專利名稱：甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特指一種甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
Otani和Mii等人于1993年，用14個(gè)甘薯品種的葉片與8個(gè)發(fā)根農(nóng)桿菌菌系共培養(yǎng)誘導(dǎo)得到毛狀根，并誘導(dǎo)植株再生，首次在甘薯這一作物中獲得了少量轉(zhuǎn)基因植株。
Newell等人在1995年，分別用攜帶pCTI5和pPCG6質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404轉(zhuǎn)化甘薯品種“Jewel”的新鮮塊根組織，得到幾株轉(zhuǎn)基因植株。
Gama等人于1996年，用根癌農(nóng)桿菌菌株EHA101轉(zhuǎn)化甘薯品種“WhiteStar”的愈傷組織，獲得8株轉(zhuǎn)基因植株。
Moran等人于1998年，以葉片為受體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt基因?qū)敫适砥贩N“Jewel”，獲得數(shù)株轉(zhuǎn)基因甘薯植株。
Otani等人于1998年，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GUS基因?qū)敫适砥贩N“高系14號(hào)”的愈傷組織，獲得少量轉(zhuǎn)基因植株。
Kimura等人于2001年，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GBSSI基因?qū)敫适砥贩N“高系14號(hào)”的愈傷組織，獲得數(shù)株轉(zhuǎn)基因甘薯植株。
Otani等人于2001年，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bar基因?qū)敫适砥贩N“高系14號(hào)”的愈傷組織，獲得少量轉(zhuǎn)基因植株。
但是，目前上述這些甘薯遺傳轉(zhuǎn)化研究中，均采用再分化能力很低的葉片、葉柄或愈傷組織等材料作為受體，所以到目前為止的研究中，僅獲得少數(shù)幾株轉(zhuǎn)基因甘薯植株，尚未獲得可在生產(chǎn)上應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因甘薯植株。因此，甘薯基因工程應(yīng)用的最主要問題是缺乏一個(gè)高效及適應(yīng)性廣的遺傳轉(zhuǎn)化體系。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是它包括以下步驟(1)胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立將長0.3-0.8mm的莖尖組織在添加1.0-3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、3.0％蔗糖和0.8％瓊脂的Murashige和Skoog培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為26～30℃，pH5.8、黑暗，培養(yǎng)6-8周后，將誘導(dǎo)得到的胚性愈傷組織破碎成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到含有1.0-3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中，于水平搖床上90～120rpm進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為26～30℃、每日13小時(shí)、100～500Lx光照，懸浮培養(yǎng)物每7-10天繼代1次；(2)菌株的活化及菌液的制備將在4℃以下冰箱中保存的農(nóng)桿菌(如LBA4404、EHA101)在固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，使其活化，挑取培養(yǎng)2天的單菌落，在含有50mg/L卡那霉素和125mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，250rpm下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為26～30℃、pH值在6.8～7.4之間、黑暗，培養(yǎng)14～18小時(shí)后，將得到的懸浮培養(yǎng)物在固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，以進(jìn)一步活化獲得農(nóng)桿菌單菌落。培養(yǎng)14～18小時(shí)后，將達(dá)到對(duì)數(shù)生長期的菌液置于離心管中，5000×g下離心5分鐘收集菌體，最后將農(nóng)桿菌懸浮于Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中稀釋OD值為0.5～0.8；(3)侵染和共培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)2-3天的胚性懸浮細(xì)胞用0.45mol/L的甘露醇在室溫下進(jìn)行高滲處理，將預(yù)處理過的懸浮細(xì)胞重新懸浮于制備好的菌液中，低速振蕩10-15分鐘，然后將菌液吸出，將侵染過的懸浮細(xì)胞重新懸浮于含有1.0-3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行共培養(yǎng)3-5天，培養(yǎng)條件為26～30℃、黑暗；(4)選擇培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的胚性懸浮細(xì)胞用無菌水清洗2-3次，再用含有300-500mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基抑菌處理12小時(shí)，將侵染過的胚性懸浮細(xì)胞懸浮于含有1.0-3.0mg/L 2.4-二氯苯氧乙酸、100-300mg/L羧芐青霉素以及50-75mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為26～30℃、每日13小時(shí)、100～500Lx光照；(5)轉(zhuǎn)基因植株再生在選擇培養(yǎng)基中，當(dāng)胚性細(xì)胞團(tuán)長至直徑約0.5-2mm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到含有相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使其增殖形成胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚，培養(yǎng)條件為28℃、黑暗，轉(zhuǎn)移6-8周后，將形成體細(xì)胞胚的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加0.5-1.5mg/L脫落酸、50-75mg/L卡那霉素以及100-300mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog固體培養(yǎng)基上，使體細(xì)胞胚成熟并發(fā)芽，培養(yǎng)條件為26～30℃、每日13小時(shí)、2000～4000Lx光照；4-6周后，將再生的小植株轉(zhuǎn)移到添加50-75mg/L卡那霉素、100-300mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog基本培養(yǎng)上，使其形成完整的甘薯轉(zhuǎn)基因植株。
