可規(guī)?；镌胤治龅闹谱鞣椒?br>【專利說明】可規(guī)?；镌胤治?br>[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求與2012年7月3日提交的美國臨時專利申請序列第61/667, 930號的 權益，該臨時申請以其整體通過參考引入本文。 【背景技術】 技術領域
[0003]
[0004] 本發(fā)明涉及對樣品或系列樣品中的一個或多個分析物進行檢測。更具體而言，本 發(fā)明涉及用于測定生物元素種群中的一種或多種生物元素（例如生物細胞）的方法。
[0005] 相關技術
[0006] 利用常規(guī)技術，可對生物學文庫篩選含有例如細胞、抗體、蛋白質、肽和核酸的組 分。這些技術包括噬菌體展示、核糖體展示、酵母細菌展示、體外區(qū)分、微雕法和空間尋址 (spatial addressing)。這類體系具有很多缺點，包括需要經由選擇步驟（包括例如"淘 洗"）來富集所需克隆，該步驟固有地導致潛在結合候選物的損失。此外，難以利用常規(guī)技 術建立正信號的精確起源，這是因為常規(guī)技術從異源種群獲取混合信號，而不能被去卷積。 通常，這些技術涉及利用噬菌體、核糖體和特定細胞的選擇過程，大部分過程在體外進行。
[0007] 文庫篩選上的改進已經引入了空間尋址的概念，以便在選擇過程中保持所篩選組 分的身份。這類尋址可基于包括機器人學、酶聯免疫吸附測定或基于細胞的測定在內的技 術。盡管空間尋址例如能夠鑒定特定細胞克隆以產生原種，但是這些方法不利于高通量篩 選技術來選擇性分離并純化已鑒定克隆以便迅速用于疾病診斷和治療。目前篩選方法另一 缺點在于其通常局限于約5-10萬之間的細胞數。
[0008] 對于進行基于細胞的篩選，最特別的挑戰(zhàn)之一在于以允許實施隨后的篩選步驟的 方式來分離小的細胞種群。傳統(tǒng)的分離細胞的裝置和方法不適于在不執(zhí)行可潛在改變細胞 功能或活性的步驟的情況下提供小的細胞種群的分離。細胞分離不僅在篩選方面是重要 的，而且在涉及監(jiān)控、測量和/或利用細胞活性或功能（例如抗體制備）輸出的過程中也是 重要的。
[0009] 因此，對從背景種群中分離少量特定細胞的需求是普遍的，其應用于病理學、臨床 診斷、克隆和細胞生物學研宄。目前的篩選方法具有很多技術挑戰(zhàn)，包括：所展示的蛋白質 的尺寸必須要小，復合感染要高以便避免多樣性損失，對噬菌體活性的依賴性、多重淘洗過 程是必需的（需要1周或更多），由于噬菌體、抗體，高度非特異性結合以可溶形式可能不能 很好行使功能（通常表達截短的克?。?或親和力效應可能阻礙對高親和力克隆的選 擇。
[0010] 因此，本發(fā)明人已經認識到在本領域中對鑒定、分離及表征生物種群組分的更有 效的方法存在需求。
【發(fā)明內容】

[0011] 在一個方面，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中的分析物的方法。所述方法部分基于樣 品中的微粒部分或完全抑制電磁輻射經過含樣品的容器中的檢測表面而傳播到樣品中及 從中傳播出來的能力。在一個實施方式中，該方法包括向含樣品溶液的反應容器中添加第 一顆粒和發(fā)射電磁輻射的第一標記，其中該第一標記結合于第一顆粒，或者由于所述樣品 中存在或缺乏分析物之故，該第一標記變得結合于第一顆粒。第一顆粒積聚在第一檢測表 面處，以抑制電磁輻射經由該表面?zhèn)鞑ミM入樣品中以及從中傳播出來。檢測從該第一檢測 表面發(fā)射出的電磁輻射的存在或其量。第一顆?？捎捎谑┘佑跇悠返牧χ识e聚于檢測 表面處，其中該力選自重力、磁力、電力、離心力、對流力和聲學力。在一個方面，標記結合于 顆粒，且由于樣品中分析物的存在或缺乏之故而被釋放。
