6的碳酸鈉溶液中，室溫?cái)?拌至OVA溶解，獲得溶液B ;
[0191] d.將溶液A和溶液B按照I :2(v/v)的比例混合混合，室溫?cái)嚢?h，裝入透析袋， 采用濃度為〇. 05M，pH值為7. 0的PBS緩沖液作為透析液進(jìn)行透析72h，得到CS與OVA的 偶聯(lián)物，即為包被原。
[0192] 2、膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)flop
[0193] 膠體金溶液的制備：取0. 01 % (體積百分比）氯金酸水溶液IOOmL用恒溫電磁 攪拌器加熱至沸騰，持續(xù)攪拌的情況下加入1 % (質(zhì)量百分比）檸檬酸三鈉水溶液2. 5mL， 繼續(xù)攪拌加熱20min，溶液呈透亮的紅色。室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)到原體積（IOOmL)， 2-8 °C保存。
[0194] 采用濃度為0.1 M的K2CO3水溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值為8. 2。將IOmL pH值為 8. 2的膠體金溶液中加入50mL燒杯中，電磁攪拌器250r/min攪拌，逐滴加入濃度為lmg/mL 的蛋白質(zhì)溶劑為實(shí)施例2中的包被緩沖液），逐滴加入3mL 5% (質(zhì)量百分比）的BSA水溶 液，持續(xù)攪拌lOmin。將溶液常溫低速（1500r/min)離心20min，棄去由凝聚的金顆粒形成的 沉淀，取紅色上清溶液。將紅色上清溶液在2-8°C，IlOOOrpm條件下離心40min。離心后的 溶液分為三層，透明上清，管底可流動(dòng)的暗紅色沉淀及管底壁上黑色致密的金顆粒層。將可 流動(dòng)的暗紅色沉淀轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)離心管中，用含1% (質(zhì)量百分比）BSA的濃度為0. 01M， pH值為7. 4的PBS緩沖液重懸至原體積，獲得重懸后的溶液。將重懸后的溶液平衡過(guò)夜，在 2-8°C，IlOOOrpm條件下離心40min，共離心2次。最后含1% (質(zhì)量百分比）BSA的濃度為 0. 01M，pH值為7. 4的PBS緩沖液（含質(zhì)量百分比為0. 02 %的NaN3)將沉淀重懸為原體積 的1/40,即得到膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)flop溶液，置于2-8°C保存。
[0195] 3、噴金：將膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)flop溶液噴到玻璃纖維上，制成膠體金墊。
[0196] 4、噴膜：在硝酸纖維素膜上的T線和C線位置分別噴上包被原和鼠抗HIS標(biāo)簽單 克隆抗體，得到反應(yīng)膜；
[0197] 5、組裝：將樣品墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水紙按常規(guī)方法進(jìn)行組裝，然后切條，將 試紙卡裝入塑料制卡中，形成試紙卡，樣品孔位于膠體金試紙條頂端，所述樣品墊的始端為 膠體金試紙條頂端。（圖4)。
[0198] 二、樣品中殘留磺胺藥物的檢測(cè)
[0199] 1、樣品前處理及檢測(cè)
[0200] 牛奶樣品：無(wú)需前處理，直接檢測(cè)。
[0201] 取出試紙卡，開(kāi)封后平放于桌面，吸取待測(cè)液逐滴加入4滴于樣品孔中；42°C反應(yīng)10min進(jìn)行結(jié)果判斷，20min后的結(jié)果無(wú)效。
[0202] 2、結(jié)果判斷
[0203] 膠體金試紙的檢測(cè)原理：當(dāng)樣品中含有過(guò)多的磺胺藥物時(shí)，膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì) flop完全被樣品中的磺胺藥物結(jié)合，所以檢測(cè)線（T線）上的包被原不能與膠體金標(biāo)記的蛋 白質(zhì)flop結(jié)合，因此檢測(cè)線（T線）上不顯色，質(zhì)控線（C線）上的鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗 體能夠與膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)flop結(jié)合顯色，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；
[0204] 當(dāng)樣品中不含有磺胺藥物時(shí)，膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)flop可以與檢測(cè)線（T線）上 的包被原結(jié)合，檢測(cè)線（T線）上顯色，質(zhì)控線（C線）上的鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體能夠與 膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)flop結(jié)合顯色，檢測(cè)結(jié)果為陰性。
