專利名稱：：一種檢測磺胺類藥物的檢測卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本實(shí)用新型涉及一種檢測磺胺類藥物的檢測卡。
背景技術(shù)：
：磺胺類藥物(Sulfonamides,SAs)都是以對氨基苯磺酰胺為基本結(jié)構(gòu)的衍生物，為具有式(I)所示官能團(tuán)的化合物，是一類人工合成的可有效預(yù)防和治療細(xì)菌性感染的動物常用抗菌藥。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>磺胺類藥物其抗菌譜廣，毒性小、口服易吸收、生產(chǎn)量大，價格低廉，供應(yīng)充足，抑菌效果強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和獸醫(yī)臨床。但由于不合理使用甚至濫用，造成磺胺類藥物于動物性食品中殘留現(xiàn)象較為嚴(yán)重，磺胺藥在體內(nèi)作用時間和代謝時間較長，通過任何途徑攝入的磺胺藥都可能在人體中蓄積，當(dāng)蓄積濃度達(dá)到一定量時會影響到人類健康。近年來發(fā)現(xiàn)，長期使用該類藥物可引起甲狀腺腫大、誘發(fā)腫瘤等，極大地影響了人們的健康，也影響我國畜產(chǎn)品的正常出口貿(mào)易，因此監(jiān)控動物源食品中該類藥物殘留十分必要。磺胺類藥物的化學(xué)檢測方法包括薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、氣譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)(GC/MS)、高壓液相色譜法(HPLC)、高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)(HPLC/MS)等。這些方法的前處理利用液一液分配，常規(guī)的SPE柱凈化和分離，都在不同程度地存在著處理過程繁瑣、凈化效果差、有機(jī)溶劑浪費(fèi)多、所需時間長且需專業(yè)人員操作等缺點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了這種檢測方法的普及推廣，更無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測。本發(fā)明所涉及的磺胺類藥物總殘留檢測卡操作簡單，人人可以操作，可以判定結(jié)果陰陽性，具有較高的應(yīng)用價值和較大的經(jīng)濟(jì)社會效益。
實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種檢測磺胺類藥物的檢測卡。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型的技術(shù)方案如下本實(shí)用新型提供的檢測磺胺類藥物殘留的檢測卡，其特征在于它包括底板、反應(yīng)膜、樣品墊、復(fù)合墊和吸水墊。所述復(fù)合墊由活化墊4、放熱墊5和結(jié)合物釋放墊6依次連接而成；所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的磺胺類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物；沿樣品液流動方向底板l分為三個區(qū)域加樣區(qū)、反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)和吸水墊設(shè)置區(qū)；反應(yīng)膜2設(shè)于所述反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)上；樣品墊I(3)設(shè)于所述加樣區(qū)上；所述復(fù)合墊設(shè)于所述樣品墊I上，所述結(jié)合物釋放墊靠近所述反應(yīng)膜；所述活化墊上設(shè)有樣品墊II(7);所述吸水墊設(shè)置區(qū)上設(shè)有吸水墊8;所述反應(yīng)區(qū)上設(shè)有T線9和C線IO，T線包被有磺胺類藥物的特異性抗體，C線包被有載體蛋白抗體。所述T線和所述C線可互相平行且與樣品液流動方向垂直。所述T線可靠近所述結(jié)合物釋放墊，所述C線可靠近所述吸水墊。所述檢測卡還可包括固定膜ii。所述樣品墊n和所述結(jié)合物釋放墊上可覆蓋有所述固定膜，固定膜上與所述樣品墊II對應(yīng)的區(qū)域設(shè)有樣品孔12。所述吸水墊上可覆蓋有所述固定膜。所述固定膜為防水材質(zhì)的，用于固定檢測卡的各個組件，避免樣品或試劑與外界環(huán)境中的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，影響檢測卡的檢測效果。為了保證樣品液流動的連續(xù)性，所述結(jié)合物釋放墊和所述反應(yīng)膜可設(shè)有2mm的重疊區(qū)，所述吸水墊和所述反應(yīng)膜可設(shè)有5mm的重疊區(qū)。所述復(fù)合墊與所述樣品墊II重疊長度可為8mm以上，所述復(fù)合墊與所述樣品墊I的重疊長度可為15mm以上。沿樣品液流動方向，所述樣品墊I的長度可為16mm，所述活化墊的長度可為6ram，所述放熱墊的長度可為6mm，所述結(jié)合物釋放墊的長度可為6mm，所述樣品墊n的長度可為8ram，所述反應(yīng)膜的長度可為20mm，所述吸水墊的長度可為20mm。所述T線距離所述結(jié)合物釋放墊的垂直距離可為6mm;所述C線距離所述吸水墊的垂直距離可為6mm;所述T線和所述C線的垂直距離可為5ram。所述反應(yīng)膜、所述樣品墊I、所述吸水墊可通過雙面膠固定在所述底板上，在反應(yīng)膜與底板之間可設(shè)有高分子材料制成的背襯膜(隔離膜)，用以阻止粘合劑中的有機(jī)溶劑對包被蛋白和包被抗體的破壞。