] 術(shù)語"結(jié)合抗原的"抗原結(jié)合部分用于指示存在于實(shí)驗(yàn)動物或患者的循環(huán)中的結(jié) 合其抗原的抗原結(jié)合部分。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，結(jié)合抗原的抗原結(jié)合部分為抗體。在 進(jìn)一步的實(shí)施方式中，結(jié)合抗原的抗原結(jié)合部分為治療性抗體。
[0131] 術(shù)語"未結(jié)合的"抗原結(jié)合部分用于指示存在于實(shí)驗(yàn)動物或患者的循環(huán)中的未結(jié) 合其抗原的抗原結(jié)合部分。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，抗原結(jié)合部分為抗體或其片段。在進(jìn) 一步的實(shí)施方式中，抗原結(jié)合部分為治療性抗體。
[0132] 術(shù)語"集合"或"文庫"意指至少兩個成員。術(shù)語"成員"包括但不限于，編碼抗體 或其片段的核酸，或抗體或其片段本身。
[0133] 術(shù)語"文庫"意指一組實(shí)體，其包含兩個或多個具有如本文所描述的多樣性的實(shí) 體。例如，"抗體或抗體片段的文庫"意指一組多核苷酸，其包含兩個或多個編碼抗體或抗 體片段、并具有本文所描述的多樣性的多核苷酸。例如可使用市售的噬菌體展示文庫，例如 MorphoSys HuCALPLATINUM?文庫。
[0134] 本文使用的術(shù)語"多樣性"意指多種多樣或明顯的異質(zhì)性。
[0135] 術(shù)語"骨架"意指由Kabat等（1991)定義為作為可變結(jié)構(gòu)域的一部分用作該可變 結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)（antigen binding loop)的支架的抗體可變結(jié)構(gòu)域。骨架區(qū)的例子 包括可變重鏈或可變輕鏈的FR1、FR2、FR3或FR4。
[0136] 術(shù)語"同種型"意指由重鏈恒定區(qū)基因提供的抗體類別（例如IgM、IgE、IgG(如 IgGl或IgG4))。同種型也包括這些類別中的一類的修飾版本，其中作出修飾以改變Fc功 能，例如，以增強(qiáng)或降低效應(yīng)子功能或與Fc受體的結(jié)合。
[0137] "抗獨(dú)特型抗體"是指特異性地結(jié)合另一抗體的抗原結(jié)合區(qū)并因此特異性地被所 述另一抗體結(jié)合的一種抗體。抗獨(dú)特型抗體可模擬另一抗體通常所識別的表位。獨(dú)特型是 在免疫球蛋白可變區(qū)中由基因決定的結(jié)構(gòu)變化。獨(dú)特型變異的確切遺傳學(xué)基礎(chǔ)只得到部分 解釋。然而，獨(dú)特型變異涉及，尤其是在抗原結(jié)合區(qū)的區(qū)域中的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) (所謂的決定子），也稱為獨(dú)特位（idiotope)。術(shù)語"獨(dú)特型"指定抗體分子的可變區(qū)的全 套決定子。
[0138] 術(shù)語"氨基酸"意指天然存在的氨基酸以及合成氨基酸，以及以類似于天然存在的 氨基酸的方式發(fā)揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼 所編碼的氨基酸，以及后來經(jīng)過修飾的那些氨基酸，例如羥基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸以及 〇-磷酸絲氨酸（〇-phosphoserine)。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基 本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即一個a碳，該a碳結(jié)合至氫、羧基、氨基以及R基，例如高絲氨酸、 正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基硫。這些類似物具有經(jīng)修飾的R基（例如正亮氨酸）或 經(jīng)修飾的肽主鏈，但仍然保持有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物 意指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)、但以類似于天然氨基酸的方式發(fā)揮功能的 化合物。