[0205] 陰性：C線顯色，T線肉眼可見(jiàn)，無(wú)論顏色深淺均判為陰性。
[0206] 陽(yáng)性：C線顯色，T線不顯色，判為陽(yáng)性。
[0207] 無(wú)效：C線不顯色，無(wú)論T線是否顯色，該試紙卡均判為無(wú)效。
[0208] 三、膠體金試紙條的準(zhǔn)確度檢測(cè)
[0209] 1、假陽(yáng)性率和假陰性率
[0210] 原奶樣品直接采自農(nóng)場(chǎng)奶牛。用LC-MS/MS檢測(cè)奶樣中磺胺二甲基嘧啶含量， LC-MS/MS 按照 GB/T 22975-2008 進(jìn)行。
[0211] 取經(jīng)LC-MS/MS確證的陰性奶樣（磺胺二甲基嘧啶含量小于100ng/mL) 100份（編 號(hào)為1#-100#)，取經(jīng)LC-MS/MS確證的陽(yáng)性奶樣（磺胺二甲基嘧啶含量大于100ng/ml) 100 份（編號(hào)為1-100)。將樣品分別用膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算假陽(yáng)性率和假陰性率。假 陽(yáng)性率=(假陽(yáng)性樣品數(shù)/陰性樣品總數(shù)）X 100% ;假陰性率=(假陰性樣品數(shù)/陽(yáng)性樣 品總數(shù)）X 100%
[0212] 結(jié)果：在100份陰性奶樣測(cè)定中，膠體金試紙條檢測(cè)出陽(yáng)性樣品5份（編號(hào)分別為 13#、32#、58#、66#、67#)，假陽(yáng)性率為5%。在100份陽(yáng)性奶樣測(cè)定中，膠體金試紙條檢測(cè)出 陰性樣品〇份，假陰性率為0%。
[0213] 按照相同方法檢測(cè)超市購(gòu)買(mǎi)的牛奶。用LC-MS/MS檢測(cè)奶樣中磺胺二甲基嘧啶含 量，LC-MS/MS 按照 GB/T 22975-2008 進(jìn)行。
[0214] 取經(jīng)LC-MS/MS確證的陰性成品奶樣（磺胺二甲基嘧啶含量小于4ng/mL) 15份（編 號(hào)為1#-15#)，取經(jīng)LC-MS/MS確證的陽(yáng)性奶樣（磺胺二甲基嘧啶含量大于4ng/mL) 10份（編 號(hào)為1-10)。將樣品分別用膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算假陽(yáng)性率和假陰性率。
[0215] 結(jié)果：在15份陰性成品奶樣測(cè)定中，膠體金試紙條檢測(cè)出陽(yáng)性樣品1份（編號(hào)為 8#)，假陽(yáng)性率為6. 67%。在10份陽(yáng)性奶樣測(cè)定中，試紙卡檢測(cè)出陰性樣品0份，假陰性率 為0% O
[0216] 結(jié)果表明，膠體金試紙條檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶的假陽(yáng)性率為5-6. 67%，假陰性率 為〇%，具有很高的準(zhǔn)確度。
[0217] 四、膠體金試紙條的保存期
[0218] 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，本試紙卡在2_8°C或室溫條件下陰涼干燥處可保存1年。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)磺胺藥物的試劑盒，包括包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為蛋白質(zhì)flop ; 所述酶標(biāo)記物是將標(biāo)記酶和4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸偶聯(lián)在一起得到的偶聯(lián)物； 所述蛋白質(zhì)flop為如下a)或b)的蛋白質(zhì)： a) 由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 將SEQ ID No. 1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加由a)衍生的蛋白質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括如下中的至少一種： 磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、樣品稀釋液、包被緩沖液和封閉 液。3. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒的制備方法，包括如下（1)或（2)的步驟： (1) 將所述包被原和所述酶標(biāo)記物分別單獨(dú)包裝的步驟； (2) 將所述包被原、所述酶標(biāo)記物、所述磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液、所述底物顯色液、所 述終止液、所述洗滌液、所述樣品稀釋液、所述包被緩沖液和所述封閉液分別單獨(dú)包裝的步 驟。4. 