專利名稱：冰植物的乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是來源于冰植物的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
冰葉松葉菊屬的冰葉日中花，簡稱冰植物(Mesembryanthemum crystallinum)，是一種來源于非洲的草本植物，具有儲(chǔ)存汁液的功能，從分子生物學(xué)的角度研究冰植物的抗逆特性，具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。
本發(fā)明所提供的乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子的名稱為McEREB，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由282個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。所述序列2中自碳端到氮端第137-195個(gè)氨基酸殘基是轉(zhuǎn)錄因子McEREB的ERF功能保守域。
乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子McEREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1205個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)榈?13到第959位堿基，其表達(dá)主要受乙烯、干旱、低溫以及高鹽的瞬時(shí)誘導(dǎo)。
用本發(fā)明所提供的編碼轉(zhuǎn)錄因子McEREB的基因，使用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體轉(zhuǎn)化植株，可獲得對(duì)干旱、低溫和高鹽脅迫耐受力得到增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記。攜帶有本發(fā)明McEREB基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞。
可使用包括本發(fā)明McEREB基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物宿主，既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，培育抗旱、抗寒和抗鹽的植物品種。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤鼓嬷参锲贩N，進(jìn)而改善生態(tài)環(huán)境條件，普及城鄉(xiāng)綠化具有重要意義。
圖2為Southern雜交分析結(jié)果。
圖3為不同脅迫條件下Northern雜交檢測的McEREB基因表達(dá)特征。
取1微克總RNA通過12對(duì)特異簡并性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)(引物中I代表次黃苷)。4條對(duì)應(yīng)于AP2/REBP保守域N-端的5’-YRGVR-3’正向引物(Forward primers)是DF15’-TA(C/T)CGIGGIGTICGI-3’DF25’-TA(C/T)AG(A/G)GGIGTICGI-3’DF35’-TA(C/T)AG(A/G)GGIGTIAG(A/G)-3’
DF45’-TA(C/T)CGIGGIGTIAG(A/G)-3’4條對(duì)應(yīng)于AtERF-1和AtERF-2的AP2/EREBP保守域C-端的反向引物5’-ALLNFP-3’Reverse primers)是DR15’-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAGICGIGC-3’DR25’-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAG(C/T)CTIGC-3’DR35’-IGG(A/G)AA(A/G)TT(T/C)AA(T/C)CTIG C-3’DR45’-IGG(A/G)AA(A/G)TT(T/C)AAICGIGC-3’PCR條件為4℃，3分；94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1.5分，30循環(huán)；72℃，10分；4℃保存。PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上用于測序，再以陽性克隆為模板利用一對(duì)特異性引物DFR5’-CCGGACACCGCGGTAGTG-3’和DRF5’-GCATTGTTGAAC TTTCCG-3’通過逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因的5’端以及3’端。然后體外包裝Invitro-McEREB基因序列，再設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物McF5’-ATGAGCTTAATCG CCAAT-3’McR5’-AGTAACTAATAACTGATC-3’擴(kuò)增McEREB-cDNA，PCR產(chǎn)物連接于pMD18-T載體進(jìn)行測序，得到了一個(gè)與體外包裝序列完全一致的cDNA克隆，命名為McEREB，為序列表中的序列1。該基因插入片段為1205bp，含有846bp的開放閱讀框架(113起始-959終止)，編碼282個(gè)氨基酸殘基組成的多肽(序列表中的序列2)，其5’端為112bp，3’端非編碼區(qū)為282bp。該基因含有一個(gè)典型的AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠與乙烯應(yīng)答元件GCC合子核心的順式作用元件相互作用而啟動(dòng)目的抗逆基因的表達(dá)。