[0139] 術(shù)語"核酸"在本文中與術(shù)語"多核苷酸"可互換使用，并意指脫氧核糖核苷酸或 核糖核苷酸以及其呈單鏈或雙鏈形式的聚合物。該術(shù)語涵蓋含有已知的核苷酸類似物或經(jīng) 修飾的主鏈殘基或鍵合的核酸，這些核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的，具有類 似于參考核酸的結(jié)合特性，并且以類似于參考核苷酸的方式代謝。這些類似物的實(shí)例包括 但不限于硫代磷酸醋類（phosphorothioates)、氨基磷酸醋類（phosphoramidates)、甲基 膦酸酯類、手性-甲基膦酸酯類、2-0-甲基核糖核苷酸類、肽-核酸（PNA)。除非另外指出， 否則特定的核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變體（例如簡并密碼子替換）和互補(bǔ)序 列，以及明確表明的序列。確切地，具體如下，簡并密碼子替換可通過產(chǎn)生如下序列來達(dá)成， 在該序列中一個或多個選定的（或全部）密碼子的第三位置使用混合堿基和/或脫氧肌苷 殘基進(jìn)行替換（Batzer 等（1991) Nucleic Acid Res. 19:5081 ;0htsuka 等（1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608 和 Rossolini 等（1994)Mol. Cell. Probes 8:91-98)。
[0140] 術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"（或只是"宿主細(xì)胞"）是指已引入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng) 當(dāng)理解，這樣的術(shù)語不僅意指特定對象細(xì)胞，且亦指這種細(xì)胞的后代。由于某些修飾由于突 變或環(huán)境影響可出現(xiàn)在后代中，使這種后代事實(shí)上可能與親代細(xì)胞不相同，但仍被包括在 如本文所用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)。
[0141] 本文所用的術(shù)語"載體"是指用于將外源遺傳材料導(dǎo)入另一個細(xì)胞的分子載體。載 體本身通常是DNA序列，其由插入物（目標(biāo)序列）和起載體"骨架"作用的較長序列組成。 將遺傳信息轉(zhuǎn)入另一個細(xì)胞的載體的目的通常是在靶細(xì)胞中分離、倍增或表達(dá)插入物。
[0142] 如本文中使用的術(shù)語"橫向流動"是指沿著基底或載體平面（例如橫向流動膜） 的液體流動。一般而言，橫向流動裝置包含條帶（或流體連通的多個條帶），條帶的材料使 其可通過毛細(xì)作用（即芯吸或?qū)游鲎饔茫┹斔腿芤?，其中條帶中不同的區(qū)域或地帶包含測 定試劑，其擴(kuò)散或不擴(kuò)散地結(jié)合底物，并當(dāng)溶液輸送至或迀移通過這樣的區(qū)域時，產(chǎn)生可檢 測的信號。通常，此類測定包含適于接受液體樣品的施加區(qū)域、與施加區(qū)域橫向間隔并與其 流體連通的試劑區(qū)域以及與試劑區(qū)域橫向間隔并與其流體連通的檢測區(qū)域。試劑區(qū)域可包 含化合物（例如抗體），其可在液體中移動，并可與樣品中的分析物相互作用（例如形成分 析物-試劑復(fù)合物）和/或與結(jié)合于檢測區(qū)域的分子相互作用。檢測區(qū)域可包含結(jié)合分子 (如抗體），其固定在條帶上，并能與分析物和/或試劑和/或分析物-試劑復(fù)合物相互作 用，以產(chǎn)生可檢測的信號?？墒褂么祟悳y定法通過直接的（夾心測定）或競爭性結(jié)合來檢 測樣品中的分析物。橫向流動裝置的實(shí)例在US 6, 194, 220、US 5, 998, 221和US5, 798, 273 中提供。
