粒。不含鏈霉親和素的情 況下，與抗GFP抗體綴合的生物素不與磁性顆粒相互作用或者不與其結合。因此，磁性顆 粒、抗-GFP抗體和抗-GFP標記保留于溶液中。溫育后，使陣列暴露于磁力，其將顆粒移動 至檢測表面。EM輻射暴露后使陣列成像。因為寡聚-dT磁性顆粒未與任何標記結合，其因 此積聚至檢測表面并抑制EM輻射到達溶液中的標記。該顆粒還可用于抑制檢測器檢測從 未結合于磁性顆粒的標記發(fā)出的EM輻射。如果量化來自各陣列的熒光的量，則來自特異性 抗GFP磁珠的發(fā)射充分高于負對照寡（dt)珠。
[0198] 因此，該實驗顯示如公開的磁珠抑制方法通過專門抑制孔信號能夠選擇含分析物 的孔。
[0199] 實施例3 :單細胞特異性檢測
[0200] 下述實施例展示了所公開的方法用于檢測單細胞水平的特異性。
[0201] 在該實施方式中，根據(jù)實施例2所述的步驟建立測定體系，只是在鋪板細胞之前， 將細菌細胞稀釋到300細胞/ y L，對其計算，在含直徑20 y m的孔的陣列板上產生約0. 1細 胞/孔。當加至陣列時，該稀釋在大部分孔中將至多產生單細菌細胞。
[0202] 如所述，將抗-GFP鏈霉親和素珠和抗-GFP標記加至第一陣列。當磁珠積聚之后 EM輻射暴露于陣列時所見的相應信號示于圖7A中。很多細胞產生信號，其代表來自經由 鏈霉親和素-生物素鍵結合于抗GFP抗體的鏈霉親和素磁珠的熒光信號。施加磁力后，僅 表達分析物靶蛋白（GFP)并因此使珠與標記結合的細胞提供正信號。然而，伴隨單細胞稀 釋同樣觀察到的是具有減小的信號或沒有信號的孔。這些孔最可能缺乏任何GFP-產生細 胞和/或含有不再表達GFP的細菌細胞。因此，沒有標記結合于磁性顆粒，而且是施加磁力 時，磁性顆粒抑制檢測表面。
[0203] 因此，含寡（dt)25珠的另一陣列描述了來自孔的非常少的熒光信號，如圖7B所示。 在該陣列中，不存在結合于珠的抗-GFP抗體。施加磁力后，表達分析物靶蛋白（GFP)的細 胞無一提供信號，因為磁珠已經積聚到無標記的檢測表面。在該設置中，來自EM源的EM輻 射不能到達這些孔的溶液中的未結合標記。因此，在該陣列中沒有觀察到信號。磁珠也可 能積聚在樣品與檢測器之間，以抑制從標記向檢測器的發(fā)射。
[0204] 實施例4 :檢測無需細胞的溶解
[0205] 該實施例顯示了利用陣列中的珠進行夾心免疫測定無需細胞溶解來進行分析物 檢測
[0206] 在這些實施方式中，如先前實施例所述般制備陣列，其中兩個正隊長陣列含有連 接于抗-GFP抗體的磁珠。一個正對照陣列的細胞在檢測之前利用超聲處理在5瓦特下進 行細胞溶解1.5分鐘，采用具有微板角（Microplate horn)的Misonix 4000,而另一正對照 陣列未進行細胞溶解。
[0207] 負對照陣列含有寡聚-dT珠，較早的實施例已經顯示在其抑制該陣列體系中來自 所有孔的信號。負對照陣列利用與正對照陣列相同的超聲處理條件進行細胞溶解。結果表 明（見圖8A-C)，基于像素數(shù)的量化，與細胞溶解（超聲處理）步驟無關，兩種正對照陣列具 有類似的信號水平。此外，細胞溶解步驟沒有去除顆粒抑制的選擇性，因為負對照珠仍保持 遠低于正對照水平，圖8A和8B。這表明，對于某些表達機制，細胞溶解對于利用本文所述的 方法檢測分析物是不需要的。
[0208] 實施例5 :細胞的提取和回收
[0209] 下述實施例展示了單靶標在數(shù)億靶細胞中的展示及獨立回收。
[0210] 在本實施例中，如實施例2所述制備細胞、珠、標記和陣列。在鑒定出一個或多個 含分析物的孔之后，提取單孔中的溶液是期望的。