[0012] 在進一步的實施方式中，本發(fā)明的方法包括向容器中添加發(fā)射電磁輻射的第二標 記以及至少形狀、尺寸、密度、磁導率、電荷及光學涂層中至少之一而不同于第一顆粒的第 二顆粒，其中該第二標記結合于第二顆粒，或者由于所述樣品中存在或缺乏第二分析物之 故，該第二標記變成結合于第二顆粒。第二顆粒積聚在第二檢測表面處，以抑制電磁輻射經 由該第二檢測表面?zhèn)鞑ミM入樣品中以及從中傳播出來。檢測在該第二檢測表面處發(fā)射出的 電磁輻射的存在或量。在該實施方式的各種方面中，第一顆粒由于第一力而積聚于第一檢 測表面處，而第二顆粒由于第二力而積聚于第二檢測表面處，其中第一力和第二力獨立選 自重力、磁力、電力、離心力、對流力和聲學力，并且其中第一力和第二力被同時或順序施加 于樣品?；蛘撸诙w?？煞e聚在第一檢測表面處，以抑制電磁輻射經由該第一檢測表面?zhèn)?播進入樣品中以及從中傳播出來，其中第一顆粒由于第一力而積聚于第一檢測表面處，而 第二顆粒由于第二力而積聚于第一檢測表面處，其中第一力和第二力獨立選自重力、磁力、 電力、離心力、對流力和聲學力，其中第一力和第二力被順序施加于樣品?？稍谠摰谝粰z測 表面處檢測從第一顆粒和第二顆粒發(fā)射出的電磁輻射的存在或其量。
[0013] 仍更進一步，本發(fā)明涉及從生物元素的異源種群中檢測靶標生物元素的方法。該 方法包括：將生物元素的異源種群分布到容器陣列中；向該陣列容器中添加顆粒和激活后 發(fā)射電磁輻射的第一標記，其中第一標記結合于第一顆粒，或者由于樣品中的分析物存在 或缺乏之故第一標記變成結合于第一顆粒的；向陣列施加力，以使顆粒積聚于各容器中的 樣品表面上；鑒定由容器發(fā)射的電磁輻射的存在或其量，從而鑒定出含有靶標生物元素的 容器。容器陣列可以是具有多個縱向融合的毛細管的微腔陣列，毛細管的直徑為約1至約 500微米。另外，陣列可具有每平方厘米陣列約300-64, 000, 000個毛細管。樣品可以以意 圖在各容器中引入至多單個生物元素的濃度加至陣列中。
[0014] 在本發(fā)明的各種實施方式中，容器或器皿是具有檢測表面的微腔，所述檢測表面 是微腔中樣品溶液的彎液面?？捎糜谕ㄟ^施加磁場混合樣品，以使顆粒在樣品溶液內移動， 其中顆粒是磁性的。
[0015] 另外，生物元素可以是微生物、細胞、蛋白質、核酸、脂類、糖類、代謝物或小分子。 例如，細胞產生重組蛋白，諸如酶或抗體。
[0016] 仍進一步，本發(fā)明涉及在微腔陣列中從與電磁輻射吸收材料相結合的單微腔中提 取包含生物元素的溶液。該方法包括將電磁輻射集中在微腔處以產生材料或樣品的膨脹或 者樣品的蒸發(fā)，這將至少部分樣品從微腔中排出。在各種實施方式中，材料包括在微腔中的 顆粒，或者材料是至少部分涂覆或覆蓋微腔的高熱膨脹材料。
[0017] 附圖簡述
[0018] 圖1是本文公開方法的代表性實施方式的示意圖。
[0019] 圖2圖解了根據本公開使用的高密度陣列的一個實施方式的實例。
[0020] 圖3圖解了向陣列容器中添加或加載含分析物和其他生物元素的樣品的一個實 施方式。
[0021] 圖4圖解了用于掃描并鑒定產生信號的孔的方法的一個實施方式。由于已標記顆 粒積聚于孔的檢測表面出，這些孔表現為高強度斑點。在一個如本文所實施的測定設計中， 諸如夾心法，具有強信號的孔將被選擇用于提取和進一步的制備。在如本文所實施的另一 測定設計中，諸如酶活性測定，不選擇具有強信號的孔。反而，將選擇顯示最少信號或無信 號的孔。
