一種頭花蓼中黃酮苷活性組分的制備及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種頭花蓼黃酮苷活性組分的制備方法，通過將頭花蓼粉碎，甲醇浸提，抽濾濃縮，先經(jīng)硅膠色譜開口柱分離，再通過十八烷基鍵合硅膠開口柱純化獲得，此組分主要成分為五個(gè)黃酮苷化合物。本發(fā)明建立了抑制疫霉無性孢子囊產(chǎn)生的生物活性系統(tǒng)，并通過該系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)這種頭花蓼黃酮苷組分和其中五個(gè)黃酮苷化合物均能顯著抑制疫霉無性孢子囊的產(chǎn)生。本發(fā)明提供的頭花蓼黃酮苷活性組分可在制備防治植物疫霉病的農(nóng)藥中應(yīng)用。本發(fā)明制備方法簡單，提取的產(chǎn)物純度高，且頭花蓼為易得便宜的中藥，增加了頭花蓼的藥物用途，為抗疫霉菌農(nóng)藥的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種頭花蓼中黃酮苷活性組分的制備及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及花寥中黃酮苷活性組分，尤其涉及花寥中黃酮苷活 性組分的制備方法及在制備抗疫霉病農(nóng)藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)聯(lián)合國數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界人口正在逐年增加，預(yù)計(jì)到2050年世界人口將增長到8.9 億，而有效耕地面積在不斷減少，因此需要在較少的耕地面積上生產(chǎn)出更多的食物來避免 大范圍饑餓。在影響作物生產(chǎn)的眾多威脅中，植物病害的發(fā)生頻率高、造成的損失也最為嚴(yán) 重。其中疫霉菌可引起世界上最具有毀滅性的植物病害，不僅危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，而且破壞自然 生態(tài)系統(tǒng)。另外，化學(xué)農(nóng)藥長期而廣泛的應(yīng)用使得大多數(shù)疫霉菌對許多殺菌劑產(chǎn)生了嚴(yán)重 的耐藥性。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)新的抗疫霉菌活性物質(zhì)已成為急需解決的問題。
[0003] 目前，抗疫霉菌活性物質(zhì)的研究主要集中在抑制菌絲生長和游動(dòng)孢子萌發(fā)兩方 面，對具有抑制疫霉菌無性生殖階段孢子囊產(chǎn)生的活性物質(zhì)的研究極少。而孢子囊的產(chǎn)生 是疫霉菌無性生殖階段的關(guān)鍵時(shí)期，其產(chǎn)生的游動(dòng)孢子是疫霉菌蔓延的基礎(chǔ)，因此尋找具 有抑制無性孢子囊產(chǎn)生的天然活性物質(zhì)，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的作用靶點(diǎn)，有助于緩解或解決當(dāng) 前日益嚴(yán)重的耐藥性，推動(dòng)植物疫病防治藥物的開發(fā)與利用。
[0004]頭花寥(Polygonum capitatum)屬于寥科多年生草本植物，是我國著名的藥用植 物。它的藥用價(jià)值也已有研究:頭花寥提取物及其在降血糖藥物中的應(yīng)用;頭花寥提取物在 美白用品中的應(yīng)用及美白用品；具有抗炎作用的熱淋清顆粒原料頭花寥提取物;具有抗淋 球菌作用的熱淋清顆粒原料頭花寥提取物；用于預(yù)防或治療青春痘的頭花寥組合物；用于 治療或預(yù)防口腔疾病的頭花寥組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種頭花寥中黃酮苷活性組分，該組分主要包含五個(gè)黃酮苷 化合物，所述頭花寥黃酮苷活性組分通過以下步驟制備獲得：
[0006] (1)粉碎和浸提：
[0007] 將頭花寥粉碎后，用工業(yè)級(jí)甲醇溶液在室溫下浸提2次，每次1天，抽濾濃縮，得甲 醇浸提物粗樣，用乙酸乙酯和水萃取分離，靜置，將乙酸乙酯層減壓濃縮旋干后，得到乙酸 乙酯層粗樣；
[0008] (2)分離和純化：
[0009] 將乙酸乙酯層粗樣先經(jīng)硅膠開口柱分離（200-300目，溶劑系統(tǒng)為正己烷：二氯甲 烷、二氯甲烷：乙酸乙酯和甲醇），再進(jìn)一步通過十八烷基鍵合硅膠開口柱分離(溶劑系統(tǒng)為 甲醇：水），得到兩個(gè)黃酮苷活性組分（洗脫體系分別為40%甲醇水溶液和50%甲醇水溶 液），兩個(gè)活性組分再分別經(jīng)十八烷基鍵合硅膠開口柱分離(溶劑系統(tǒng)為甲醇:水），得到較 純的黃酮苷活性組分，然后再分別用反相HPLC純化，流動(dòng)相為甲醇水溶液，最終得到五個(gè)黃 酮苷化合物；五個(gè)化合物分別是myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside，quercetin 3-〇- iM)-glucopyranoside，quercetin 4 '-Ο-α-L-rhamnopyranoside，quercetin 3-〇-a-(2''_ galloyl)rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L_rhamnopyranoside〇
