe Arg Arg Arg Leu Ala140 145 150Asp Asp Ala Leu Ser Ala Thr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Pro Ser155 160 165Thr Pro Arg Thr Asp Asp Glu Glu Glu Ser Ala Ala Thr Asp Gly170 175 180Asp Glu Ser Ser Ser Pro Ala Ser Asp Leu Ala Phe Glu Leu Asp185 190 195Val Leu Ser Asp Met Gly Trp Asp Leu Tyr Tyr Ala Ser Leu Ala200 205 210Gln Gly Met Leu Met Glu Pro Pro Ser Ala Ala Leu Gly Asp Asp215 220 225Gly Asp Ala Ile Leu Ala Asp Val Pro Leu Trp Ser Tyr230 235 238
權(quán)利要求
1.抗逆轉(zhuǎn)錄因子OsDREB1，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于所述序列2中自氮端到碳端第51-117位氨基酸殘基是EREBP/AP2功能保守域。
4.抗逆轉(zhuǎn)錄因子OsDREB1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述抗逆轉(zhuǎn)錄因子OsDREB1的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第7到第723位堿基。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的表達(dá)載體。
8.含有權(quán)利要求4所述基因的細(xì)胞系。
9.權(quán)利要求4所述基因在培育耐逆植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了來源于水稻的耐逆轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，目的是提供具有較強(qiáng)抗逆特性的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。本發(fā)明所提供的抗逆轉(zhuǎn)錄因子名稱為OsDREB1，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)?？鼓孓D(zhuǎn)錄因子OsDREB1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤鼓嬷参锲贩N，特別是培育抗寒植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
文檔編號A01H1/00GK1478893SQ0212951
公開日2004年3月3日 申請日期2002年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月29日
發(fā)明者陳受宜, 劉強(qiáng), 張勁松, 陳建權(quán), 董億 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所, 清華大學(xué)