對(duì)最終顯色OD值的影響。第一行圖：針對(duì)HPA-Ia抗體的MAIPA 檢測(cè)結(jié)果；第二行圖：針對(duì)HPA-3a抗體的MAIPA檢測(cè)結(jié)果；第三行圖：針對(duì)HPA-5b抗體的 MAIPA檢測(cè)結(jié)果。
[0047] 圖4.酶標(biāo)羊抗人IgG稀釋度對(duì)最終顯色OD值的影響。左上圖：針對(duì)HPA-Ia抗體 的MAIPA檢測(cè)結(jié)果；右上圖：針對(duì)HPA-3a抗體的MAIPA檢測(cè)結(jié)果；左下圖：針對(duì)HPA-5b抗 體的MAIPA檢測(cè)結(jié)果。
[0048] 圖5.獻(xiàn)1?厶檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。（厶)即厶-1&，出)即厶-3&，（〇即厶-513。
[0049] 圖6.獻(xiàn)1卩八檢測(cè)的特異性。心即八-1&"8)即八-3&，（〇即八-513。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0051] 實(shí)施例1
[0052] 一、材料
[0053] 0型新鮮單采血小板來(lái)自上海市血液中心；HPA-la、HPA-3a、HPA-5b標(biāo)準(zhǔn)抗血清購(gòu) 自英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所（NIBSC)，貨號(hào)分別是：03/152、03/190、99/666 ;小鼠抗人CD61 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司，貨號(hào)：555752 ;小鼠抗人CD41a單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公 司，貨號(hào)：MAB7616 ;小鼠抗人CD49b單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司，貨號(hào)MAB1233 ;羊抗鼠 IgG單抗、辣根過(guò)氧化物酶（HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG均購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，貨號(hào)分別是 115-005-07U109-035-098 ;包被液、HRP底物TMB和終止液均購(gòu)自美國(guó)SurModics公司， 包被液商品名 ELISA Plate Coating Solution-lOXconcentrate，貨號(hào)：C0AT-0100-01， 終止液商品名 450nm Liquid Stop Solution For TMB Microwell Substrates，貨號(hào)： LSTP-1000-01。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0054] 二、方法
[0055] 1、平底酶標(biāo)板包被
[0056] 包被液稀釋羊抗鼠 IgG至3yg/mL，平底酶標(biāo)板每孔加入100yL，4°C靜置過(guò)夜。 TBS 洗滌液（Tris I. 21g，NaCl 8. 5g，CaCl20.0 55g，NP405mL，TweenO. 5mL，定容至 1L)洗滌 3次，TBS洗滌液浸泡30分鐘封閉。包被好的平底酶標(biāo)板可4°C保存2周。
[0057] 2、血小板準(zhǔn)備
[0058] 單采血小板用 PBS/EDTA (Na2EDTA 3. 35g，Na2HPO4 · 12H20 7. 52g，NaC18. 18g，pH 調(diào) 至7. 0,定容至1L)洗滌兩次，每次離心1455gX5min，棄上清。重新懸浮于PBS/EDTA中并 用血細(xì)胞分析儀（貝克曼庫(kù)爾特公司，美國(guó)）進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，濃度調(diào)整至約2X10 5/yL。
[0059] 3、MAIPA 實(shí)驗(yàn)方法
[0060] 在U形底微孔板中每孔加入100 μ L準(zhǔn)備好的血小板懸液，離心1455gX3min， 棄上清，在吸水紙上輕輕扣干。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在各孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗血清或待測(cè)血清 樣品50 μ L，將血小板輕輕吹打均勾，37°C孵育30分鐘。用PBS/EDTA洗滌2次，每次離心 1455gX3min，棄上清，在吸水紙上輕輕扣干。各孔加入鼠抗人血小板糖蛋白單抗（小鼠單 抗）40 μ L (稀釋液為0. 1 % BSA-PBS)，將血小板輕輕吹打均勻，37°C孵育30分鐘。用PBS/ Η)ΤΑ洗滌3次，每次離心2500rpmX 3min，棄上清，在吸水紙上輕輕扣干。
[0061] 每孔加入 130 μ L 裂解液（Tris 0· 6g，NaCl 4. 25g，NP402. 5mL，pH 調(diào)至 7. 4,定 容至0. 5L)，將血小板吹打懸浮，室溫裂解15分鐘。4°C離心3724gX 15min，每孔吸取上清 100 μ L至封閉好的平底酶標(biāo)板中，37°C反應(yīng)2小時(shí)。TBS洗滌液洗滌3次，每孔加入酶標(biāo)羊 抗人IgG (稀釋液為0. 1 % BSA-PBS)，37°C孵育30分鐘。TBS洗滌液洗滌3次，每孔加入底 物TMB，室溫顯色30分鐘，加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。
[0062] 4、MAIPA方法的鑒定
[0063] 4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0064] 配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗血清（03/152、03/190、99/666)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性擬合。
[0065] 4. 2敏感度試驗(yàn)
[0066] 對(duì)抗血清零標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定20次，以檢測(cè)值的r+3s為本方法敏感度。
