外周血單核細(xì)胞基因中mRNA逆轉(zhuǎn)錄成ＤＮＡ的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了外周血單核細(xì)胞基因中mRNA逆轉(zhuǎn)錄成ＤＮＡ的方法。步驟如下：首先將目標(biāo)片段選取模版，然后在ＰＣＲ試管中配置反應(yīng)體系；混合搖勻，高速離心；烤箱中孵育３分鐘，溫度為７０－７５攝氏度；冰上冷卻１分鐘；微量離心機(jī)簡(jiǎn)短離心；放入三倍體積的緩沖液以及核糖核酸酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶分別2倍體積；再次孵育，時(shí)間1-1.5小時(shí)；直接取至冰上，冷卻3-5分鐘后高速離心，于零下50-80溫度下保存即可，再次孵育之前需要加入無(wú)水乙醇1-1.5倍體積。本發(fā)明的有益效果是：操作簡(jiǎn)單，成本較低，純度較高，再現(xiàn)性強(qiáng)，數(shù)據(jù)精確。
【專(zhuān)利說(shuō)明】外周血單核細(xì)胞基因中mRNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生化實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及外周血單核細(xì)胞基因中mRNA逆轉(zhuǎn)錄成D NA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]外周血是除骨髓之外的血液，臨床上常用一些方法把骨髓中的造血干細(xì)胞釋放到血外周血液中，再在從血液中提取分離得到造血干細(xì)胞，我們把這樣得到的干細(xì)胞稱(chēng)為外周血干細(xì)胞，在二十一世紀(jì)初人類(lèi)開(kāi)始的生命方舟計(jì)劃中首次提出外周血這一新概念，正常人外周血中一般看不見(jiàn)幼稚的干細(xì)胞的，只存在有極少量的造血干細(xì)胞，其含量為
0.01%左右。如果幼稚細(xì)胞的比例大幅增加，有可能是類(lèi)白血病。正因?yàn)榇嬖?.01%的造血干細(xì)胞，可利用細(xì)胞分離的技術(shù)(血細(xì)胞自動(dòng)分離機(jī))，將外周血中含有造血干細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離保存，重復(fù)數(shù)次達(dá)一定細(xì)胞數(shù)量后，回輸給患者以之代替骨髓而進(jìn)行的干細(xì)胞移植，稱(chēng)為外周血干細(xì)胞移植。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種技術(shù)方案:
外周血單核細(xì)胞基因中mRNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA的方法，步驟如下:首先將目標(biāo)片段選取模版，然后在P C R試管中配置反應(yīng)體系；混合搖勻，高速離心；烤箱中孵育3分鐘，溫度為7 0 — 7 5攝氏度；冰上冷卻I分鐘；微量離心機(jī)簡(jiǎn)短離心；放入三倍體積的緩沖液以及核糖核酸酶抑制劑、逆 轉(zhuǎn)錄酶分別2倍體積；再次孵育，時(shí)間1-1.5小時(shí)；直接取至冰上，冷卻3-5分鐘后高速離心，于零下50-80溫度下保存即可。
[0004]本發(fā)明中，再次孵育之前需要加入無(wú)水乙醇1-1.5倍體積。
[0005]本發(fā)明的有益效果是:操作簡(jiǎn)單，成本較低，純度較高，再現(xiàn)性強(qiáng)，數(shù)據(jù)精確。
【具體實(shí)施方式】
[0006]外周血單核細(xì)胞基因中mRNA逆轉(zhuǎn)錄成D N A的方法，步驟如下:首先將目標(biāo)片段選取模版，然后在P C R試管中配置反應(yīng)體系；混合搖勻，高速離心；烤箱中孵育3分鐘，溫度為7 0攝氏度；冰上冷卻I分鐘；微量離心機(jī)簡(jiǎn)短離心；放入三倍體積的緩沖液以及核糖核酸酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶分別2倍體積；再次孵育，時(shí)間1.2小時(shí)；直接取至冰上，冷卻4.5分鐘后高速離心，于零下50-80溫度下保存即可，再次孵育之前需要加入無(wú)水乙醇1-1.5倍體積。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.外周血單核細(xì)胞基因中mRNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA的方法，其特征在于，步驟如下:首先將目標(biāo)片段選取模版，然后在P C R試管中配置反應(yīng)體系；混合搖勻，高速離心；烤箱中孵育3分鐘，溫度為7 O — 7 5攝氏度；冰上冷卻I分鐘；微量離心機(jī)簡(jiǎn)短離心；放入三倍體積的緩沖液以及核糖核酸酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶分別2倍體積；再次孵育，時(shí)間1-1.5小時(shí)；直接取至冰上，冷卻3-5分鐘后高速離心，于零下50-80溫度下保存即可。
2.如權(quán)利要求1所述的外周血單核細(xì)胞基因中mRNA逆轉(zhuǎn)錄成DN A的方法，其特征在于，再次孵育之前需要加入無(wú)水乙醇1-1`.5倍體積。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103614366SQ201310537861
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】辛竹 申請(qǐng)人:辛竹