[0143] 表1 :序列
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[0146]
CN104995517A 說明書 19/24 頁
[0147]
[0148] 實(shí)施例
[0149]牛成特異于抗體/抗原復(fù)合物的Fab片段和抗體
[0150] 使用市售的菌體展示文庫--MorphoSys HuCALPLATINUM?文庫，進(jìn)行特 異性識別抗體/抗原復(fù)合物的抗體的選擇。所述抗體文庫基于HllCAL?概念（Knappik 等，（2000) J Mol Biol 296:57-86)，并采用CysDisplay?技術(shù)以將Fab展示在噬菌體表面 上（W02001/05950，Lohning)。然而，任何其它可用的抗體庫也將適用于鑒定復(fù)合物特異性 的抗體。
[0151] 為鑒定抗體/抗原復(fù)合物特異性抗體，已開發(fā)淘選策略（panning strategy)以革巴 向抗體/抗原復(fù)合物。由此，使用純化的重組抗原及其各自的重組治療性抗體進(jìn)行淘選。 根據(jù)下文所描述的實(shí)施例，對于3種不同的抗體/抗原復(fù)合物，鑒定僅結(jié)合特定復(fù)合體的抗 體。所有描述的淘選策略和抗原用于抗體選擇過程。每種淘選策略包含至少3輪單獨(dú)的淘 選，且包含獨(dú)特的抗原、抗體濃度和洗絳嚴(yán)謹(jǐn)度（washing stringency)。
[0152]實(shí)施例1 :特異于阿汰太單抗/TNF-a復(fù)合物的Fab片段和抗體的牛成和表征
[0153] 為鑒定特異性地結(jié)合阿達(dá)木單抗/TNF-a復(fù)合物的抗體，使用與磁珠（magnetic beads)結(jié)合的重組TNF-a (BioLegend 570108,批號B137143)和阿達(dá)木單抗，作為溶液淘 選方法的抗原。
[0154] a)淘選
[0155] 對于溶液淘選，將TNF-a共價(jià)結(jié)合到Epoxy M-450磁珠（Dynabeads M_450，Dynal)，對菌體展示抗體文庫（phage display antibody library)的菌體制備 物進(jìn)行洗絳，使用Chemiblocker(Chemicon)進(jìn)行封閉。
[0156] 為提供阿達(dá)木單抗/TNF-a復(fù)合物，將結(jié)合到磁珠的重組TNF-a與阿達(dá)木單抗 一起預(yù)孵育。對于第一輪淘選，在Chemiblocker (Chemicon)和Tween/PBS的存在下，在純 化人 IgGlkappa(50 y g/mL)、10 % 人血清、50 y g/ml 利妥昔單抗（IgGlkappa)以及 1 y g/ mL TNF-a的存在下將噬菌體抗體加至阿達(dá)木單抗/TNF-a復(fù)合物，以吸附所有特異于 IgGlkappa和游離TNF-a、或與人血清中的任何組分交叉反應(yīng)的噬菌體抗體。當(dāng)在旋轉(zhuǎn)器 上于2至8°C孵育過夜后，將噬菌體-抗原混合物轉(zhuǎn)移至試管，并使用磁性分離器捕獲磁珠。 從磁珠小心地移除上清液，并使用PBST洗滌剩余的磁珠。
[0157] 以類似的方式進(jìn)行隨后的第2和第3輪淘選，并以遞增濃度的游離TNF-a (第2 輪淘選中5 y g/ml ;第3輪淘選中25 y g/ml)增加嚴(yán)謹(jǐn)度，棄掉與游離TNF- a交叉反應(yīng)的 抗體。
[0158] 在每一輪的淘選中，余下的噬菌體被洗脫，且將洗脫的噬菌體立刻用于E.Coli TG1細(xì)菌的感染。在使用輔助噬菌體救援（rescue)噬菌體后，對多克隆擴(kuò)增的噬菌體產(chǎn) 出再次滴定，并在連續(xù)的選擇步驟中使用。在第3輪的淘選后，將從感染的細(xì)菌中分離出 洗脫的抗原特異性噬菌體DNA，且將Fab編碼的DNA通過PCR亞克隆到特異的Fab表達(dá)載 體中。在TG1-F細(xì)菌轉(zhuǎn)化后，使用Fab編碼載體，進(jìn)行包含HuCAL Fab片段的周質(zhì)提取物 (periplasmic extract)的單克隆表達(dá)和制備。使用含F(xiàn)ab周質(zhì)提取物進(jìn)行初步篩選和表 征。