[0211] 如圖9中所述和所繪，將陣列置于固定器上，使得孔陣列在捕捉表面上是約 80 y 1 (Sylgard?184Silicone Elastomer Kit, Dow Corning)。固定器由載玻片構 成（12-550-14，F(xiàn)isher Scientific)，其具有250 ym厚的捕捉表面，位于捕捉表面各 側上的兩個80 ym膠帶間隔物。將孔陣列置于固定器上之后，陣列的上側用塑料包裝 (22_3〇5654, Fisher Scientific)密封。
[0212] 對于回收，選擇感興趣孔，諸如高強度孔。然后通過在20-30%強度功率下聚焦 349 y m固態(tài)UV激光并發(fā)射20 y J脈沖，提取該孔。然后可將自靶標孔提取的細胞置于捕捉 表面上，如圖9所示。
[0213] 提取后，從大角星激光捕獲顯微解剖系統(tǒng)移走固定器和陣列，并將含有已提取細 胞的捕捉表面置于5mL LB+25μg/ml KAN培養(yǎng)基中并在搖床中于37°C溫育19小時，以擴展 已提取細胞。這些表達感興趣蛋白質的細胞然后準備用于任何類型的擴大化蛋白質制備和 /或進一步的處理。
[0214] 實施例6 :修改陣列孔中的試劑濃度
[0215] 下述實施例展示了試劑和其他分子（諸如磁珠）可在陣列被加載之后加至其中而 不會干擾該陣列內的細胞。
[0216] 在該實施方式中，將含有人胚腎293的Freestyle 293培養(yǎng)基以濃度2, 500細胞 / y L加至孔徑100 y m為的微孔陣列中。這加載了約20細胞/孔，且細胞活力為約50 %。 首先利用熒光顯微鏡在l〇x下成像細胞，采用德克薩斯紅濾光器塊，測量該通道中的任何 背景熒光（圖10A)，接下來，將含有2 y g/mL碘化丙啶（PI)的50 y L培養(yǎng)基滴置于微孔陣 列頂部。在660道爾頓，PI是相對小的分子并且室溫下在水溶液中60秒內擴散約400 ym。 因為微孔約1mm長，因此在微孔底部所加載的細胞5分鐘后應當暴露于PI分子。這通過在 未存活HEK 293細胞的核中檢測到PI分子插入DNA而得到證實，如圖10B所示。
[0217] 其他實施方式：下述其他實施方式是非限定性的，其呈現(xiàn)于此以進一步舉例說明 本公開的各方面：
[0218] 一種用于檢測靶生物元素的裝置，包括：
[0219] 微孔陣列，其內徑為約1 ym至約500 ym，
[0220] 磁源，其向所述陣列施加磁場，
[0221] 電磁輻射源，其向所述陣列施加電磁輻射，和
[0222] 檢測器，其接收來自所述陣列的電磁輻射并鑒定發(fā)出輻射的至少一個微孔的位 置。
[0223] 所述裝置還包括在所述陣列的各孔中包含結合配體的磁性顆粒。
[0224] 所述裝置還包括將能量聚集在發(fā)出電磁輻射的微孔上的能源。
[0225] 該裝置的微孔不是透明的。
[0226] 微孔被涂覆阻止孔之間的光傳播的材料。
[0227] 一種用于檢測分析物的試劑盒，包括：微孔陣列，其包括多個直徑為約1 ym至約 500 y m的縱向熔合纖維，以及磁性顆粒，其包含分析物的結合配體。
[0228] 微孔不是透明的。
[0229] 微孔被涂覆阻止孔之間的光傳播的材料。
[0230] 盡管本發(fā)明的各種【具體實施方式】已經在本文進行描述，應理解，本發(fā)明不限于那 些精確的【具體實施方式】，而且各種改變或修飾可在其中受本領域技術人員影響，而不背離 本發(fā)明的范圍和精神。