[0022] 圖5圖解了顆粒抑制來自溶液中未結合于顆粒的標記的信號的能力。
[0023] 圖6圖解了蛋白質結合與檢測測定可在如本文所公開的孔中直接進行。在該實施 方式中，陣列的所有孔包括熒光標記的（Atto 590)鏈霉親和素和涂覆有生物素（A部分：正 對照）和寡聚（dT)25(01igo (dT)25) (B部分：負對照）的磁珠。
[0024] 圖7展示了所公開方法在單細胞水平上的特異性。在該實施方式中，陣列的所有 孔包含表達重組蛋白質GFP的大腸桿菌細胞。各孔還含有涂覆有鼠抗-GFP抗體（正對照） 的磁珠和涂覆有寡聚（dT) 25(負對照）的磁珠。
[0025] 圖8展示了本文公開的方法無需細胞溶解來進行分析物檢測。在這些實施方式 中，陣列被加載表達重組蛋白質GFP的大腸桿菌細胞。各孔也含有熒光標記（Atto 590)，其 也結合于鼠抗-GFP抗體。兩種正對照孔含有與抗GFP抗體結合的磁珠，但是一個陣列的孔 在檢測前利用超聲處理來溶解。負對照陣列利用產生處理溶解，且含有寡聚-dT珠，該珠普 遍抑制來自陣列中所有孔的信號。
[0026] 圖9是一種單孔提取方法的示意圖。
[0027] 圖10展示了試劑、顆?；蚱渌肿涌梢员患又梁毎年嚵兄谢蛘邚闹腥サ舳?不會干擾細胞。在不打擾預加載ffiK 293細胞的情況下，將碘化丙啶（PI)加載到微孔中。 A部分：PI加載前，具有最小的背景信號。B部分：加載已經被插入無活性的HEK 293細胞 的彎液面中的PI之后。
[0028] 實施方式詳述
[0029] 本發(fā)明涉及用于檢測樣品中的分析物的方法、裝置和試劑盒。在各種實施方式中， 本發(fā)明涉及篩選生物元素大種群中生物元素亞種群或單一元素的存在或缺乏。本發(fā)明可用 于從數百萬或數億生物元素的異源種群中發(fā)現、表征和選擇特異性相互作用。
[0030] 本發(fā)明利用生物測定技術，其中功能化顆粒積聚在樣品容器的表面出并部分或完 全地物理抑制電磁輻射傳播進入樣品液中和/或從中傳播出來。在【具體實施方式】中，通過 檢測自每個腔中發(fā)射的電磁信號來篩選高密度微腔，例如微孔。可利用下述陣列實現高靈 敏度：該陣列的排列使得每個腔含有能夠抑制進入每個腔和/或從中出來的電磁輻射（EM) 的單個或數個生物元素和微粒。通過使用微腔陣列和基于同源顆粒的測定，本發(fā)明的方法 提供規(guī)模性單細胞分析。該方法可用于在大的復合混合物中發(fā)現非常少的（|1〇 8之1)生 物元素，例如細胞。
[0031] 本發(fā)明提供優(yōu)于其他生物元素種群篩選方法的若干優(yōu)點。首先，其允許數百萬、數 億或更多的平行的生物相互作用的樣品篩選。本發(fā)明還允許分析物（諸如靶細胞）的展示 和獨立發(fā)現。另外，其平行地提供數億克隆的濃度對親和性信息（例如，對每個所表達基因 可提供對生產效率的反饋）。
[0032] 在一個實施方式中，公開了利用微腔陣列（例如多孔玻璃陣列）從數千、數百萬 甚或數億細胞克隆種群中選擇產生亞種群抗體的生物細胞克?。ɡ?，單個或若干細胞克 ?。┑姆椒?。在一個實施方式中，微腔被填充含有具有抗體（或任何感興趣蛋白質）產生 基因的生物細胞克隆的溶液（例如，培養(yǎng)基）。細胞使抗體在培養(yǎng)基中生長并表達，該抗體 可與固定于培養(yǎng)基內的顆粒上的結合配體反應并結合。通過向培養(yǎng)基中添加熒光試劑（例 如，熒光標記的抗-分析物抗體）可檢測抗原-抗體復合物。
[0033] 在一個實施方式中，所述方法包括從微孔陣列中回收生物細胞。在一個實施方式 中，生物細胞包括產生熒光蛋白質的細胞。在一個實施方式中，生物細胞包括產生融合于非 焚光蛋白質的焚光蛋白質的細胞。