該步驟(1)的莖尖組織為帶有1-2片葉原基，2，4-二氯苯氧乙酸濃度一定為2.0mg/L，懸浮培養(yǎng)物繼代時(shí)間為7天。該步驟(3)要求使用懸浮培養(yǎng)12周內(nèi)的懸浮培養(yǎng)物。侵染和共培養(yǎng)中，在進(jìn)行高滲處理后，用0.16mol/L的CaCl2·2H2O清洗2次。該步驟(4)的羧芐青霉素濃度為100mg/L，卡那霉素濃度為50mg/L；在選擇培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)物要每7天繼代一次。它還包括將抗性基因?qū)敫适砑?xì)胞中，以提高甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。
下面結(jié)合較佳實(shí)施例和附圖
進(jìn)一步說明。
2、菌株的活化及菌液的制備將在4℃以下冰箱中保存的農(nóng)桿菌如LBA4404、E小時(shí)A101在固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，使其活化，挑取培養(yǎng)2天的單菌落，在含有50mg/L卡那霉素125mg/L鏈霉素的Liquid Bacterium液體培養(yǎng)基(pH值在6.8～7.4之間)中，250rpm下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為26～30℃、黑暗，培養(yǎng)14～18小時(shí)后，將得到的懸浮培養(yǎng)物在固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，以進(jìn)一步活化獲得農(nóng)桿菌單菌落。培養(yǎng)14～18小時(shí)后，將達(dá)到對(duì)數(shù)生長期的菌液置于離心管中，5000×g下離心5分鐘收集菌體。最后將農(nóng)桿菌懸浮于Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中稀釋OD值為0.5～0.8。
3、侵染和共培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)2-3天的胚性懸浮細(xì)胞用0.45mol/L的甘露醇在室溫下進(jìn)行高滲處理，然后用0.16mol/L的CaCl2·2H2O清洗2次。將預(yù)處理過的懸浮細(xì)胞重新懸浮于制備好的菌液中。低速振蕩10-15分鐘，然后將菌液吸出，將侵染過的懸浮細(xì)胞重新懸浮于含有1.0-3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行共培養(yǎng)3-5天，培養(yǎng)條件為26～30℃、黑暗。
4、選擇培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的胚性懸浮細(xì)胞用無菌水清洗2-3次，再用含有300-500mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基抑菌處理12小時(shí)。將侵染過的胚性懸浮細(xì)胞懸浮于含有1.0-3.0mg/L 2.4-二氯苯氧乙酸、100-300mg/L羧芐青霉素以及50-75mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為26～30℃、每日13小時(shí)、100～500Lx光照。
5、轉(zhuǎn)基因植株再生在選擇培養(yǎng)基中，當(dāng)胚性細(xì)胞團(tuán)長至直徑約0.5-2mm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到含有相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使其增殖形成胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚，培養(yǎng)條件為28℃、黑暗，轉(zhuǎn)移6-8周后，將形成體細(xì)胞胚的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加0.5-1.5mg/L脫落酸、50-75mg/L卡那霉素以及100-300mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog固體培養(yǎng)基上，使體細(xì)胞胚成熟并發(fā)芽，培養(yǎng)條件為26～30℃、每日13小時(shí)、2000～4000Lx光照。4-6周后，將再生的小植株轉(zhuǎn)移到添加50-75mg/L卡那霉素、100-300mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog基本培養(yǎng)基上，使其形成完整的甘薯轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而言所具有的主要優(yōu)點(diǎn)和效果如下1、轉(zhuǎn)化效率高到目前為止的所有報(bào)道，其遺傳轉(zhuǎn)化效率僅為1％～5％，而本發(fā)明的轉(zhuǎn)化效率為53％～79％，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化效率比現(xiàn)有技術(shù)高10-79倍。(轉(zhuǎn)化效率＝獲得轉(zhuǎn)基因植株數(shù)/轉(zhuǎn)化的外植體總數(shù)*100)。
2、適應(yīng)范圍廣本發(fā)明所用的材料是植株再生率高且適用于多種甘薯品種(例如徐薯18、高系14號(hào)、玉豐或新大紫等)的胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系，本發(fā)明的胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)適用于多種甘薯品種，而現(xiàn)有的其他遺傳轉(zhuǎn)化體系僅適用單一或少量甘薯品種(如寶石、白星或高系14號(hào)等)。