[0231] 應理解，本發(fā)明不限于本文所述的特定的方法、方案和試劑等，因為如本領域技術 人員會意識到的，這些可能會變化。還應理解本文使用的術語使用目的是僅僅在于描述特 定實施方式，而非意圖限定本發(fā)明的范圍。
[0232] 應注意附圖中所圖解的特征不必按比例繪制，而且一個實施方式的特征可用于其 他實施方式，這是本領域技術人員理解的，即使本文未明確陳述。
[0233] 本文所述的任何數(shù)值包括從下限值到上限值以一個單位遞增的所有值，條件是在 任意下限值與任意更高值之間存在至少兩個單位的間隔。作為示例，如果記載了組分的濃 度或工藝變量（諸如例如尺寸、角度大小、壓力、時間等）的值，為例如1-90,具體為20-80， 更具體為30-70,則意在諸如15-85、22-68、43-51、30-32等的值均明確列舉與該說明書中。 對于小于1的變量，一個單位被認為是0. 〇〇〇l、〇. 〇〇l、〇. 01或0. 1，視情況而定。這些僅僅 是特別有意的示例，在下限值與上限值之間的所有可能的樹脂組合被認為是以類似方式清 楚地記載于本說明書中。
[0234] 本文引用的所有參考文獻和出版物的公開以其整體通過殘留明確引入，其程度等 同于每一篇均通過參考單獨引入。
【主權項】
1. 一種用于檢測樣品中的分析物的方法，包括： 向含樣品溶液的反應容器中添加第一顆粒和發(fā)射電磁福射的第一標記，其中所述第一 標記結合于所述第一顆粒，或者由于所述樣品中存在或缺乏所述分析物之故，所述第一標 記變成結合于所述第一顆粒， 使所述第一顆粒積聚在第一檢測表面處，以抑制電磁輻射經由所述表面?zhèn)鞑ミM入樣品 中以及從中傳播出來，及 檢測從所述第一檢測表面發(fā)出的電磁輻射的存在或其量。2. 如權利要求1所述的方法，其中所述容器包括微腔且所述第一表面包括所述樣品溶 液的第一彎液面。3. 如權利要求1所述的方法，其中所述標記由于所述樣品中所述分析物存在或缺乏的 結果而從所述顆粒釋放。4. 如權利要求1所述的方法，其中所述第一顆粒由于施加于所述樣品的力之故而積聚 于所述檢測表面處，其中所述力選自重力、磁力、電力、離心力、對流力和聲學力。5. 如權利要求2所述的方法，還包括通過施加磁場以移動所述樣品溶液中的所述第一 顆粒來混合所述樣品，其中所述第一顆粒是磁性的。6. 如權利要求1所述的方法，還包括： 向所述容器中添加發(fā)射電磁輻射的第二標記以及基于下述性能中至少一種而不同于 所述第一顆粒的第二顆粒：形狀、尺寸、密度、磁導率、電荷及光學涂層，其中所述第二標記 結合于所述第二顆粒，或者由于所述樣品中存在或缺乏第二分析物之故，所述第二標記變 成結合于所述第二顆粒； 使所述第二顆粒積聚在第二檢測表面處，以抑制電磁輻射經由該第二檢測表面?zhèn)鞑ミM 入樣品中以及從中傳播出來；及 檢測在該第二檢測表面處發(fā)出的電磁輻射的存在或其量。7. 如權利要求6所述的方法，其中所述第一顆粒由于第一力而積聚于所述第一檢測表 面處，而第二顆粒由于第二力而積聚于所述第二檢測表面處，其中所述第一力和第二力獨 立選自重力、磁力、電力、離心力、對流力和聲學力，并且其中所述第一力和第二力被同時或 順序施加于所述樣品。8. 如權利要求1所述的方法，還包括： 向所述容器中添加發(fā)射電磁輻射的第二標記以及基于下述性能中至少一種而不同于 所述第一顆粒的第二顆粒：形狀、尺寸、密度、磁導率、電荷及光學涂層，其中所述第二標記 結合于所述第二顆粒，或者由于所述樣品中存在或缺乏第二分析物之故，所述第二標記變 成結合于所述第二顆粒； 使所述第二顆粒積聚在所述第一檢測表面處，以抑制電磁輻射經由該第一檢測表面?zhèn)?