實(shí)施例2、冰植物McEREB基因在大場桿菌中的體外表達(dá)鑒定根據(jù)克隆出的McEREB基因序列，利用一對(duì)特異性引物McF377 5’-AAAAGAATTCCAATCCGGGTCAGAATCC-3’394和McR895 5’-AAAACTCGAGTTGCATTCCCTCCACCAC-3’878，通過PCR得到一段包含AP2/EREBP保守域的cDNA片段(519bp)，并將其插入到蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-1的相應(yīng)EcoRI和XhoI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化該融合表達(dá)載體于大腸桿菌中，經(jīng)IPTG在大腸桿菌中誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測表明該基因能夠在大腸桿菌中進(jìn)行體外翻譯表達(dá)，聚丙烯凝膠電泳譜帶如


圖1所示，M是Marker；1、2是經(jīng)誘導(dǎo)的菌株；3是未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株。從
圖1中可以看出，經(jīng)誘導(dǎo)的菌株有蛋白條帶出現(xiàn)，未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株沒有蛋白條帶出現(xiàn)。
實(shí)施例3、McEREB基因在冰植物中的拷貝數(shù)量分析利用經(jīng)同位素磷-32標(biāo)記的McEREB cDNA編碼區(qū)為探針與經(jīng)不同限制性內(nèi)切酶(EcoRV、PstI、XhoI、SalI)消化的冰植物基因組DNA進(jìn)行Southern雜交分析，并經(jīng)高嚴(yán)謹(jǐn)度洗膜，結(jié)果如圖2所示，除了EcoRV外每一種消化的DNA出現(xiàn)一條雜交帶，表明McEREB基因是一個(gè)單拷貝基因或者在基因組中有低拷貝的同源基因。
實(shí)施例4、冰植物McEREB基因在逆境脅迫條件下的表達(dá)特征。
生長2個(gè)星期的冰植物幼苗分別置于4℃水、250mM NaCl的水溶液以及2mM的乙烯溶液中進(jìn)行光照培養(yǎng)，干旱處理是將生長2個(gè)星期的冰植物幼苗經(jīng)水洗凈后置于足以吸干水分的濾紙上在室溫下脫水，并分別在1小時(shí)，5小時(shí)，12小時(shí)以及24小時(shí)取樣，提取總RNA與McEREB cDNA探針進(jìn)行Northern雜交檢測分析。結(jié)果如圖3所示，其中A是干旱處理的結(jié)果，B是4℃低溫處理的結(jié)果，C是250mM NaCl處理的結(jié)果，D是2mM乙烯處理的結(jié)果，從圖3中可以看出，基因McEREB的轉(zhuǎn)錄主要受乙烯與鹽誘導(dǎo)，并不同程度受干旱以及低溫的瞬時(shí)誘導(dǎo)。
序列表<160>2<210>1<211>1205<212>DNA<213>冰葉松葉菊屬冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)<400>1cttacgtgaa acaaaattca attcaaattc aacggcttta agctgaaatt tgcgatacgc 60aattcaaaat ttacattttt gagctgaatt cgccaatact cagttggtaa agatgagctt 120aatcgccaat ttcgagtctg attttgctgt tcttgagtcg attcgacgac acttgttaga 180agattgggac ccacgagccg gagctccggc gataaccacc ggatccggcc cggtttatca 240ccggaattcg agcttcagca gcttataccc ttgtttgact gataactggg gtgagttgcc 300attgaaagaa gatgattcag aggatatggt tctttttggt gtgctccgag acgccgttca 360taccgggtgg tcgccgcaat ccgggtcaga atccgggtcc gggtctccgg cgccggtgac 420ggtcaagcct gagccggtcg attctccggt gagttcgccg gcgccggtta gggtcgccgg 480cggtgaggct ccggtggccg cagctccggc gagggggaag cactaccgcg gtgtccggag 540gaggccgtgg gggaagttcg cggctgagat ccgcgaccct gcgaagaacg gagcgcgtgt 600gtggctcgga acatttgaga cggcggagga cgcggcgttg gcctatgaec gggccgcctt 660ccggatgcgg gggtccaagg cattgttgaa ctttccgctc cgggtcaact cgggcgagcc 720cgacccggtc cggattacgt cgaagcggtc ctcgcccgag aggtccgtgt cgtcttcgtc 780gtcggaaagc gcctcgccta agaggaggaa gaaggaggag gtggtggttg ggccggtggc 840gggccaggcc aggccaggct tacaacaagt gggaaatgtg gtggagggaa tgcaagtggg 900agtgggatgt caagttggtg tggggacaat gccacttggc gatcagttat tagttactta 960agatattata aaaaaacaaa aaaaggaaag ggggtttgaa agaatggaat tctcattggg 1020gggaaaggtg atggccctta taaaaaaaac ctttcctggt ctcttaatga aaggccgctt 1080ttagggcagc acaaatcctc tgctagcaga