所述檢測卡具體可為長80ram，寬5mm的條狀。活化墊主要是接收樣品液體，在堿性物質(zhì)與表面活性劑參與下，短時間內(nèi)免疫反應(yīng)更有利于進(jìn)行。樣品墊I控制整個過程中的液體流速，使參與反應(yīng)的物質(zhì)需緩慢釋放，從而達(dá)到預(yù)期目的。所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、血蘭蛋白(KLH)等。所述具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物的特異性抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。所述載體蛋白抗體可為牛血清白蛋白(BSA)多克隆抗體。對于一個檢測卡來說，具體可用15-20mn的膠體金標(biāo)記具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白偶聯(lián)物。所述底板可由不吸水的韌性材料制成，如硬質(zhì)塑料、不吸水硬紙，具體可為PVC板材。所述樣品吸收墊可由玻璃纖維棉或玻璃棉制成。所述結(jié)合物釋放墊可由玻璃纖維或玻璃棉制成。所述吸水墊可為厚濾紙、無紡布或其他吸水性材料。所述反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜(NC膜)。所述保護(hù)膜可為PE材質(zhì)的保護(hù)膜。所述磺胺類藥物具體可為磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間二甲氧嘧啶或磺胺間甲氧嘧啶。本實(shí)用新型的檢測原理當(dāng)樣品溶液中含有磺胺類藥物時，在擴(kuò)散過程中，樣品中的磺胺類藥物通過競爭結(jié)合抑制了膠體金-具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白偶聯(lián)物同T線上的具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物的特異性抗體結(jié)合，T線無法顯色，而c線的載體蛋白抗體可與膠體金-具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白偶聯(lián)物中的載體蛋白特異結(jié)合，C線即顯示紅棕色(紫紅色)印跡。當(dāng)樣品中不含磺胺類藥物或其含量低于檢測卡檢測限時，膠體金-具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白偶聯(lián)物可與T線上的具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物的特異性抗體結(jié)合，T線顯示紅棕色(紫紅色)印跡，液體滲透到C線時，C線上的抗載體蛋白抗體可與膠體金-具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白偶聯(lián)物特異結(jié)合，C線顯示紅棕色(紫紅色)印跡。本實(shí)用新型的檢測磺胺類藥物的檢測卡具有以下的特點(diǎn)(1)交叉反應(yīng)廣泛。在實(shí)際檢測中，可以檢測出以下磺胺藥物。其檢測藥物的檢測限見表l。表l磺胺藥物的檢測限<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)操作簡便，結(jié)果顯示快速。檢測過程中無需其他試劑，將檢測卡平放水平位置，在10分鐘內(nèi)即有結(jié)果顯示。(3)對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣口叫o(4)結(jié)果判定簡單明了。SAs檢測卡以肉眼可見的紅棕色檢測印跡作為判定標(biāo)準(zhǔn)。一條印跡表示被檢樣品中含有SAs，兩條印跡表示被檢樣品中不含SAs。(5)制備工藝簡單，成本低。(6)應(yīng)用價值高。檢測卡操作簡單，人人可以操作，可以判定結(jié)果陰陽性。本實(shí)用新型具有較高的應(yīng)用價值和較大的經(jīng)濟(jì)社會效益，將在食品和飼料中SAs的檢測中發(fā)揮重要作用。圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本實(shí)用新型，但并不限定本實(shí)用新型。下述實(shí)施例中的實(shí)驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。如圖1所示，本實(shí)用新型的檢測磺胺類藥物的檢測卡，包括底板l、反應(yīng)膜2、樣品墊、復(fù)合墊和吸水墊8。所述復(fù)合墊由活化墊4、放熱墊5和結(jié)合物釋放墊6依次連接而成。所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的磺胺類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物。沿樣品液流動方向底板l分為加樣區(qū)、反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)和吸水墊設(shè)置區(qū)。反應(yīng)膜2設(shè)于所述反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)上。樣品墊I(3)設(shè)于所述加樣區(qū)上。所述復(fù)合墊設(shè)于所述樣品墊I(3)上，所述結(jié)合物釋放墊6靠近所述反應(yīng)膜2。活化墊4上設(shè)有樣品墊II(7)。