一種檢測(cè)磺胺藥物的膠體金試紙，包括相互連接的樣品墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸收 墊；所述反應(yīng)膜位于所述膠體金墊和所述吸收墊之間；所述膠體金墊包被有膠體金標(biāo)記的 帶有HIS標(biāo)簽的權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)flop ;所述反應(yīng)膜上含有檢測(cè)線和質(zhì)檢線，所述 檢測(cè)線包被有4- (4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸和載體蛋白，所述質(zhì)檢線包被有抗所述HIS 標(biāo)簽的單克隆抗體；所述蛋白質(zhì)flop為如下a)或b)的蛋白質(zhì)： a) 由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 將SEQ ID No. 1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加由a)衍生的蛋白質(zhì)。5. 權(quán)利要求4所述膠體金試紙的制備方法，包括如下（1)或（2)的步驟： (1) 分別制備權(quán)利要求4中所述的檢測(cè)磺胺藥物的膠體金試紙中所述樣品墊、所述膠 體金墊和所述反應(yīng)膜； (2) 將步驟（1)得到的所述樣品墊、所述膠體金墊、所述反應(yīng)膜和所述吸收墊相互連 接，得到所述反應(yīng)膜位于所述膠體金墊和所述吸收墊之間的檢測(cè)磺胺藥物的膠體金試紙。6. -種檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法，為如下I或II所示的方法： I、 檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法包括如下步驟： 1) 將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，得到待測(cè)樣品溶液； 2) 用權(quán)利要求1或2所述的試劑盒對(duì)所述待測(cè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)； II、 檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法包括如下步驟： 1) 將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，得到待測(cè)樣品溶液； 2) 用權(quán)利要求4所述的膠體金試紙對(duì)所述待測(cè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，或權(quán)利要求4所述的膠體金試紙，或權(quán)利要求 6所述的方法，其特征在于：所述磺胺藥物為下述中的至少一種：磺胺異噁唑、柳氮磺胺吡 啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁 啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪、磺胺乙氧噠嗪、磺胺甲 氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺甲基嘧啶、 磺胺胍、磺胺間甲氧噠嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞 磺胺噻唑。8.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)flop在制備權(quán)利要求1或2所述的試劑盒和/或權(quán)利要求 4所述的膠體金試紙中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于檢測(cè)磺胺藥物的試劑盒和試紙條及其應(yīng)用。采用利用保藏菌株大腸埃希氏菌(Escherichia？coli)BL21(DE3)-pET28b-flop表達(dá)得到的蛋白質(zhì)flop制備的試劑盒和膠體金試紙條能夠用于檢測(cè)磺胺藥物。本發(fā)明的試劑盒和膠體金試紙條具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、成本低、操作簡(jiǎn)單、保質(zhì)期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)；能快速檢測(cè)大批量樣品，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，在磺胺藥物的檢測(cè)中將發(fā)揮重大作用。CGMCC No.1006820141127
【IPC分類】G01N33/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105137086
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510455259
【發(fā)明人】沈建忠, 王戰(zhàn)輝, 梁曉, 張素霞, 溫凱, 宋曉麗, 江海洋
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月29日