[0010] 所述步驟(2)中正己烷:二氯甲烷溶劑系統(tǒng)按體積比為：100:0，90:10，70:30，50: 50，30:70，10:90，0:100;隨后二氯甲烷：乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)按體積比為：90:10，70:30，50: 50,30:70,0:100;最后為甲醇。
[0011] 步驟(2)中第一次十八烷基鍵合硅膠開口柱純化的甲醇:水溶劑系統(tǒng)按體積比為： 30:70,35:65,40:60,50:50,60:40,70:30,90:10,100:0。
[0012] 步驟(2)中第二次十八烷基鍵合硅膠開口柱純化的甲醇:水溶劑系統(tǒng)按體積比分 別為：30:70,50:50和30:70,35:65,60:40。
[0013] 步驟(2)中HPLC純化的色譜柱和流動(dòng)相分別為CAPCELL PAKC18，甲醇:水=38:62 和Develos i 1 C30-UG-5，甲醇：水=48:52 〇
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的黃酮苷活性組分在制備抗疫霉菌農(nóng)藥中的應(yīng) 用，所述黃酮苷活性組分主要包括五個(gè)黃酮苷化合物。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)此活性組分及化合 物在抗疫霉菌化合物的篩選模型中，可以顯著抑制疫霉菌無性孢子囊的產(chǎn)生，從而達(dá)到抑 制疫霉菌蔓延的效果。本發(fā)明所述藥物是以黃酮苷活性組分或五個(gè)黃酮苷化合物為活性成 份，與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑制備而成。
[0015] 本發(fā)明的藥物劑型選用固體制劑或液體制劑。
[0016] 本發(fā)明提供的頭花寥黃酮苷類組分及五個(gè)黃酮苷化合物在辣椒疫霉中表現(xiàn)出顯 著的抑制疫霉菌無性孢子囊產(chǎn)生的活性。本發(fā)明制備方法簡單，提取的產(chǎn)物純度高，且頭花 寥為易得便宜的中藥，為抗疫霉菌藥物的研發(fā)提供基礎(chǔ)性研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1是黃酮苷混合物A2、B2對疫霉菌無性孢子囊產(chǎn)生的抑制作用。
[0018] 圖2是五個(gè)黃酮苷化合物對疫霉菌無性孢子囊產(chǎn)生的抑制作用。圖中l(wèi):myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside，2:quercetin 3-〇-0-D_glucopyranoside，3:quercetin 4'-〇-a-L_rhamnopyranoside，4:quercetin 3_〇-a-(2''-galloyl)rhamnoside，5:kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside〇
[0019] 圖3是五個(gè)黃酮苷化合物抑制疫霉菌無性孢子囊的產(chǎn)生的顯微圖片。圖中a為陰性 對照：0 · 2%DMS0，b為陽性對照：甲霜靈（30yg/mL)，cSmyricetin7-0-a-L-rhamnopyranoside(30yM)d,quercetin 3-〇-0-D-glucopyranoside(3OyM)e,quercetin 4'-〇-a-L-rhamnopyranoside(3yM)f,quercetin 3_〇-a-(2"-ga11oy1)rhamnoside(3yM)g， kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside(10μΜ)〇
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述 主題的范圍僅限于下述的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范 圍。
[0021 ]實(shí)施例1從頭花寥中分離提取黃酮苷類組分及五個(gè)黃酮苷化合物的制備方法 [0022] (1)粉碎和浸提：
[0023] 取250g干燥的頭花寥粉碎后，用2.5L甲醇(工業(yè)級(jí))室溫下浸提2次，每次1天，抽濾 濃縮，得甲醇浸提物粗樣，用乙酸乙酯和水萃取分離，靜置，將乙酸乙酯層減壓濃縮旋干后， 得到乙酸乙酯層粗樣9g。
[0024] (2)分離和純化：
