)熒光定量檢測微塑料含量:采用空白組的組織消解液，加入已知含量的熒光微塑料(O，0.001，0.01，0.1，0.55，I毫克)，制備不同濃度梯度的懸濁液，用熒光光譜儀檢測其熒光值(設(shè)定最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長)，以熒光強(qiáng)度和對應(yīng)的微塑料濃度繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后檢測暴露組組織消解液的熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定組織液微塑料濃度，并換算出各組織中微塑料含量。
[0018]以下通過具體實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明:
實(shí)例1:
基于熒光標(biāo)記技術(shù)定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布規(guī)律的方法，定量分析粒徑為5微米和20微米的熒光微塑料在小鼠體內(nèi)的富集和分布規(guī)律，分析流程如圖1所示，具體步驟如下:
(I)熒光微塑料制備實(shí)驗(yàn):首先，配置三氯甲烷和異丙醇的混合溶劑20mL(l:l)，然后稱取0.2g的交聯(lián)聚苯乙烯(PS)微球和1mg的熒光染料4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑(NBD-CL)加入上述混合溶劑中，并在超聲(20min，100W)和氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下分散溶解。充分溶解后的混合液體置于真空干燥箱中(35°C，0.15Mpa)干燥12h，待溶液干燥后，用70%乙醇洗滌聚苯乙稀微球去除多余焚光染料，接著使用離心機(jī)(15min, 6000rpm/min)離心出焚光微塑料制備出帶綠色熒光的PS微球，粒徑分別為5微米和20微米。
[0019](2)熒光微塑料暴露實(shí)驗(yàn):以制備的5微米和20微米粒徑的熒光微塑料為受試樣品，選取雄性昆明種小鼠(Mus musculus)，7周齡，體重16_32g，隨機(jī)分為暴露組和空白組，每組10只，采取灌胃的暴露方式(空白組不灌胃)，暴露劑量為0.1mg微塑料/天，暴露周期為30天。
[0020](3)組織樣品采集:暴露周期結(jié)束后，解剖小鼠，并采集肝臟、腎臟和小腸組織器官，并記錄相應(yīng)的質(zhì)量，然后轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱；
(4)冷凍干燥組織樣品:從超低溫冰箱中轉(zhuǎn)移出組織至冷凍干燥儀(LABCON⑶，USA)，在-10大氣壓和-50°C條件下冷凍干燥小鼠肝臟、腎臟、小腸樣品至恒重；
(5)濕法消解組織樣品:分別稱取經(jīng)冷凍干燥的動物組織樣品0.1克，加入I毫升硝酸(65%，V/V)，70°C水浴2小時，加入I毫升的雙氧水(30%，V/V)，85°C水浴2小時，消解結(jié)束后消解液呈現(xiàn)淡黃透明狀態(tài)，定容到1毫升。
[0021]熒光定量檢測微塑料含量:采用空白組的組織消解液，加入已知含量的熒光微塑料(O，0.001，0.0I，0.1，0.55，I毫克)，制備不同濃度梯度的懸濁液，用熒光光譜儀檢測其熒光值(設(shè)定最大激發(fā)波長445nm和最大發(fā)射波長550nm)，以熒光強(qiáng)度和對應(yīng)的微塑料濃度繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后檢測暴露組組織消解液的熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定組織液微塑料濃度，并換算出各組織中微塑料含量。
[0022]綜上所述，本發(fā)明能夠準(zhǔn)確定量微塑料在哺乳動物體內(nèi)的富集和分布，解決當(dāng)前相關(guān)檢測方法的不足，填補(bǔ)了技術(shù)空缺，為準(zhǔn)確評價微塑料的健康風(fēng)險提供技術(shù)支撐。
[0023]上面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方式作了詳細(xì)的說明，但是本發(fā)明不限于上述實(shí)施方式，在所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下做出各種變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)熒光微塑料顆粒的制備:首先配制10-20mL的三氯甲烷與異丙醇1:1體積比的混合溶劑，然后稱取0.1-0.2g交聯(lián)聚苯乙烯微球和5-10mg的4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑加入上述混合溶劑中，并在超聲和氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