播進入所述樣品中以及從中傳播出來，其中所述第一顆粒由于第一力而積聚于所述第一檢 測表面處，而第二顆粒由于第二力而積聚于所述第一檢測表面處，其中所述第一力和第二 力獨立選自重力、磁力、電力、離心力、對流力和聲學力，并且其中所述第一力和第二力被順 序施加于所述樣品；及 檢測從該第一檢測表面發(fā)出的電磁輻射的存在或其量。9. 從生物元素的異源種群中檢測靶標生物元素的方法，包括： 將所述的生物元素的異源種群分布到容器陣列中； 向該陣列中添加顆粒和激活后發(fā)射電磁輻射的第一標記，其中所述第一標記結合于 第一顆粒，或者由于所述樣品中的分析物存在或缺乏之故所述第一標記變成結合于第一顆 粒； 向所述陣列施加力，以使所述顆粒積聚于各容器中的樣品表面上；及 鑒定由所述容器發(fā)射的電磁輻射的存在或其量，從而鑒定出含有靶標生物元素的容 器。10. 如權利要求9所述的方法，其中由于樣品中所述分析物存在或缺乏之故所述標記 自所述第一顆粒釋放。11. 如權利要求9所述的方法，其中所述生物元素是生物體、細胞、蛋白質、核酸、脂質、 糖、代謝物或小分子。12. 如權利要求9所述的方法，其中所述細胞是產生重組蛋白質的轉化細胞。13. 如權利要求10所述的方法，其中所述重組蛋白質是酶，且所述標記是所述酶的底 物。14. 如權利要求10所述的方法，其中所述細胞是產生重組抗體的轉化細胞。15. 如權利要求9所述的方法，其中所述樣品以意圖在各容器中引入至多單個生物元 素的濃度加至所述陣列中。16. 如權利要求9所述的方法，其中所述容器陣列包括具有多個縱向融合的毛細管的 微腔陣列，所述毛細管的直徑為約1至約500微米。17. 如權利要求15所述的方法，其中所述陣列包括每平方厘米陣列約300-64, 000, 000 個之間的毛細管。18. 如權利要求15所述的方法，其中所述微腔的側壁不是透明的。19. 如權利要求16所述的方法，其中通過將包含試劑的流體引入所述陣列的頂部而將 所述試劑加至所述陣列。20. 在微腔陣列中從單微腔中提取包含生物元素的溶液，其中，各微腔與電磁輻射吸收 材料相結合，所述方法包括： 將電磁輻射集中在所述微腔處以產生所述材料或樣品的膨脹或者所述樣品的蒸發(fā)，這 將至少部分樣品從所述微腔中排出。21. 如權利要求20所述的方法，其中所述材料包括在微腔中的顆粒，或者所述材料包 括至少部分涂覆或覆蓋所述微腔的高熱膨脹材料。22. 如權利要求20所述的方法，其中所述至少部分樣品被排出到吸濕性捕獲表面。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測樣品中的一種或多種分析物的方法。所述方法至少部分基于添加至該樣品中的功能化顆粒部分地或完全地抑制電磁輻射經過含該樣品的反應容器中的檢測表面而傳播到樣品中及從中傳播出來的能力。以微陣列形式，本發(fā)明能夠用于篩選數(shù)百萬、數(shù)億或者更多的生物元素，諸如生物體、細胞、蛋白質、核酸、脂質、糖、代謝物或小分子。本發(fā)明還描述了方法、裝置和試劑盒。
【IPC分類】C40B30/00, G01N33/543, C40B30/10
【公開號】CN104995513
【申請?zhí)枴緾N201380045761
【發(fā)明人】I.K.迪莫, T.M.貝爾
【申請人】里蘭斯坦福初級大學理事會
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2013年6月26日
【公告號】EP2870244A2, US20140011690, WO2014008056A2, WO2014008056A3