[0025]將乙酸乙酯層粗樣先經(jīng)硅膠開口柱分離（200-300目，以下溶劑系統(tǒng)按體積比，正 己烷:二氯甲烷溶劑系統(tǒng)按體積比為：100:0，90:10,70:30,50:50，30:70,10:90，0:100;隨 后二氯甲烷：乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)按體積比為 :90:10,70:30,50:50,30:70,0:100;最后為甲 醇）；將活性樣品再用0DS開口柱分離(溶劑系統(tǒng)按體積比為甲醇：水=0:70，35:65，40:60， 50:50,60:40,70:30,90: 10,100:0);得到兩個(gè)黃酮苷類混合物Al(975.7mgWPBl (267.4mg)，然后A1和B1分別用0DS開口柱分離（溶劑系統(tǒng)按體積比分別為甲醇：水為：30: 70，50 : 50和30 : 70，35 : 65，60 : 40 )，得到純度較高黃酮苷混合物A2 (129 · 4mg)和B2 (139 · 9mg)。取A2 50mg用HPLC純化，色譜條件:色譜柱PAKC18( 10/250mm)，流速3ml/min，檢測 波長210nm，流動(dòng)相為為甲醇：水= 38:62,得到化合物11171'；[061:;[117-0-€[-1-rhamnopyranoside(2 · 7mg，保留時(shí)間為19 · 5min)，quercetin 3-0-0-D_glucopyranoside (2.6mg,保留時(shí)間為25.3min)，quercetin 4'-0-a-L-rhamnopyranoside(35.8mg,保留時(shí)間 為38.0111丨11);取82 2011^用冊1^：純化，色譜條件：色譜柱030-1^-5(10/250_)，流速31111/1^11， 檢測波長210nm，流動(dòng)相為為甲醇:水=48:52，得到化合物quercetin 3-0-a-(2"_galloyl) rhamnoside (5 · 3mg，保留時(shí)間為54 · 8min)，kaempferol 3-0-a-L-rhamnopyranoside (2.5mg，保留時(shí)間為60.6min)。五個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)式如下：
[0027] 實(shí)施例2
[0028]對實(shí)施例1 所得化合物myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside，quercetin 3-〇_ iM)-glucopyranoside，quercetin 4 '-Ο-α-L-rhamnopyranoside，quercetin 3-〇-a-(2''_ galloyl )rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside的理化特征及化學(xué)結(jié)構(gòu) 的定性鑒定：
[0029] 化合物myricetin 7-〇-a-L-rhamnopyranoside，quercetin 3-〇-0_D-glucopyranoside, quercetin 4'-〇-a-L_rhamnopyranoside，quercetin 3_〇-a-(2"-galloyl)rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L_rhamnopyranoside的結(jié)構(gòu)經(jīng) 1H NMR、MS和文 獻(xiàn)比對確定
[0030] 化合物myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside的理化性質(zhì)：棕黃色固體，分子式 為C2iH2〇Oi2;ESI-TOF-MS :m/z 465 · 1027(M+H).，氫譜數(shù)據(jù)：咕 NMR(500MHz，CD30D): δ = 6 · % (s,2H),6.37(d,lH,J = 2.0Hz) ,6.20(d,lH,J = 2.0Hz) ,5.31(d,lH,J = 1.5Hz) ,4.22(dd, 1H,J = 3,1.5Hz) ,3.79(dd,lH,J = 9.0,3.0Hz) ,3.52(m,lH) ,3.32(m,lH) ,0.96(d,3H,J = 6.5Hz)〇
[0031 ] 化合物quercetin 3_CHH)-glucopyranoside的理化性質(zhì)：棕黃色固體，分子式為 C2iH2〇Oi2; ESI-TOF-MS: m/z 465 · 1027 (M+H) +，氫譜數(shù)據(jù)：咕 NMR( 500MHz，CD30D): δ = 7 · 70 (d， 1H, J = 2.0Hz) ,7.58(dd,lH, J = 8.5,2.0Hz) ,6.86(d, lH,J = 8.5Hz) ,6.19(d, 1H, J = 2.0Hz),6.38(d,lH ,J = 2.0Hz),5.22(d,lH ,J = 8.0Hz),3.47-3.20(m,4H),3.70(dd,lH ,J = 12.0,2.5Hz),3.57(dd,lH ,J = 13.0,6.0Hz)〇