gaattcggca cgaggctctg ctccatggag 1140tagtaggaat aaacactgtg ctagccggct aggtattggt gcaagtgcaa aaaaaaaaaa 1200aaaaa 1205<210>2<211>282<212>PRT<213>冰葉松葉菊屬冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)<400>2Met Ser Leu Ile Ala Asn Phe Glu Ser Asp Phe Ala Val Leu Glu5 10 15Ser Ile Arg Arg His Leu Leu Glu Asp Trp Asp Pro Arg Ala Gly20 25 30Ala Pro Ala Ile Thr Thr Gly Ser Gly Pro Val Tyr His Arg Asn35 40 45Ser Ser Phe Ser Ser Leu Tyr Pro Cys Leu Thr Asp Asn Trp Gly50 55 60Glu Leu Pro Leu Lys Glu Asp Asp Ser Glu Asp Met Val Leu Phe65 70 75Gly Val Leu Arg Asp Ala Val His Thr Gly Trp Ser Pro Gln Ser80 85 90Gly Ser Glu Ser Gly Ser Gly Ser Pro Ala Pro Val Thr Val Lys95 100 105Pro Glu Pro Val Asp Ser Pro Val Ser Ser Pro Ala Pro Val Arg110 115 120Val Ala Gly Gly Glu Ala Pro Val Ala Ala Ala Pro Ala Arg Gly125 130 135Lys His Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Pro Trp Gly Lys Phe Ala140 145 150Ala Glu Ile Arg Asp Pro Ala Lys Asn Gly Ala Arg Val Trp Leu155 160 165Gly Thr Phe Glu Thr Ala Glu Asp Ala Ala Leu Ala Tyr Asp Arg170 175 180Ala Ala Phe Arg Met Arg Gly Ser Lys Ala Leu Leu Asn Phe Pro185 190 195Leu Arg Val Asn Ser Gly Glu Pro Asp Pro Val Arg Ile Thr Ser200 205 210Lys Arg Ser Ser Pro Glu Arg Ser Val Ser Ser Ser Ser Ser Glu215 220 225Ser Ala Ser Pro Lys Arg Arg Lys Lys Glu Glu Val Val Val Gly230 235 240Pro Val Ala Gly Gln Ala Arg Pro Gly Leu Gln Gln Val Gly Asn245 250 255Val Val Glu Gly Met Gln Val Gly Val Gly Cys Gln Val Gly Val260 265 270Gly Thr Met Pro Leu Gly Asp Gln Leu Leu Val Thr275 280 28權(quán)利要求
1.乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子McEREB，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于所述序列2中自氮端到碳端第137-195個(gè)氨基酸殘基是轉(zhuǎn)錄因子McEREB的ERF功能保守域。
4.乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子McEREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子McEREB的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第113到第959位堿基。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的表達(dá)載體。
8.含有權(quán)利要求4所述基因的細(xì)胞系。
9.權(quán)利要求4所述基因在培育抗逆境植物品種中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述逆境為旱害、寒害和鹽害。
全文摘要
本發(fā)明公開了冰植物的乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，其目的是提供來源于冰植物的具有較強(qiáng)的抗逆以及抗病效果的乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。本發(fā)明所提供的乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子的名稱為McEREB，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。McEREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤鼓嬷参锲贩N，進(jìn)而改善生態(tài)環(huán)境條件，普及城鄉(xiāng)綠化具有重要意義。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1475495SQ0212881
公開日2004年2月18日 申請(qǐng)日期2002年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月14日
發(fā)明者侯玉霞, 程憲國, 劉強(qiáng) 申請(qǐng)人:清華大學(xué)