用于檢測(cè)磺胺藥物的試劑盒和試紙條及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域中用于檢測(cè)磺胺藥物的試劑盒和試紙條及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 磺胺藥物是一類具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的化學(xué)藥物，其中應(yīng)用較廣并有確切療 效的有數(shù)十種，由于其價(jià)格便宜、使用方便，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病防治和促生長(zhǎng)?；前匪幬?的不合理使用在畜牧產(chǎn)品中產(chǎn)生了嚴(yán)重的殘留現(xiàn)象，食品中殘留的磺胺藥物會(huì)危害人們的 身體健康，長(zhǎng)期攝入含有磺胺藥物殘留的食物可引起細(xì)菌耐藥性增加，產(chǎn)生腎臟毒性，影響 造血系統(tǒng)等毒副作用。
[0003] 隨著人們對(duì)食品安全的日益重視，歐盟、中國、美國、日本等國家相繼對(duì)動(dòng)物源性 食品中磺胺藥物最大殘留限量值作出了規(guī)定，其中歐盟和中國規(guī)定磺胺藥物總量的最高殘 留限量為IOOppb。
[0004] 目前磺胺藥物的檢測(cè)方法主要有儀器法（包括高效氣相色譜、高效液相色譜以及 色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等）、微生物法、免疫分析方法以及受體分析方法等，這些方法各有特點(diǎn)：儀 器法準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高，是一種確證方法，但是不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；微生物法可同時(shí)檢 測(cè)多種抗生素，但靈敏度不高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且無法定量；免疫分析方法基于抗原抗體的特 異結(jié)合，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可定量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，但由于靈敏度高且可識(shí)別同一類藥 物的抗體難以獲得，制約了其在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。如能開發(fā)出可同時(shí)檢測(cè)多種 磺胺藥物的產(chǎn)品將有助于磺胺藥物的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測(cè)多種磺胺藥物。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種檢測(cè)磺胺藥物的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明所提供的一種檢測(cè)磺胺藥物的試劑盒，包括包被原和酶標(biāo)記物；所述包被 原為蛋白質(zhì)flop ;所述酶標(biāo)記物是將標(biāo)記酶和4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸偶聯(lián)在一 起得到的偶聯(lián)物；所述蛋白質(zhì)flop為如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0008] a)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0009] b)將SEQ ID No. 1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0010] 上述試劑盒中，所述標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶；辣根過氧化物 酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸進(jìn)行偶聯(lián)，如二 環(huán)己基碳二亞胺偶聯(lián)法等。
[0011] 上述試劑盒還包括如下中的至少一種：磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物顯色液、終 止液、洗滌液、樣品稀釋液、包被緩沖液和封閉液。
[0012] 上述試劑盒中，所述磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液可以是一定濃度范圍內(nèi)的多種濃 度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，例如可以在〇-l〇〇ng/mL之間，如磺胺二甲基嘧啶的濃度分別為50ng/mL、 25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL和 L 6ng/mL〇
[0013] 當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，所述底物顯色液由E液和F液組成，所述E液可為 過氧化脲溶液或過氧化氫溶液（具體如質(zhì)量百分含量為2 %的過氧化脲溶液），所述F液可 為四甲基聯(lián)苯胺溶液或鄰苯二胺溶液（具體如質(zhì)量百分含量為1 %的四甲基聯(lián)苯胺溶液）。 所述終止液可為硫酸溶液，其濃度可為1-2M (如0. 2M)。
[0014] 上述試劑盒中，所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述洗滌 液具體為含有吐溫20和疊氮化鈉的濃度為0. 01M，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液；吐溫-20 在所述洗滌液中的體積含量為〇. 05%，疊氮化鈉在所述洗滌液中的濃度為5mg/mL。
[0015] 上述試劑盒中，所述包被緩沖液的pH為8. 0,由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水， 所述溶質(zhì)及其濃度為：20mMTris、30mM MgCl2。
[0016] 上述試劑盒中，所述封閉液為磷酸鹽緩沖液；在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述封閉 液具體為pH 7. 4,含脫脂奶粉的濃度為0. 02M的磷酸鹽緩沖液；脫脂奶粉在所述封閉液中 的濃度為20mg/mL。
[0017] 所述包被緩沖液和所述封閉液也可以是本領(lǐng)域常用的其它包被緩沖液和封閉液。
[0018] 上述試劑盒中，所述樣品稀釋液具體為pH值為8.0,由溶劑和溶質(zhì)組成；溶劑為 水，溶質(zhì)及其濃度為：20mM Tris、5mM MgCl2、2% (質(zhì)量百分含量）脫脂奶粉、l:1500(v/v) 的6-羥甲基-7, 8二氫蝶呤焦磷酸鹽（DHPPP)。
[0019] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述試劑盒的制備方法。