所述吸水墊設(shè)置區(qū)上設(shè)有吸水墊8。所述反應(yīng)區(qū)上設(shè)有T線9和C線10，T線包被有磺胺類藥物的特異性抗體，C線包被有載體蛋白抗體，T線9和C線10互相平行且與樣品液流動方向垂直，T線9靠近結(jié)合物釋放墊6，C線10靠近所述吸水墊8。反應(yīng)膜2、樣品墊I、吸水墊通過雙面膠固定在底板l上，它們與底板1之間設(shè)有高分子材料制成的背襯膜(隔離膜)，用以阻止粘合劑中的有機(jī)溶劑對包被蛋白和包被抗體的破壞。沿樣品液流動方向，樣品墊I的長度為16mm，活化墊的長度為6mm，所放熱墊的長度為6mm，結(jié)合物釋放墊的長度為6腿，樣品墊II的長度為8誦，反應(yīng)區(qū)的長度為20畫，吸水墊的長度為20mm。所述復(fù)合墊與所述樣品墊II的重疊長度為8mm，與所述樣品墊1的重疊長度為15ram;所述結(jié)合物釋放墊和所述反應(yīng)膜設(shè)有2ram的重疊區(qū)，所述吸水墊和所述反應(yīng)膜設(shè)有5mm的重疊區(qū)。T線距離樣品吸收區(qū)的垂直距離為6mm，C線距離所述吸水墊設(shè)置區(qū)的垂直距離為6mm，T線和C線的垂直距離為5咖。使用時，將磺胺類藥物檢測檢測卡平放水平位置，用滴管滴加3-5滴待測溶液到檢測卡樣品端，水平放置約10分鐘，觀察判定結(jié)果(判定標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品，卡中C線位置顯示一條紫紅色印跡；陰性樣品，卡中T/C線顯示兩條紫紅色印跡，沒有紫紅色印跡顯示表明檢測卡已經(jīng)失效)。檢測卡中用到的材料均可釆用常規(guī)方法制備，舉例如下一、具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白偶聯(lián)物可通過戊二醛法或重氮化法將具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物和載體蛋白偶聯(lián)，得到具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白偶聯(lián)物。二、具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物的特異性抗體具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物的特異性抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。1、可采用如下方法制備具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物的鼠單克隆抗體(1)動物免疫程序采用BALB/c小鼠作為免疫動物，以具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白為免疫原，免疫劑量為50-100ug/只。首次免疫時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射；間隔2周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次；第四次免疫后腹腔加強(qiáng)免疫一次，腹腔加強(qiáng)免疫3天后取脾細(xì)胞。(2)細(xì)胞融合與克隆化步驟(1)得到的小鼠脾細(xì)胞，按(4-8):1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。(3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，用凍存液制成1X106-5X106個/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37。C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。(4)單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將BALB/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射步驟(3)的雜交瘤細(xì)胞5X105-106個/只，7-10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，得到具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白的單克隆抗體。小瓶分裝，-2(TC保存。2、可采用如下方法制備具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物的兔多克隆抗體采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白為免疫原，免疫劑量為lmg/kgb.w.。首次免疫時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射；間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7-10d后釆血，測定血清抗體效價，頸動脈放血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。三、載體蛋白抗體載體蛋白抗體可為載體蛋白單克隆抗體或載體蛋白多克隆抗體。如可以BSA作為免疫抗原免疫動物，得到BSA的多克隆抗體。四、金標(biāo)蛋白(1)用檸檬酸三鈉法制備膠體金在沸騰的100ml的1%氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5-5%檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15-20nm的膠體金。