下分散溶解，充分溶解后的混合液體進(jìn)行干燥，然后用于50-70%乙醇洗滌以去除多余熒光染料，接著離心回收熒光微塑料，制備出帶綠色熒光的PS微球； (2)哺乳動物暴露實(shí)驗(yàn):選擇上述合成的熒光標(biāo)記微塑料作為受試樣品，選取模式哺乳動物進(jìn)行灌胃染毒實(shí)驗(yàn)，以健康哺乳動物作為空白對照組； (3)樣品采集:熒光微塑料染毒周期結(jié)束以后，受試動物解剖，采集組織樣品； (4)冷凍干燥組織樣品:使用冷凍干燥儀，分別冷凍干燥空白組和染毒組的組織樣品至恒重； (5)濕法消解樣品:稱取一定量的凍干組織樣品，采用濕法消解組織樣品； (6)熒光定量檢測微塑料含量:采用空白組動物的組織消解液，加入已知含量的熒光微塑料，制備不同濃度梯度的懸濁液，在設(shè)定的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長下，用熒光光譜儀檢測其熒光值，以熒光強(qiáng)度和對應(yīng)的微塑料濃度繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后檢測暴露組組織消解液的熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定組織液微塑料濃度，并換算出各組織中微塑料含量。2.如權(quán)利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法，其特征在于，在步驟(I)中，超聲分散條件為在100W超聲下處理15-20分鐘，干燥條件為真空干燥箱中在0.151^^、32°035°(:下干燥12-16小時，以50-70%乙醇洗滌并隨后在6000印111/1^11下離心10-20分鐘，洗滌和離心重復(fù)3-5次，以回收制備出的綠色熒光PS微球。3.如權(quán)利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法，其特征在于，在步驟(2)中，模式哺乳動物為大鼠或小鼠，染毒實(shí)驗(yàn)的染毒周期為一周。4.如權(quán)利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所采集的組織樣品為肝臟、腎臟、小腸或其組合。5.如權(quán)利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法，其特征在于，在步驟(4)中，凍干條件為在-10大氣壓和-50°C條件下冷凍干燥組織樣品至恒重。6.如權(quán)利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法，其特征在于，在步驟(5)中，稱取一定量的凍干組織樣品，采用濕法消解組織樣品，具體消解條件為每0.1克組織樣品中加入I毫升的65%V/V硝酸，70°C水浴2小時，然后加入與硝酸等體積的30%V/V雙氧水，850C水浴2小時，消解結(jié)束后，消解液呈現(xiàn)淡黃透明，定容到10毫升。7.如權(quán)利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法，其特征在于，在步驟(6)中，設(shè)定的最大激發(fā)波長為445nm，最大發(fā)射波長為550nmo
【專利摘要】本發(fā)明提供一種定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法，該方法是一種基于熒光標(biāo)記技術(shù)來定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布規(guī)律的方法，屬于環(huán)境健康風(fēng)險評價領(lǐng)域。其步驟為：合成具有熒光標(biāo)記的微塑料；選取模式動物進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn)；解剖模式動物采集肝臟，腎臟和小腸組織等主要器官；冷凍干燥組織；取一定質(zhì)量的凍干組織，采取濕發(fā)消解；配置不同濃度梯度的熒光微塑料懸濁溶液，根據(jù)熒光光譜儀測定的熒光值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；分別測定各個組織樣品消解液的熒光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到單位組織樣品中微塑料含量；最終確定進(jìn)入組織的微塑料含量。通過本方法可以準(zhǔn)確定量微塑料在哺乳動物組織器官中的富集和分布。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105675566
【申請?zhí)枴緾N201610045344
【發(fā)明人】張宴, 鄧永鋒, 陸熠峰, 任洪強(qiáng)
【申請人】南京大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年1月25日