[0020] 本發(fā)明所提供的所述試劑盒的制備方法，包括如下（1)或（2)的步驟：
[0021] (1)將所述包被原和所述酶標(biāo)記物分別單獨(dú)包裝的步驟；
[0022] (2)將所述包被原、所述酶標(biāo)記物、所述磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液、所述底物顯色 液、所述終止液、所述洗滌液、所述樣品稀釋液、所述包被緩沖液和所述封閉液分別單獨(dú)包 裝的步驟。
[0023] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)磺胺藥物的膠體金試紙。
[0024] 本發(fā)明所提供的一種檢測(cè)磺胺藥物的膠體金試紙，包括相互連接的樣品墊、膠體 金墊、反應(yīng)膜和吸收墊；所述反應(yīng)膜位于所述膠體金墊和所述吸收墊之間；所述膠體金墊 包被有膠體金標(biāo)記的帶有HIS標(biāo)簽的所述的蛋白質(zhì)flop ;所述反應(yīng)膜上含有檢測(cè)線和質(zhì)檢 線，所述檢測(cè)線包被有4- (4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸和載體蛋白，所述質(zhì)檢線包被有抗 所述HIS標(biāo)簽的單克隆抗體；所述蛋白質(zhì)flop為如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0025] a)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0026] b)將SEQ ID No. 1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0027] 上述膠體金試紙中，所述樣品墊的末端與所述膠體金墊的始端相連，所述膠體金 墊的末端與所述反應(yīng)膜的始端相連，所述反應(yīng)膜的末端與所述吸收墊的始端相連。
[0028] 上述膠體金試紙中，所述反應(yīng)膜上的檢測(cè)線（T線）和質(zhì)檢線（C線）均是與所述 膠體金試紙的長(zhǎng)相垂直的條帶狀；所述檢測(cè)線位于近于所述膠體金墊末端的一側(cè)；所述質(zhì) 檢線位于遠(yuǎn)離所述膠體金墊末端的一側(cè)。
[0029] 上述膠體金試紙中，所述載體蛋白可為卵清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋 白、血藍(lán)蛋白、鼠血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或兔血清白蛋白，具體可為卵清白蛋白。
[0030] 上述膠體金試紙中，所述抗所述HIS標(biāo)簽的單克隆抗體具體可為鼠抗HIS標(biāo)簽單 克隆抗體。
[0031] 上述膠體金試紙中，所述樣品墊可為纖維素濾膜；所述反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜； 所述吸收墊可為吸水紙；所述膠體金墊可為包被有膠體金標(biāo)記的蛋白質(zhì)flop的玻璃纖維 膜；樣品孔位于所述膠體金試紙頂端，所述樣品墊的始端為所述膠體金試紙頂端。
[0032] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述膠體金試紙的制備方法。
[0033] 本發(fā)明所提供的所述膠體金試紙的制備方法，包括如下（1)或（2)的步驟：
[0034] (1)分別制備所述的檢測(cè)磺胺藥物的膠體金試紙中所述樣品墊、所述膠體金墊和 所述反應(yīng)膜；
[0035] (2)將步驟（1)得到的所述樣品墊、所述膠體金墊、所述反應(yīng)膜和所述吸收墊相 互連接，得到所述反應(yīng)膜位于所述膠體金墊和所述吸收墊之間的檢測(cè)磺胺藥物的膠體金試 紙。
[0036] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法。
[0037] 本發(fā)明所提供的一種檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法，為如下I或II所示的方法：
[0038] I、檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法包括如下步驟：
[0039] 1)將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，得到待測(cè)樣品溶液；
[0040] 2)用所述試劑盒對(duì)所述待測(cè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)；
[0041] 所述待測(cè)樣品為牛奶：將牛奶用上述的樣品稀釋液按1:5的體積比進(jìn)行稀釋， 4°C、1000 Orpm離心，取上清液，作為待測(cè)樣品溶液；
[0042] 所述待測(cè)樣品為奶粉：稱取Ig奶粉，溶于5mL上述的樣品稀釋液中，混合均勻，作 為待測(cè)樣品溶液。
[0043] 所述待測(cè)樣品為尿液：將尿液直接作為待測(cè)樣品溶液；
[0044] 所述待測(cè)樣品為雞肉、魚、蝦或蛋：將所述待測(cè)樣品勻漿處理，得到均質(zhì)樣品，將每 5g所述均質(zhì)樣品加入IOmL乙腈水溶液中，上下顛倒震蕩10min，5000rpm離心10min，取上 清，氮?dú)獯蹈?，用ImL上述的樣品稀釋液重懸，得到的溶液即為待測(cè)樣品溶液；乙腈水溶液 中乙腈和水的體積比為9:1 ;
[0045] 所述待測(cè)樣品為蜂蜜：將每5g所述待測(cè)樣品加入到15mL去離子水中，混合，得到 混合液；將所述混合溶液用Oasis固相萃取柱進(jìn)行純化，用甲醇洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯?干，用ImL上述的樣品稀釋液重懸，得到的溶液即為待測(cè)樣品溶液。
[0046] II、檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法包括如下步驟：
[0047] 1)將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，得到待測(cè)樣品溶液；
[0048] 2)用所述膠體金試紙對(duì)所述待測(cè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)；
[0049] 所述膠體金試紙檢測(cè)結(jié)果的判斷：
[0050] 陰性：C線顯色，T線肉眼可見，無論顏色深淺均判為陰性。
[0051] 陽性：C線顯色，T線不顯色，判為陽性。
[0052] 無效：C線不顯色，無論T線是否顯色，該試紙卡均判為無效。
[0053] 上述檢測(cè)樣品中磺胺藥物的方法中，所述方法為非疾病診斷目的的方法和/或非 治療目的的方法。
[0054] 上述的試劑盒，或上述的膠體金試紙，或上述的方法中，所述磺胺藥物為下述中的 至少一種：磺胺異噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺間甲氧嘧 啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、 磺胺氯噠嗪、磺胺乙氧噠嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧 啶