3、處理群體大本發(fā)明用甘薯胚性懸浮培養(yǎng)細(xì)胞作為受體，在一個(gè)100ml的三角瓶中一次可處理10,000個(gè)以上的受體，一次可生產(chǎn)大量轉(zhuǎn)基因植株，具有生產(chǎn)效率高和成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。
4、操作比較方便本發(fā)明技術(shù)操作較方便，重復(fù)性好，易于掌握。
5、具有廣泛應(yīng)用性本發(fā)明的方法可將有關(guān)基因?qū)氲礁适碇?，改良其病毒病、線蟲病、蟻象或品質(zhì)等性狀。例如到目前為止，在甘薯中還未發(fā)現(xiàn)抗病毒病或蟻象的材料，利用常規(guī)方法無法解決這些抗性問題，而用本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化方法，可以有效地將抗性基因(如，OC I、CP基因等)導(dǎo)入到甘薯細(xì)胞中，提高甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)造點(diǎn)在于(1)本發(fā)明是本發(fā)明人積二十年的研究和實(shí)踐，首創(chuàng)出的新方法，到目前為止，國內(nèi)外尚無利用胚性懸浮細(xì)胞進(jìn)行甘薯的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
(2)本發(fā)明對(duì)甘薯胚性懸浮細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)方式、共培養(yǎng)時(shí)間、選擇壓、菌株等遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了詳細(xì)的研究，確立了適宜的范圍，建立了甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化體系。
(3)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體系具有轉(zhuǎn)化率高及適應(yīng)范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，適用于甘薯幾乎所有的主栽品種。
實(shí)施例11、OCI(水稻巰基蛋白酶抑制劑)基因的遺傳轉(zhuǎn)化用攜帶OCI基因的農(nóng)桿菌菌株LBA4404(質(zhì)粒pBI121)和甘薯品種栗子香的胚性懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)4-5天。培養(yǎng)條件為26-30℃、黑暗。將共培養(yǎng)后的胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有500mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌處理24小時(shí)。
將轉(zhuǎn)化細(xì)胞(團(tuán))用含有2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、50mg/L卡那霉素和300mg/L羧芐青霉素的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為26-30℃、每日13小時(shí)、100-500Lx、光照。
選擇培養(yǎng)2～4周后，陸續(xù)將直徑約1mm的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到添加2.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、50mg/L卡那霉素和100mg/L羧芐青霉素的MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8-20周，獲得一批卡那霉素抗性愈傷組織。培養(yǎng)條件為26-30℃、黑暗。
將得到的卡那霉素抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加1.0mg/L脫落酸、25-50mg/L卡那霉素和100mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4～6周后，愈傷組織形成了體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚進(jìn)一步發(fā)育成熟并發(fā)芽形成小植株。將得到的小植株進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到添加50mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog基本培養(yǎng)基上，獲得了194株完整植株。培養(yǎng)條件為26-30℃、每日13小時(shí)、2000-4000Lx、光照。
對(duì)得到的194株抗性植株進(jìn)行GUS檢測(cè)、PCR檢測(cè)、Southern雜交等常規(guī)分子檢測(cè)，結(jié)果表明，165株再生植株是轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為85.1％(85.1％＝165/194*100)，詳見表1。
表1 OCI(巰基蛋白酶抑制劑)抗性植株轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn)序數(shù) 卡那霉素抗性 轉(zhuǎn)基因植 轉(zhuǎn)化率 平均轉(zhuǎn)化率植株數(shù) 株數(shù) (％) (％)1 50 38 76.02 62 55 88.7 85.13 82 72 87.8總計(jì) 194165實(shí)施例22、CpTI(豇豆胰蛋白酶抑制劑)基因的遺傳轉(zhuǎn)化用攜帶CpTI基因的農(nóng)桿菌菌株LBA4404(攜帶pBI121質(zhì)粒)和甘薯品種栗子香的胚性懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)4-5天。培養(yǎng)條件為26-30℃、黑暗。將共培養(yǎng)后的胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有500mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌處理24小時(shí)。
