一種針對(duì)HPA-1a/3a/5b抗體的MAIPA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及輸血醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種針對(duì)HPA-la/3a/5b抗體的 MIPA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著輸血醫(yī)學(xué)的發(fā)展，成分輸血不斷推廣使用，血小板輸注已經(jīng)成為臨床輸血治 療的重要手段之一。人類(lèi)血小板抗原（HPA)是分布在血小板膜糖蛋白上的一類(lèi)具有型特 異性的抗原。目前，血清學(xué)方法已檢出34個(gè)HPA，其中12個(gè)抗原組成系統(tǒng)，包括HPA-la、 HPA-lb、HPA-2a、HPA-2b、HPA-3a、HPA-3b、HPA-4a、HPA-4b、HPA-5a、HPA-5b、HPA-15a、 HPA-15b。在臨床產(chǎn)生的HPA抗體中，針對(duì)這些抗原的抗體占據(jù)絕大多數(shù)，充分體現(xiàn)了其臨 床重要性。HPA在臨床上具有特定意義，可介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生同種抗體，由同種免疫可引發(fā)血小 板輸注無(wú)效、輸血后紫癜、新生兒同種免疫性血小板減少癥等疾病。如果病人血小板抗體檢 測(cè)為陽(yáng)性，應(yīng)針對(duì)其抗體的特異性，采用相應(yīng)抗原陰性的供體血小板，否則將導(dǎo)致嚴(yán)重的輸 血反應(yīng)。因此，人們需要精確、方便、全面且具有較高的敏感性和特異性的HPA抗體檢測(cè)方 法，這對(duì)于臨床輸血具有非常重要的意義。
[0003] 目前已報(bào)道的血小板抗體檢測(cè)的血清學(xué)方法有：1)淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（LCT) ;2)簡(jiǎn) 易致敏紅細(xì)胞血小板血清學(xué)試驗(yàn)（SEPSA) ;3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA) ;4)血小板單克 隆特異性抗體固定試驗(yàn)（MIPA) ;5)抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（MCE) ;6)單克隆抗體固 相血小板抗體實(shí)驗(yàn)（MASPAT) ;7)流式細(xì)胞術(shù)方法（FCM) ;8)微柱凝膠法（MGT) ;9)芯片技 術(shù)（Luminex xMAP) ; 10)表面等離子共振技術(shù)（SPR)，等等。以上方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，絕大部 分存在特異性差的缺點(diǎn)，且無(wú)法既檢測(cè)抗原又檢測(cè)抗體。
[0004] 目前MASPAT、MGT、Luminex xMAP等技術(shù)均已有試劑盒出售，但價(jià)格昂貴，且同樣具 有不能既檢測(cè)抗原又檢測(cè)抗體的缺陷，因此不易大規(guī)模推廣使用。
[0005] 相比于其他血小板抗體檢測(cè)的血清學(xué)方法，MAIPA既能檢測(cè)抗原又檢測(cè)抗體，具備 顯著的優(yōu)勢(shì)，因此建立一套標(biāo)準(zhǔn)的MAIPA體系，開(kāi)發(fā)可供臨床使用的MAIPA檢測(cè)試劑盒，對(duì) 于臨床血小板的配型和同型輸注具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種針對(duì)HPA-Ia和/或HPA_3a和 /或HPA-5b抗體的MAIPA檢測(cè)試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種非診斷和治療目的的針對(duì)HPA-Ia和/或HPA_3a 和/或HPA-5b抗體的MAIPA檢測(cè)方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0009] 一種針對(duì)HPA-Ia和/或HPA-3a和/或HPA-5b抗體的MIPA檢測(cè)試劑盒，所述的 MIPA檢測(cè)試劑盒相應(yīng)地包含：
[0010] a)用于HPA-Ia抗體檢測(cè)的小鼠抗人CD61單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)BD公司，貨號(hào)： 555752 ;和 / 或
[0011] b)用于HPA_3a抗體檢測(cè)的小鼠抗人CD41a單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)R&D公司，貨號(hào)： MAB7616 ;和 / 或
[0012] c)用于HPA-5b抗體檢測(cè)的小鼠抗人CD49b單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)R&D公司，貨號(hào) MAB1233 ;
[0013] 以及
[0014] d)羊抗鼠 IgG單抗，購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，貨號(hào)：115-005-071 ;
[0015] e)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG，購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，貨號(hào)： 109-035-098。
[0016] 優(yōu)選地，所述的MAIPA檢測(cè)試劑盒還包括操作說(shuō)明書(shū)，所述的操作說(shuō)明書(shū)相應(yīng)地 記載有：
[0017] Π )針對(duì)HPA-Ia抗體檢測(cè)，加入反應(yīng)體系的小鼠單抗?jié)舛葹?0 μ g · mL \加入反 應(yīng)體系的酶標(biāo)羊抗人IgG稀釋度為1:10000 ;和/或
[0018] f2)針對(duì)HPA_3a抗體檢測(cè)，加入反應(yīng)體系的小鼠單抗?jié)舛葹? μ g ^mL 1，加入反應(yīng) 體系的酶標(biāo)羊抗人IgG稀釋度為1:3000 ;和/或
[0019] f3)針對(duì)HPA_5b抗體檢測(cè)，加入反應(yīng)體系的小鼠單抗?jié)舛葹? μ g ^mL 1，加入反應(yīng) 體系的酶標(biāo)羊抗人IgG稀釋度為1:1000。
[0020] 更優(yōu)選地，所述的操作說(shuō)明書(shū)還記載有：
[0021] f4)血小板計(jì)數(shù)，將準(zhǔn)備的血小板懸液濃度調(diào)整至（1. 5-2. 5) X IO5/ μ L ;