[0067] 4. 3特異性試驗(yàn)
[0068] 分別對(duì)不同HPA抗體和單克隆抗體抗A、抗B、抗I、抗Pl進(jìn)行測(cè)定，觀察其陰陽(yáng)性。
[0069] 4. 4準(zhǔn)確性和精密度試驗(yàn)
[0070] 每個(gè)MAIPA體系選擇3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗血清進(jìn)行批內(nèi)測(cè)定12次，即在一次實(shí) 驗(yàn)中，每個(gè)濃度測(cè)量12個(gè)平行樣品；批間測(cè)定7次，即在7次實(shí)驗(yàn)中分別測(cè)量這些濃度的樣 品，分別計(jì)算其平均回收率和變異系數(shù)。
[0071] 按照以上方法，首先根據(jù)研究經(jīng)驗(yàn)推定可能影響MAIPA檢測(cè)效果的因素，然后測(cè) 試這些因素對(duì)MAIPA體系檢測(cè)效果的具體影響，以?xún)?yōu)化得到最佳的MAIPA檢測(cè)體系。
[0072] 三、結(jié)果
[0073] 1、條件優(yōu)化
[0074] 測(cè)試了反應(yīng)體系的pH值（即裂解液pH)、是否加入增敏劑PEG、小鼠單抗種類(lèi)、小 鼠單抗?jié)舛?、酶?biāo)羊抗人IgG稀釋度對(duì)MIPA體系檢測(cè)效果的影響。
[0075] 反應(yīng)體系的pH值對(duì)最終顯色OD值的影響見(jiàn)圖1。我們發(fā)現(xiàn)pH的降低對(duì)最終顯色 OD值有影響，但并不顯著。
[0076] 加入增敏劑PEG對(duì)最終顯色OD值的影響見(jiàn)圖2。表明加入增敏劑PEG可使反應(yīng)略 有增強(qiáng)，但不明顯。
[0077] 對(duì)于小鼠單抗種類(lèi)的選擇，現(xiàn)有技術(shù)中已知種類(lèi)很多。我們分別嘗試了不同品牌 的單抗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ebioscience公司的抗體特異性均較差，假陽(yáng)性現(xiàn)象嚴(yán)重；BD公司 的抗⑶41、⑶49b和R&D公司的抗⑶61敏感度較差，顯色很低；最終發(fā)現(xiàn)具備顯著優(yōu)勢(shì)的小 鼠單抗見(jiàn)表1。
[0078] 小鼠單抗?jié)舛葘?duì)最終顯色OD值的影響見(jiàn)圖3。據(jù)此我們確定了針對(duì)HPA-la、 HPA-3a、HPA-5b抗體的MAIPA體系中最佳小鼠單抗?jié)舛确謩e為20、2、1 μ g/mL。
[0079] 酶標(biāo)羊抗人IgG稀釋度對(duì)最終顯色OD值的影響見(jiàn)圖4。據(jù)此確定了針對(duì)HPA-la、 HPA-3a、HPA-5b抗體的MAIPA體系中最佳酶標(biāo)羊抗人IgG稀釋度分別為1:10000、1:3000、 I:1000 0
[0080] 經(jīng)優(yōu)化，針對(duì)HPA-la、HPA-3a、HPA-5b抗體的MAIPA體系的抗體選擇及最佳濃度如 表1所示。
[0081 ] 表1針對(duì)HPA-la、HPA-3a、HPA-5b抗體的MAIPA體系的條件優(yōu)化結(jié)果
[0082] CN 105137083 A 說(shuō)明書(shū) 6/8 頁(yè)
[0083] 2、MAIPA最佳體系的鑒定
[0084] 鑒定上述針對(duì)HPA-1 a、HPA-3a、HPA-5b抗體的最佳MAIPA體系的實(shí)際檢測(cè)效果，包 括制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)敏感度、特異性、準(zhǔn)確度和精密度。
[0085] 2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0086] 針對(duì)HPA-la、HPA-3a、HPA-5b抗體的最佳MAIPA體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。它 們?cè)谄錂z測(cè)范圍內(nèi)（〇~4IU，0~20AU，0~20AU)均具有良好的線性（R 2> 0. 99)。
[0087] 2. 2敏感度
[0088] 抗血清零標(biāo)準(zhǔn)品20次測(cè)定的OD值、SD值以及敏感度見(jiàn)表2。
[0089] 表2針對(duì)HPA-la、HPA-3a、HPA-5b抗體的MAIPA檢測(cè)的敏感度
[0090]
[0092] *敏感度表示待測(cè)抗體濃度可被該方法檢出的最低濃度。
[0093] 2. 3特異性
[0094] 除了 HPA以外，血小板表面也可能表達(dá)一些其他抗原（如AB抗原、I抗原、P抗原 等）。分別對(duì)其相應(yīng)抗體進(jìn)行測(cè)定，觀察其陰陽(yáng)性。結(jié)果如圖6所示，表明該MAIPA體系具 有較好的特異性。
[0095] 2. 4準(zhǔn)確度和精密度
[0096] 標(biāo)準(zhǔn)抗血清03/152, 03/190, 99/666各選取線性范圍內(nèi)的3個(gè)不同濃度值，用于準(zhǔn) 確度和精密度的檢測(cè)。對(duì)于每一個(gè)濃度，我們計(jì)算了批內(nèi)和批間的平均值、回收率和變異系 數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3~5。結(jié)果顯示，該MIPA體系具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。
[0097] 表3 HPA-Ia抗體MAIPA檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度
[0098] UiN 丄 丄 CUUOO Λ J I < i / O
[0099] 表4 HPA-3a抗體MAIPA檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度
[0100]
[0101] 表5 HPA-5b抗體MAIPA檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度
[0102]
[0103] 實(shí)施例2
[0104] 針對(duì)HPA-Ia抗體的MAIPA檢測(cè)試劑盒，包含以下組分：
[0105] 1)小鼠抗人⑶61單克隆抗體，購(gòu)