將轉(zhuǎn)化細(xì)胞(團(tuán))用含有2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、50-75mg/L卡那霉素和100-300mg/L羧芐青霉素的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為26-30℃、每日13小時(shí)、100-500Lx、光照。
選擇培養(yǎng)4周后，陸續(xù)將直徑約1mm的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到添加2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、50-75mg/L卡那霉素和100-300mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-20周，獲得一批卡那霉素抗性愈傷組織。培養(yǎng)條件為26-30℃，黑暗。
將得到的卡那霉素抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加1.0mg/L脫落酸、50mg/L卡那霉素和100mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4～6周后，愈傷組織形成了體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚進(jìn)一步發(fā)育成熟并發(fā)芽形成小植株。將得到的小植株進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到添加50mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog基本培養(yǎng)基上，獲得了完整再生植株。培養(yǎng)條件為26-30℃、每日13小時(shí)、2000-4000Lx、光照。
對(duì)得到的抗性植株進(jìn)行GUS檢測(cè)、PCR檢測(cè)、Southern雜交等分子檢測(cè)，結(jié)果表明，再生植株的40％～60％是轉(zhuǎn)基因植株。詳見表2。
表2CpTI(豇豆胰蛋白酶抑制劑)抗性植株轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn)序數(shù) 卡那霉素抗性 轉(zhuǎn)基因植 轉(zhuǎn)化率 平均轉(zhuǎn)化率植株數(shù) 株數(shù) (％) (％)1 87 42 48.32 58 34 58.6 51.93 94 48 51.1總計(jì)239 124本發(fā)明通過與上述相同的方法，測(cè)得多種甘薯品種胚性懸浮細(xì)胞的植株再生率，如表3所示。
表3甘薯品種胚性懸浮細(xì)胞的植株再生率甘薯品種 20周32周36周北京553100 80.7-北京138100 - -高自1號(hào)100 98.083.3冀薯4號(hào)100 55.6-金千貫 100 89.184.8高系14號(hào) 100 93.779.2栗子香 100 63.045.8農(nóng)大603100 - -農(nóng)大紅 100 88.768.8沖繩100號(hào) 98.875.1-玉豐 100 95.790.4坦桑尼亞 100 - -向陽紅 100 - -向陽黃 100 58.3-新大紫 100 100 100徐薯18 100 91.887.3一窩紅 100 87.376.5綜上所述，本發(fā)明的方法是本發(fā)明人通過長期的創(chuàng)造性的勞動(dòng)，建立的一種適合多種甘薯品種的胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系，該體系通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生植株，植株再生率均為98％以上，達(dá)到用甘薯胚性懸浮細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體，建立一個(gè)高效及適應(yīng)性廣的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化體系。
本發(fā)明使用常用的兩種培養(yǎng)基MS(Murashige和Skoog)和LB(LuquidBacterium)的組分，詳見附表1和2。
附表1MS(Murashige和Skoog)培養(yǎng)基組分培養(yǎng)基成分 含量(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O 440MgSO4.7H2O 370K2HPO4.H2O 170Na2-EDTA 37.3FeSO4.7H2O 27.8MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6H3BO36.2KI 0.83Na2MoO4.2H2O0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025鹽酸硫胺素VB10.1煙酸 0.5鹽酸吡哆醇VB60.5肌醇 100甘氨酸 1.0蔗糖 30000瓊脂(g)10pH 5.8
附表2LB(Luquid Bacterium)培養(yǎng)基組分培養(yǎng)基組分含量(g/L)蛋白胨 10酵母提取物 5NaCl10瓊脂15pH 7.0
權(quán)利要求
1.一種甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是它包括以下步驟(1)胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立將長0.3-0.5mm的莖尖組織在添加1.0-3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、3.0％蔗糖和0.8％瓊脂的Murashige和Skoog培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為26～30℃，pH5.8，黑暗，培養(yǎng)6-8周后，將誘導(dǎo)得到的胚性愈傷組織破碎成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到含有1.0-3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中，于水平搖床上90～120rpm進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為26～30℃、每日13小時(shí)、100～500Lx光照，懸浮培養(yǎng)物每7-10天繼代1次；(2)菌株的活化及菌液的制備將在4℃以下冰箱中保存的農(nóng)桿菌在固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，使其活化，挑取培養(yǎng)2d的單菌落，在含有50mg/L的卡那霉素和125mg/L的鏈霉素的Liquid Bacterium液體培養(yǎng)基中，250rpm下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為26～30℃、pH值在6.8～7.4之間，黑暗，培養(yǎng)14～18小時(shí)后，將得到的懸浮培養(yǎng)物在固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，以進(jìn)一步活化獲得農(nóng)桿菌單菌落。