本發(fā)明屬于體外細胞培養(yǎng)
技術領域：
，涉及一種無血清的淋巴細胞培養(yǎng)基。
背景技術：
：淋巴細胞是用于細胞免疫治療的重要載體。淋巴細胞的體外培養(yǎng)、擴增和活化離不開優(yōu)良的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為淋巴細胞的生長提供了基本的環(huán)境，包括為淋巴細胞存活提供適宜的滲透壓，pH值，為淋巴細胞的生長提供了一切所需的營養(yǎng)因子，包括無機鹽、氨基酸、功能性的蛋白、維生素等，也是淋巴細胞各種代謝產(chǎn)物的排放場所。傳統(tǒng)的培養(yǎng)基為了提供這些營養(yǎng)因子，大多采用動物或人的血清及其組分作為添加物，比較常見的有新生牛血清、胎牛血清、人AB血清、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人轉鐵蛋白等。使用動物血清的優(yōu)點是有足夠的量供應，價格便宜，但是使用動物血清的缺點是有潛在傳播傳染病的風險，以及由于異種蛋白導致過敏癥的發(fā)生，而且動物血清并不能很好的支持人淋巴細胞的生長。而使用人AB血清的好處是可以很好的支持人淋巴細胞的生長，但是人AB血清來源困難，供應量有限，而且也存在傳播傳染病的風險?，F(xiàn)有商品化無血清淋巴細胞培養(yǎng)基大都添加有人血白蛋白、人轉鐵蛋白等人源性組分。由于這些組分來源于人的血清，雖然有各種病原體的檢測技術和消毒技術，但仍然避免不了傳播疾病的風險；由于來源于不同的供者，造成批次間差異，不利于質(zhì)量的控制。中國專利CN102352343B公布了一種淋巴細胞培養(yǎng)基及其使用方法，該淋巴細胞培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基以及血清替代物，所述血清替代物包括重組人血白蛋白、重組人轉鐵蛋白以及重組人胰島素，用以解決現(xiàn)有淋巴細胞培養(yǎng)基大多采用動物或人的血清及其組分作為添加物，增加了傳播疾病的風險，同時不同批次，質(zhì)量無法統(tǒng)一的問題。但是在使用培養(yǎng)基時依舊需要加入2％的淋巴細胞自體血清才能有更好的效果，未能從根本上解決上述問題。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題在于現(xiàn)有淋巴細胞培養(yǎng)基大多采用動物或人的血清及其組分作為添加物，增加了傳播疾病的風險和不同批次質(zhì)量無法統(tǒng)一的問題，并針對該問題提供了一種更為有效的無添加血清的淋巴細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明通過以下技術方案解決上述技術問題：一種無血清添加的淋巴細胞培養(yǎng)基，包括DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：人轉鐵蛋白1～10μg/mL，胰島素樣生長因子10～100ng/mL，表皮生長因子10～50ng/mL，亞硒酸鈉0.1-1mg/L，硫酸銅1-5mg/L，硫酸鋅0.1-5mg/L，生物素1-50ng/mL和慶大霉素1IU/ml-15IU/ml。優(yōu)選地，所述無血清淋巴細胞培養(yǎng)基，由DMEM基礎培養(yǎng)基及以下組分及其濃度組成：人轉鐵蛋白8μg/mL，胰島素樣生長因子30ng/mL，表皮生長因子15g/mL，亞硒酸鈉0.5mg/L，硫酸銅3.5mg/L，硫酸鋅2mg/L，生物素25ng/mL和慶大霉素7IU/ml。優(yōu)選地，所述DMEM培養(yǎng)基為高糖型。優(yōu)選地，所述胰島素樣生長因子胰島素樣生長因子-I。人轉鐵蛋白的主要作用是向細胞內(nèi)轉運鐵(Fe3+)，幾乎所有的細胞生長都離不開對鐵的需求。胰島素樣生長因子是一類多功能細胞增殖調(diào)控因子，在細胞的分化、增殖、個體的生長發(fā)育中具有重要的促進作用。表皮生長因子是最早發(fā)現(xiàn)的生長因子，對調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和分化起著重要作用。鋅、硒、銅等是細胞內(nèi)許多酶的活性中心，也需要以合適的形式補充到培養(yǎng)基中，本發(fā)明向基礎培養(yǎng)基中添加化合物亞硒酸鈉、硫酸銅以及硫酸鋅，以向細胞提供鋅、硒以及銅。生物素又名維生素H、輔酶R等，是脂肪和蛋白質(zhì)正常代謝不可或缺的物質(zhì)。一種無血清淋巴細胞培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：向DMEM基礎培養(yǎng)基中，按所述濃度加入人轉鐵蛋白，胰島素樣生長因子，表皮生長因子，亞硒酸鈉，硫酸銅，硫酸鋅，生物素，混勻，利用2mol/LNa2CO3或HEPES調(diào)整培養(yǎng)基pH為7.2，過膜除菌即得。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：(1)本發(fā)明提供的無血清的淋巴細胞培養(yǎng)基，有效解決了現(xiàn)有淋巴細胞培養(yǎng)基大多采用動物或人的血清及其組分作為添加物，具有傳播疾病的風險，不同批次質(zhì)量無法統(tǒng)一的問題；(2)實驗證明，本發(fā)明培養(yǎng)基與對比例培養(yǎng)基相比，淋巴細胞的擴增能力和殺瘤活性更強，分別提高了94％，17.6％，證明使用本發(fā)明所述淋巴細胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)人淋巴細胞的效果優(yōu)于現(xiàn)有的血清替代物的淋巴細胞培養(yǎng)基。