[0032] 化合物quercetin 4'-〇-a-L-rhamnopyranoside的理化性質(zhì)：棕黃色固體，分子式 為C2iH2〇Oii;ESI-TOF-MS:m/z 449 · 1114(M+H) +，氫譜數(shù)據(jù)：咕 NMR(500MHz，CD30D): δ = 7 · 33 (d,lH,J=1.5Hz) ,7.30(dd,lH,J = 8.0,1.5Hz) ,6.90(d,lH,J = 8.0Hz) ,6.18(d,lH,J = 2.0Hz) ,6.35(d,lH,J = 2.0Hz) ,5.34(s,lH) ,4.21(s,lH) ,3.39(m,lH) ,3.73(dd,lH,J = 9.5,3.0Hz)，3.43(m，lH)，0.93(d，3H，J = 6.0Hz)。
[0033] 化合物quercetin 3-〇_a-(2"-galloyl)rhamnoside的理化性質(zhì)：黃色固體，分子 式為〇281124〇15$51-1'(^-]\^ :111/2 601.1179(]\1+!〇 +，氫譜數(shù)據(jù)：1!1匪1?(50冊!^，0)3〇0):3 = 7.36(d，lH，J = 2.0Hz)，7.34(dd，lH，J = 8.5,2.0Hz)，，7.07(s，2H)，6.93(d，lH，J = 85Hz)， 6.18(d，lH，J = 2.0Hz)，6.36(d，lH，J = 2.0Hz)，5.63(dd，lH，J = 3.5,2.0Hz)，5.50(d，lH，J = 1.5Hz)，4.01(m，lH)，3.47(m，2H)，1.03(d，3H，J = 6.0Hz)。
[0034] 化合物kaempferol 3-〇-a-L_rhamnopyranoside的理化性質(zhì)：棕黃色固體，分子式 為C21H20O10; ESI-T0F-MS:m/z 443 · 1125 (M+H) +，氫譜數(shù)據(jù)：咕 NMR( 500MHz，CD30D): δ = 7 · 77 (d,lH,J = 8.5Hz) ,6.93(d,lH,J = 8.5Hz),6.18(d,lH,J = 2.0Hz),6.35(d,lH,J = 2.0Hz), 5.37(d,lH ,J=1.5Hz) ,4.21 (dd, 1H ,J = 3.0,1.5Hz), 3.70(dd, 1H, J = 9.0,3.5Hz), 3.33-3.16(m，2H)，0.92(d，3H，J = 5.5Hz)。
[0035] 實(shí)施例3
[0036] 黃酮苷類組分及五個(gè)黃酮苷化合物在抗疫霉菌篩選模型中，顯著抑制疫霉菌無性 孢子囊的產(chǎn)生。
[0037] 目前抗疫霉菌活性物質(zhì)的研究主要集中在抑制菌絲生長和游動(dòng)孢子萌發(fā)兩方面， 對具有抑制疫霉菌無性生殖階段孢子囊產(chǎn)生的活性物質(zhì)的研究極少。甲霜靈是目前在防治 植物疫病上面被最廣泛應(yīng)用的一種農(nóng)藥，可強(qiáng)烈抑制疫霉菌絲體的生長和無性孢子囊的產(chǎn) 生。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)頭花寥黃酮苷類混合物及五個(gè)黃酮苷化合物在辣椒疫霉模型中，顯著疫霉 菌無性孢子囊的產(chǎn)生。
[0038] 1.實(shí)驗(yàn)方法：
[0039] (1)從10°C生化培養(yǎng)箱取出辣椒疫霉菌株，復(fù)蘇到25°C，取一小塊接種到20ml固體 培養(yǎng)皿（10%的V8 juice，0.02%的碳酸鈣，2%的瓊脂粉）中。25°C避光培養(yǎng)3-4d備用。
[0040] (2)?。?加：[06 501111^，碳酸|丐0.28，于離心管中混勾，離心15111；[11(40001'/111；[11)，得到 V8juice上清液。
[0041] (3)取出在生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3-4d的固體平板，用打孔器在菌絲邊緣切下直 徑為6mm的菌塊，放在已滅菌的直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中心，然后加入1 OmL液體培養(yǎng)基（3 %的 V8juice上清液），放于25°C生化培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。48h后，除去培養(yǎng)基，并加入10mL無菌水/ 皿。樣品加入時(shí)，先將樣品別用20yL DMS0溶解，然后用移液槍吸取培養(yǎng)皿中的無菌水980L， 加入到樣品溶液中，混勻后再均勻加入到培養(yǎng)皿中。測定中以〇. 2%DMS0為陰性對照，以30μ g/mL的甲霜靈為陽性對照。經(jīng)過16-24h的避光培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡下觀察疫霉菌無性孢子 囊產(chǎn)生的情況并懸浮計(jì)數(shù)(10倍目鏡，4倍物鏡)統(tǒng)計(jì)，然后計(jì)算其抑制率。