[0159] 使用純化的Fab進(jìn)行進(jìn)一步的表征。在搖瓶培養(yǎng)中使用補(bǔ)充有ImM氯霉素和0. 1% 葡萄糖的500ml的2 X YT培養(yǎng)基進(jìn)行TG-1細(xì)胞中Fab片段的表達(dá)。通過添加0. 75mM IPTG， 在30°C下20小時誘導(dǎo)表達(dá)。使用含有溶菌酶、Bugbuster、核酸酶（Benzonase)和由Ni-NTA 層析（Bio-Rad，德國）分離的Fab片段的裂解緩沖液來破壞細(xì)胞。使用UV分光光度法測定 蛋白質(zhì)濃度。在變性、還原的狀態(tài)中使用SDS-PAGE，以及在自然狀態(tài)（native state)中使 用HP-SEC，分析Fab片段的純度。
[0160] 為了表達(dá)全長IgG，從Fab表達(dá)載體亞克隆重鏈（VH)和輕鏈（VL)的可變域片段到 人 IgG2、人 IgG4、人 IgG4_Pro 和人 IgGlf LALA 的合適的pMORPH?_hIg載體中。
[0161] b)篩查
[0162] 使用ELISA進(jìn)行初次篩查。在上文所描述的淘選步驟的產(chǎn)出中隨機(jī)挑選368個克 隆，并使其在384孔ELISA板中生長。在誘導(dǎo)抗體表達(dá)（0. 75mM IPTG，30°C下20小時）和 使用溶菌酶進(jìn)行細(xì)胞裂解后，將含有抗體的細(xì)胞裂解物在ELISA中進(jìn)行測試。
[0163] 因此，將下文中的抗原在ELISA板上進(jìn)行涂覆：阿達(dá)木單抗/TNF-a復(fù)合物、來自 骨髓瘤細(xì)胞系的純化人IgGl/kappa、利妥昔單抗及游離的重組TNF-a。
[0164] 總共識別出12個對復(fù)合物顯示陽性（信號為背景的至少5倍以上）、但不結(jié)合其 它抗原的克隆。因此，將這12個克隆進(jìn)行測序，以鑒定獨(dú)特抗體?？设b定出七個獨(dú)特的序 列。對這7個克隆進(jìn)行表達(dá)和純化，并隨后表征。
[0165] c)表征
[0166] 首先，在ELISA中，將這7個抗體針對一系列不相關(guān)和相關(guān)的抗原和阿達(dá)木單抗/ TNF-a復(fù)合物進(jìn)行特異性結(jié)合測試，其中阿達(dá)木單抗涂覆在板上并用TNF-a來形成復(fù)合 物，或反過來。由此，在微量滴定板上涂覆5 y g/mL的各抗原，過夜。在使用5% BSA洗滌和 封閉后，加入Fab-FH(來自2yg/mL溶液的20yL)形式的抗阿達(dá)木單抗/TNF-a抗體。使 用HRP標(biāo)記的抗His抗體和QuantaBlu焚光過氧化酶底物進(jìn)行檢測。已證明AdaTNF#l和 AdaTNF#5高度特異于復(fù)合物（圖1)。
[0167] 在下一步驟中，通過在不同的固定化抗原上滴定抗體，更具體地測試AdaTNF#5。在 測試的濃度范圍內(nèi)（0. 03至2000ng/mL)，所述的抗體僅與阿達(dá)木單抗/TNF- a復(fù)合物結(jié)合， 而不與英夫利昔單抗/TNF-a復(fù)合物、未結(jié)合的阿達(dá)木單抗、游離的TNF-a或其它抗原結(jié) 合（圖2)。
[0168] 將AdaTNF#5轉(zhuǎn)化為全長人IgGl形式，在人細(xì)胞系中表達(dá)，并通過蛋白質(zhì)A層析純 化，以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。首先，對所述抗體在（二價(jià)的）IgGl形式中是否仍顯示相同的 特異性進(jìn)行測試。以5yg/mL在微量滴定板上涂覆抗原過夜。在使用5% BSA洗滌和封閉 后，加入HRP結(jié)合的AdaTNF#5-hIgGl (HiSpec緩沖液中，來自2 y g/mL溶液的20 y L)。使用 QuantaB丨u?熒光過氧化酶底物進(jìn)行檢測。HPR結(jié)合的純化的AdaTNF#5-hIgGl特異性地 結(jié)合阿達(dá)木單抗