(2)金標(biāo)蛋白的制備用O.lmol/L的K2C03調(diào)膠體金pH至8.5，測得最佳蛋白標(biāo)記濃度后，將待標(biāo)記的具有磺胺母環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物-載體蛋白加入膠體金溶液中，攪拌30分鐘，加入l%BSA，繼續(xù)攪拌15分鐘，加入O.5%PEG8000，接著攪拌15分鐘。4°C4000g離心15min，除去未結(jié)合的金顆粒。然后4'C12000g離心20分鐘，去上清，沉淀用PBS溶解，再次離心20分鐘，獲得純化的金標(biāo)蛋白。權(quán)利要求1、一種檢測磺胺類藥物殘留的檢測卡，其特征在于它包括底板、反應(yīng)膜、樣品墊、復(fù)合墊和吸水墊；所述復(fù)合墊由活化墊(4)、放熱墊(5)和結(jié)合物釋放墊(6)依次連接而成；所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的磺胺類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物；沿樣品液流動方向底板(1)分為三個區(qū)域加樣區(qū)、反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)和吸水墊設(shè)置區(qū)；反應(yīng)膜(2)設(shè)于所述反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)上；樣品墊I(3)設(shè)于所述加樣區(qū)上；所述復(fù)合墊設(shè)于所述樣品墊I上，所述結(jié)合物釋放墊靠近所述反應(yīng)膜；所述活化墊上設(shè)有樣品墊II(7)；所述吸水墊設(shè)置區(qū)上設(shè)有吸水墊(8)；所述反應(yīng)區(qū)上設(shè)有T線(9)和C線(10)，T線包被有磺胺類藥物的特異性抗體，C線包被有載體蛋白抗體。2、如權(quán)利要求1所述的檢測卡，其特征在于所述T線和所述C線互相平行且與樣品液流動方向垂直；所述T線靠近所述結(jié)合物釋放墊，所述C線靠近所述吸水墊。3、如權(quán)利要求2所述的檢測卡，其特征在于所述檢測卡還包括固定膜(11);所述樣品墊n和所述結(jié)合物釋放墊上覆蓋有所述固定膜，固定膜上與所述樣品墊n對應(yīng)的區(qū)域設(shè)有樣品孔(12);所述吸水墊上覆蓋有所述固定膜。4、如權(quán)利要求3所述的檢測卡，其特征在于所述復(fù)合墊與所述樣品墊n的重疊長度為8mm以上；所述復(fù)合墊與所述樣品墊I的重疊長度為15mm以上；所述結(jié)合物釋放墊和所述反應(yīng)膜有2mm的重疊區(qū)，所述吸水墊和所述反應(yīng)膜有5mm的重疊區(qū)。5、如權(quán)利要求4所述的檢測卡，其特征在于沿樣品液流動方向，所述樣品墊I的長度為16mm，所述活化墊的長度為6mm，所述放熱墊的長度為6mm，所述結(jié)合物釋放墊的長度為6mm，所述樣品墊II的長度為8mm，所述反應(yīng)膜的長度為20mm，所述吸水墊的長度為20mm。6、如權(quán)利要求5所述的檢測卡，其特征在于所述T線距離所述結(jié)合物釋放墊的垂直距離為6腿；所述C線距離所述吸水墊的垂直距離為6mm;所述T線和所述C線的垂直距離為5mm。7、如權(quán)利要求6所述的檢測卡，其特征在于所述反應(yīng)膜、所述樣品墊I、所述吸水墊和所述底板之間設(shè)有隔離膜。8、如權(quán)利要求1至7中任一所述的檢測卡，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白。專利摘要本實(shí)用新型公開了一種檢測磺胺類藥物的檢測卡。本實(shí)用新型包括底板、反應(yīng)膜、樣品墊、復(fù)合墊和吸水墊；復(fù)合墊由活化墊、放熱墊和結(jié)合物釋放墊依次連接而成；結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的磺胺類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物；反應(yīng)膜(2)設(shè)于底板(1)上，分為樣品吸收區(qū)、反應(yīng)區(qū)和吸水墊設(shè)置區(qū)；樣品吸收區(qū)上，遠(yuǎn)離反應(yīng)區(qū)處設(shè)有樣品墊I(3)；復(fù)合墊設(shè)于樣品墊I上，結(jié)合物釋放墊(6)靠近反應(yīng)區(qū)；活化墊上設(shè)有樣品墊II(7)；吸水墊設(shè)置區(qū)上設(shè)有吸水墊(8)；反應(yīng)區(qū)上設(shè)有T線(9)和C線(10)，T線包被有磺胺類藥物的特異性抗體，C線包被有載體蛋白抗體。本實(shí)用新型具有以下的特點(diǎn)10分鐘內(nèi)即有結(jié)果顯示；能同時檢測大批樣品；結(jié)果判定簡單；制備工藝簡單，成本低。本實(shí)用新型具有較高的應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)社會效益。文檔編號G01N33/577GK201429618SQ20092010888公開日2010年3月24日申請日期2009年6月10日優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日發(fā)明者史為民,吳小平,江海洋,王戰(zhàn)輝申請人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司