[0022] f5)MAIPA檢測(cè)過(guò)程中加入的血小板懸液與血清標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)血清樣品的體積為 (1. 8-2. 2) : 1〇
[0023] 優(yōu)選地，所述的MAIPA檢測(cè)試劑盒還相應(yīng)地包含：
[0024] gl)用于HPA-Ia抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，購(gòu)自英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所，貨號(hào)： 03/152 ;和 / 或
[0025] g2)用于HPA_3a抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，購(gòu)自英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所，貨號(hào)： 03/190 ;和 / 或
[0026] g3)用于HPA_5b抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，購(gòu)自英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所，貨號(hào)： 99/666。
[0027] 優(yōu)選地，所述的MAIPA檢測(cè)試劑盒還包含血小板。
[0028] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0029] 一種非診斷和治療目的的針對(duì)HPA-Ia和/或HPA-3a和/或HPA-5b抗體的MAIPA 檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0030] A)平底酶標(biāo)板包被：用羊抗鼠IgG單抗包被平底酶標(biāo)板，所述的羊抗鼠IgG單抗 購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，貨號(hào)：115-005-071 ;
[0031] B)采集血小板并調(diào)整血小板懸液的濃度；
[0032] OMAIPA檢測(cè)：在體系中加入所述的血小板懸液，離心，棄上清；加入標(biāo)準(zhǔn)抗血清 或待測(cè)血清樣品，孵育，洗滌；加入小鼠單抗，孵育，洗滌；裂解，離心，吸取上清至封閉好的 平底酶標(biāo)板進(jìn)行反應(yīng)，洗滌；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG，孵育，洗滌，所述的 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，貨號(hào)：109-035-098 ;加入底物 TMB，顯色，加入終止液，檢測(cè)吸光度值；
[0033] 其中，
[0034] 針對(duì)HPA-Ia抗體檢測(cè)，加入反應(yīng)體系的小鼠單抗為小鼠抗人CD61單克隆抗體，購(gòu) 自美國(guó)BD公司，貨號(hào)：555752,加入濃度為20 μ g .mL S所述的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗 人IgG稀釋度為1:10000 ;
[0035] 針對(duì)HPA_3a抗體檢測(cè)，加入反應(yīng)體系的小鼠單抗為小鼠抗人⑶41a單克隆抗體， 購(gòu)自美國(guó)R&D公司，貨號(hào)：MAB7616,加入濃度為2 μ g · mL S所述的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 羊抗人IgG稀釋度為1:3000 ;
[0036] 針對(duì)HPA_5b抗體檢測(cè)，加入反應(yīng)體系的小鼠單抗為小鼠抗人CD49b單克隆抗體， 購(gòu)自美國(guó)R&D公司，貨號(hào)MAB1233,加入濃度為1 μ g ^mL S所述的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊 抗人IgG稀釋度為1:1000。
[0037] 優(yōu)選地，所述的血小板懸液調(diào)整至（1. 5-2. 5) X IO5/ μ L，MAIPA檢測(cè)過(guò)程中加入的 血小板懸液與血清標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)血清樣品的體積為（1. 8-2. 2) : 1。
[0038] 優(yōu)選地，加入小鼠單抗后37°C孵育25min-2h。
[0039] 優(yōu)選地，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG后37°C孵育25min-2h。
[0040] 還需要說(shuō)明的是，所述的平底酶標(biāo)板包被的步驟中，羊抗鼠 IgG充分包被平底酶 標(biāo)板的各個(gè)孔即可。
[0041] 所述的非診斷和治療目的是指不以疾病的診斷或治療為直接目的，例如用于統(tǒng)計(jì) 人群中HPA抗體分布情況等。
[0042] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0043] 本申請(qǐng)的發(fā)明人根據(jù)豐富的研究經(jīng)驗(yàn)從眾多因素中推定了可能對(duì)MAIPA檢測(cè)效 果產(chǎn)生顯著影響的因素，然后進(jìn)行了測(cè)試，最終確定小鼠抗人糖蛋白單克隆抗體的種類(lèi)、小 鼠抗人糖蛋白單克隆抗體的濃度、酶標(biāo)羊抗人IgG的稀釋度為影響MIPA檢測(cè)效果的重要 因素，結(jié)合研究經(jīng)驗(yàn)經(jīng)優(yōu)化獲得了針對(duì)HPA-la、HPA-3a、HPA-5b抗體的MAIPA最佳體系，該 最佳體系具備優(yōu)異的線性范圍、敏感度、特異性、準(zhǔn)確度和精密度，取得了顯著的效果。據(jù)此 本發(fā)明開(kāi)發(fā)了針對(duì)于HPA-la、HPA-3a、HPA-5b抗體的MAIPA檢測(cè)試劑盒，這在國(guó)內(nèi)外尚屬首 次，該試劑盒可用于臨床血清樣本的抗體特異性檢測(cè)，將有助于臨床相關(guān)疾病的診斷和治 療以及提高血小板輸注效果。
【附圖說(shuō)明】
[0044] 圖1.反應(yīng)體系的pH值對(duì)最終顯色OD值的影響。HPA-3a標(biāo)準(zhǔn)抗血清03/190濃度 為10AU，37°C孵育30分鐘，酶標(biāo)羊抗人IgG稀釋度為1:10000。
[0045] 圖2.加入增敏劑PEG對(duì)最終顯色OD值的影響。HPA-3a標(biāo)準(zhǔn)抗血清03/190濃度 為10AU，37°C孵育30分鐘，酶標(biāo)羊抗人IgG稀釋度為1:10000。
[0046] 圖3.小鼠單抗?jié)舛?