[0042] 抑制率（％) = (Nd-Ns)/NcX100%
[0043] Nd:陰性對照組單位體積內(nèi)產(chǎn)生的無性孢子囊數(shù);Ns:樣品組單位體積內(nèi)產(chǎn)生的無 性孢子囊數(shù)。
[0044] 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0045] 在3yg/mL濃度下的黃酮苷類混合物A2和B2對疫霉菌無性孢子囊產(chǎn)生的抑制率分 別為88%和98% (圖1)。五個(gè)黃酮苷化合物分別在3(^11、3(^1、3以1、3以1、1(^1的濃度下對疫 霉菌無性孢子囊產(chǎn)生的抑制率為74%、65%、86%、78%、90% (圖2)及相應(yīng)的顯微圖片（圖 3)〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種頭花寥中黃酮苷活性組分，該組分主要包含五個(gè)黃酮苷化合物，其特征在于，所 述頭花寥中黃酮苷活性組分通過以下步驟制備獲得： (1) 粉碎和浸提： 將頭花寥粉碎后，用工業(yè)級(jí)甲醇溶液在室溫下浸提2次，每次1天，抽濾濃縮，得甲醇浸 提物粗樣，用乙酸乙酯和水萃取分離，靜置，將乙酸乙酯層減壓濃縮旋干后，得到乙酸乙酯 層粗樣； (2) 分離和純化： 將乙酸乙酯層粗樣先經(jīng)硅膠開口柱分離，分離條件:200-300目，溶劑系統(tǒng)為正己烷:二 氯甲烷、二氯甲烷：乙酸乙酯和甲醇，再進(jìn)一步通過十八烷基鍵合硅膠開口柱分離，溶劑系 統(tǒng)為甲醇：水，在洗脫體系分別為40 %甲醇水溶液和50 %甲醇水溶液時(shí)得到兩個(gè)黃酮苷活 性組分，兩個(gè)黃酮苷活性組分再分別經(jīng)十八烷基鍵合硅膠開口柱分離，溶劑系統(tǒng)為甲醇： 水，得到較純的黃酮苷活性組分，然后再分別用反相HPLC純化，流動(dòng)相為甲醇水溶液，最終 得到五個(gè)黃酮苷化合物；五個(gè)化合物分別是myricetin 7-〇-a-L-rhamnopyranoside， quercetin 3-Ο-β-D-g1ucopyranoside，quercetin 4'-〇-a-L_rhamnopyranoside， quercetin 3_〇-a-(2''-galloyl)rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種頭花寥中黃酮苷活性組分，其特征在于，所述步驟(2)中 正己烷:二氯甲烷溶劑系統(tǒng)按體積比為：100:0，90:10，70:30，50:50,30:70,10:90，0:100; 隨后二氯甲烷：乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)按體積比為:90:10，70:30，50:50，30:70，0:100;最后為 甲醇。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種頭花寥中黃酮苷活性組分，其特征在于，步驟(2)中第一 次十八烷基鍵合硅膠開口柱純化的甲醇:水溶劑系統(tǒng)按體積比為:30:70，35:65，40:60，50: 50,60:40,70:30,90:10，100:0。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種頭花寥中黃酮苷活性組分，其特征在于，步驟(2)中第二 次十八烷基鍵合硅膠開口柱純化的甲醇:水溶劑系統(tǒng)按體積比分別為:30:70，50: 50和30: 70,35:65,60:40。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種頭花寥中黃酮苷活性組分，其特征在于，步驟(2)中HPLC 純化的色譜柱和流動(dòng)相分別為CAPCELL PAKC18,甲醇：水= 38:62和Develosil C30-UG-5， 甲醇：水= 48:52。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種頭花寥中黃酮苷活性組分在制備抗疫霉菌農(nóng)藥中的應(yīng) 用，所述黃酮苷活性組分主要包括五個(gè)黃酮苷化合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物是以黃酮苷活性組分或五個(gè)黃酮 苷化合物為活性成份，與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑制得。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物劑型選用固體制劑或液體制劑。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK106046081SQ201610408978
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】戚建華, 張慧, 王倩, 王源超
【申請人】浙江大學(xué)