培養(yǎng)14～18小時(shí)后，將達(dá)到對(duì)數(shù)生長期的菌液置于離心管中，5000×g下離心5min收集菌體，最后將農(nóng)桿菌懸浮于Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中稀釋OD值為0.5～0.8；(3)侵染和共培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)2-3天的胚性懸浮細(xì)胞用0.45mol/L的甘露醇在室溫下進(jìn)行高滲處理，將預(yù)處理過的懸浮細(xì)胞重新懸浮于制備好的菌液中，低速振蕩10-15min，然后將菌液吸出，將侵染過的懸浮細(xì)胞重新懸浮于含有10-3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行共培養(yǎng)3-5天，培養(yǎng)條件為26～30℃，黑暗；(4)選擇培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的胚性懸浮細(xì)胞用無菌水清洗2-3次，再用含有100-500mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基抑菌處理12小時(shí)，將侵染過的胚性懸浮細(xì)胞懸浮于含有1.0-3.0mg/L 2.4-二氯苯氧乙酸、100-300mg/L羧芐青霉素以及50-75mg/L卡那霉素的Murashige和Skoog液體培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為26～30℃，每日13小時(shí)及100～500Lx光照；(5)轉(zhuǎn)基因植株再生在選擇培養(yǎng)基中，當(dāng)胚性細(xì)胞團(tuán)長至直徑約0.5-2mm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到含有相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使其增殖形成胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚，培養(yǎng)條件為28℃、黑暗，轉(zhuǎn)移6-8周后，將形成體細(xì)胞胚的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加0.5-1.5mg/L脫落酸、50-75mg/L卡那霉素以及100-300mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog固體培養(yǎng)基上，使體細(xì)胞胚成熟并發(fā)芽，培養(yǎng)條件為26～30℃、每日13小時(shí)、2000～4000Lx光照；4-6周后，將再生的小植株轉(zhuǎn)移到添加50-75mg/L卡那霉素、100-300mg/L羧芐青霉素的Murashige和Skoog基本培養(yǎng)上，使其形成完整的甘薯轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是該步驟(1)的莖尖組織為帶有1-2片葉原基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是該步驟(1)的2，4-二氯苯氧乙酸濃度為2.0mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是該步驟(2)的農(nóng)桿菌選用LBA4404或EHA101。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是該步驟(3)要求使用懸浮培養(yǎng)12周內(nèi)的懸浮培養(yǎng)物。侵染和共培養(yǎng)中，在進(jìn)行高滲處理后，用0.16mol/L的CaCl2·2H2O清洗2次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是該步驟(4)的羧芐青霉素的濃度為100mg/L，卡那霉素濃度為50mg/L；在選擇培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)物要每7天繼代一次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化方法中，利用胚性懸浮細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體，大大提高轉(zhuǎn)化頻率，從而提高甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。
全文摘要
一種甘薯胚性懸浮細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法，它包括以下步驟(1)胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立、(2)菌株的活化及菌液的制備、(3)侵染和共培養(yǎng)、(4)選擇培養(yǎng)和(5)轉(zhuǎn)基因植株再生，建立了一個(gè)適合多種甘薯品種的胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系，該體系通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生植株，植株再生率均為98％以上，達(dá)到用甘薯胚性懸浮細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體，建立一個(gè)高效及適應(yīng)性廣的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化體系。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1401765SQ0212924
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2002年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者劉慶昌, 翟紅, 鄔莉莎 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)