具體實施方式以下以具體實施例來說明本發(fā)明的技術方案，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。實施例1一種無血清淋巴細胞培養(yǎng)基一種無血清淋巴細胞培養(yǎng)基，包括DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：人轉鐵蛋白1μg/mL，胰島素樣生長因子10ng/mL，表皮生長因子10ng/mL，亞硒酸鈉0.1mg/L，硫酸銅1mg/L，硫酸鋅0.1mg/L，生物素1ng/mL和慶大霉素1IU/ml。制備方法，包括如下步驟：向DMEM基礎培養(yǎng)基中，按所述濃度加入人轉鐵蛋白，胰島素樣生長因子，表皮生長因子，亞硒酸鈉，硫酸銅，硫酸鋅，生物素，混勻，利用2mol/LNa2CO3或HEPES調(diào)整培養(yǎng)基pH為7.2，過膜除菌即得。實施例2一種無血清淋巴細胞培養(yǎng)基一種無血清淋巴細胞培養(yǎng)基，包括DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：人轉鐵蛋白10μg/mL，胰島素樣生長因子100ng/mL，表皮生長因子50ng/mL，亞硒酸鈉1mg/L，硫酸銅5mg/L，硫酸鋅5mg/L，生物素50ng/mL和慶大霉素15IU/ml。制備方法與實施例1類似實施例3一種無血清淋巴細胞培養(yǎng)基一種無血清淋巴細胞培養(yǎng)基，包括DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：人轉鐵蛋白8μg/mL，胰島素樣生長因子30ng/mL，表皮生長因子15ng/mL，亞硒酸鈉0.5mg/L，硫酸銅3.5mg/L，硫酸鋅2mg/L，生物素25ng/mL和慶大霉素7IU/ml。制備方法與實施例1類似對比例1一種無血清淋巴細胞培養(yǎng)基無血清淋巴細胞培養(yǎng)基，包括DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：人轉鐵蛋白8μg/mL，胰島素樣生長因子30ng/mL，表皮生長因子15ng/mL，亞硒酸鈉0.5mg/L，硫酸銅3.5mg/L，硫酸鋅2mg/L，維生素D25ng/mL和慶大霉素7IU/ml。與實施例3區(qū)別在于，將生物素替換為維生素D。制備方法與實施例1類似。試驗一、淋巴細胞增殖實驗和存活率1.試驗對象：實施例1-3制備得到的無血清添加的淋巴培養(yǎng)基與對比例1制備得到的淋巴細胞培養(yǎng)基。2.試驗方法：使用淋巴細胞分離液密度梯度離心分離外周血單個核細胞，或者復蘇凍存的單個核細胞。加入含5％熱滅活胎牛血清(FBS)生理鹽水300g離心10分鐘，去除上清液。計數(shù)細胞，用相應的培養(yǎng)基配成1*106/ml細胞懸液，培養(yǎng)基使用前加入谷氨酰胺300mg。分為6組，各組所用培養(yǎng)基如表1所示。按每孔加入2ml培養(yǎng)基接入6孔板，每組3個復孔。第1天加入1000IU/mlIFN-r，培養(yǎng)24小時后加入50ng/mlCD3單抗(OKT3)300IU/mlIL-2，100IU/mlIL-1a。以后每3天計數(shù)，補加含300IU/mLIL-2培養(yǎng)液至1*106/ml。培養(yǎng)15天，臺酚藍染色計算細胞增殖倍數(shù)和存活率。3.試驗結果：結果如表1所示：表1淋巴細胞增殖倍數(shù)和存活率由表1可知，實施例1-3培養(yǎng)基效果明顯好于對比例1培養(yǎng)基，其中實施例3培養(yǎng)基效果最好，與對比例1培養(yǎng)基相比，淋巴細胞的擴增能力提高了94％。試驗二、淋巴細胞毒性實驗1.試驗對象：實施例1-3配制得到的無血清添加的淋巴培養(yǎng)基與對比例1配制得到的淋巴細胞培養(yǎng)基。2.試驗方法：取培養(yǎng)15天的CIK細胞為效應細胞，以K562細胞為靶細胞，按效靶比10∶1接種到96孔板內(nèi)，每個孔板內(nèi)加有不同的培養(yǎng)基，37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時。用MTT法測吸光度值，計算殺瘤率。殺瘤率％＝1-(試驗孔-效應細胞孔)/靶細胞孔3.試驗結果：淋巴細胞毒性實驗結果如下表2所示：表2淋巴細胞毒性實驗結果培養(yǎng)基殺瘤率(％)實施例172實施例276實施例380對比例160由表2可知，實施例1-3培養(yǎng)基淋巴細胞毒性試驗效果明顯好于對比例1培養(yǎng)基，其中實施例3培養(yǎng)基效果最好，與對比例1培養(yǎng)基相比，淋巴細胞的殺瘤率提高了17.6％。上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬
技術領域：
中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權利要求所涵蓋。當前第1頁1 2 3