[0034] 本發(fā)明可用于分離任何類型的生物細胞，包括但不限于：表達或產生蛋白質類、糖 類、酶類、肽類、激素類、受體類的細胞系；產生抗體的其他細胞系；基因工程細胞；和激活 細胞。此外，本發(fā)明可用于篩選多種生物活性，包括但不限于：表面受體蛋白質的表達、酶生 產和肽生產。此外，本發(fā)明還用于篩選多種測試劑以測定該測試劑對所述生物活性的效果。 本領域技術人員將容易理解需要進行分離和篩選的其他類型的細胞、需要進行檢測的其他 類型的生物活性以及待被篩選的特異性測試劑。
[0035] 定義
[0036] 除非另外定義，本文使用的技術和科學術語與本領域技術人員通常理解的具有相 同的含義。本文所提及的所有公開、專利申請、專利及其他參考文件如果沒有例外指示，均 通過參考明確引入。
[0037] 如本文所用，單數形式"一個（〃&，〃〃&11〃）"和"該（〃也，）"，包括復數指代，除非 上下文明確另外指示。
[0038] 如本文所用，術語〃結合配體（binding partner) 〃、〃配體（ligand) 〃或〃受體 (receptor)"可以是任意大量的不同分子或聚集體，并且所述術語可互換使用。在各種實施 方式中，結合配體可與被檢測的分析物締合或結合。蛋白質、多肽、肽、核酸（核苷酸、寡核 苷酸和多核苷酸）、抗體、糖類、多糖、脂類、受體、測試化合物（特別是那些太過組合化學制 備的化合物）每個可以是結合配體。
[0039] 術語〃生物細胞〃是指來自生物體的任何細胞，包括但不限于病毒細胞、昆蟲細 胞、微生物細胞、真菌細胞（例如，酵母）或動物（例如，哺乳動物）細胞。
[0040] 如本文所用，術語〃生物元素（biological element) "是指任何生物活性分子。 這些分子的非限定性實例包括蛋白質、核酸、肽、抗體、抗體片段、酶、激素、生物細胞和小分 子。
[0041] "分析物"通常指樣品中的感興趣元素，例如，生物樣品中的感興趣生物元素。 [0042] 如本文所用，術語〃結合〃或〃附著〃包括包括任何物理連接或緊密締合，其可以 是永久性的或臨時性的。這些物理連接或緊密締合可以是相互作用。這些締合的非限定性 實例為氫鍵合、疏水力、范德華力、共價鍵合和/或離子鍵合。這些相互作用可促進感興趣 分子與被測量分析物之間的物理連接。"結合"相互作用可以是簡短的，如在結合引發(fā)化學 反應發(fā)生的情況中，諸如例如，當結合組分是酶，而分析物是該酶的底物時。
[0043] 由結合劑與分析物之間的接觸產生的特異性結合反應也在該定義內。此類反應是 例如抗體與例如蛋白質或肽之間的相互作用結果，使得該相互作用取決于蛋白質上特定結 構（例如，抗原決定簇或表位）的存在。換言之，抗體識別并結合于特異性蛋白質結構，而 非通常的蛋白質。例如，如果抗體對表位"A"具有特異性，則含表位A(或游離的未標記的 A)的蛋白質在含經標記"A〃和抗體的反應中的存在將降低結合于該抗體的經標記A的量。 特異性結合相互作用也可發(fā)生于其他分子之間，包括例如蛋白質-蛋白質相互作用、蛋白 質-小分子相互作用、抗體_小分子相互作用以及蛋白質、糖類相互作用。這些相互作用中 的每一種可以發(fā)生于細胞的表面。
[0044] 術語〃陣列〃和〃微陣列〃可互換使用，區(qū)別通常僅在于大小。在各種實施方式 中，陣列通常含有多種（典型為100到超過1，〇〇〇, 〇〇〇)不同的反應空間，用于細孔、孔、腔、 內容器或貯器，其中各容器可位于已知的位置且含有單個或多個感興趣組分。
[0045] 如本文所用，術語〃樣品〃以其最寬含義使用，且包括環(huán)境和生物樣品。環(huán)境樣