復(fù)合物特異性抗體和抗體片段及其用圖
【專利說(shuō)明】復(fù)合物特異性抗體和抗體片段及其用途
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2012年8月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/684,836號(hào)的權(quán) 益，其全部?jī)?nèi)容并入本文以供參考。
【背景技術(shù)】
[0003] 制藥產(chǎn)業(yè)對(duì)免疫球蛋白例如抗體有著持續(xù)并增長(zhǎng)的興趣。自2000年以來(lái)，單克隆 抗體的治療市場(chǎng)已呈指數(shù)增長(zhǎng)，在2007年，在美國(guó)最暢銷的20種生物技術(shù)藥物中有8種為 治療性單克隆抗體，每一種在全世界都有超過(guò)50億美元的年銷售額。
[0004] 目前，顯著數(shù)量的抗體以及免疫球蛋白的衍生物和片段正處于臨床前和臨床研宄 階段中。在進(jìn)入人體之前，所研宄的藥物必須在廣泛的探宄和臨床前試驗(yàn)中進(jìn)行分析和表 征。需要研宄例如毒理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)特征等重要指標(biāo)，以建立安全且有效的 藥物信息（drug profile)。為了量化和監(jiān)測(cè)治療性抗體的水平，許多這類的研宄需要使用 藥物特異性試劑，以在樣品基質(zhì)（sample matrix)例如病人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的血清或任意體液 中特異地檢測(cè)治療性抗體。
[0005] 藥物特異性試劑包括，例如，僅檢測(cè)人免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白且因此其 可用于對(duì)源自非人實(shí)驗(yàn)宿主的樣品中的人治療性抗體或人源化治療性抗體進(jìn)行定量的抗 體（見(jiàn)例如冊(cè)2006066912山5序列號(hào)11/792,910，其全部?jī)?nèi)容并入本文以供參考）。進(jìn)一 步的是使用抗獨(dú)特型抗體（anti-idiotypic antibodies)或抗體片段，其特異于治療性抗 體中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。因此，抗獨(dú)特型抗體可用于檢測(cè)樣品基質(zhì)中特定的治療性抗體或抗體片 段，而與樣品所分離自的宿主無(wú)關(guān)（見(jiàn)，例如W02009032128)。然而，因?yàn)榻^大部分的抗獨(dú)特 型抗體結(jié)合至治療性抗體的獨(dú)特CDR的一個(gè)或多個(gè)，且所述的CDR定義了特異地與治療性 抗體的抗原相互作用的互補(bǔ)位（paratope)，所以只有對(duì)游離的、非與抗原結(jié)合的治療性抗 體的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)是可能的。
[0006] US 2012/0157663描述了所謂的"domino抗體"，其具有僅當(dāng)在抗體結(jié)合到各自的 抗原上時(shí)才與所述抗體相結(jié)合的能力。US2012/0157663的抗體通過(guò)一種特定的基于雜交瘤 的篩選技術(shù)產(chǎn)生。所有domino抗體的共同點(diǎn)是，祀抗體上的domino抗體的表位通過(guò)革巴抗 體與其各自的抗原相結(jié)合時(shí)所引起的構(gòu)象變化形成。所述表位位于靶抗體的恒定區(qū)（例如 輕鏈的恒定區(qū)），且既不包括抗原的任何部分，也不包括所述靶抗體的⑶R區(qū)。相比之下， 本發(fā)明的復(fù)合物特異性抗體和抗體片段結(jié)合至靶抗體CDR區(qū)的至少某些部分。因此，盡管 domino抗體僅在祀抗體結(jié)合其各自的抗原時(shí)識(shí)別祀抗體，domino抗體也與具有相同的抗 原特異性的其它靶抗體相結(jié)合，即它們?cè)谶@個(gè)方面是泛特異性的。相比之下，本發(fā)明的抗體 和抗體片段特異于一種單一的靶抗體，且其僅在靶抗體結(jié)合其抗原時(shí)與此靶抗體結(jié)合。
[0007] 因?yàn)閼?yīng)用到患者的治療性抗體總是在宿主身體周圍中的不同狀態(tài)之間平衡，因此 對(duì)于這些不同狀態(tài)的監(jiān)控和均衡化（proportion)為治療性抗體的安全性提供了必須的信 息。這些不同的狀態(tài)根據(jù)質(zhì)量作用定律平衡，包括總抗體、未結(jié)合抗體和結(jié)合抗體，且所述 的平衡取決于，例如治療性抗體的親和性以及體內(nèi)抗原的濃度。此外，由于治療性抗體相對(duì) 較慢的體內(nèi)清除率，與其抗原相結(jié)合的治療性抗體在長(zhǎng)期的施用中通常導(dǎo)抗原水平的增加 (Charles P. (1999)Journal of Immunology 163 ;1521_1528)。在治療性抗體的存在下，結(jié) 合的抗原被中和，且其大多數(shù)不具生物活性。然而，必須監(jiān)測(cè)這種現(xiàn)象，并且例如評(píng)估突然 停藥的風(fēng)險(xiǎn)很重要。
[0008] 對(duì)于治療性抗體的剖析（profiling)和稍后的批準(zhǔn)來(lái)說(shuō)，綜合總抗體、 未結(jié)合抗體和結(jié)合抗體的特異性檢測(cè)是尤受關(guān)注和重要的（Kuang B. (2010) Bioanalysis, 2(6) : 1125-40)。僅例示出一些抗獨(dú)特型抗體有能力結(jié)合未結(jié)合的治療性 抗體并且還能結(jié)合復(fù)合物（治療性抗體結(jié)合至其抗原），并因此可用以檢測(cè)總抗體負(fù)載 (total antibody load)。這種非互補(bǔ)位（non-paratopic)抗獨(dú)特型抗體在 W02009032128 中公開(kāi)。
[0009] 相比之下，幾乎所有的抗獨(dú)特型抗體都針對(duì)靶抗體的⑶R，且因此僅檢測(cè)未結(jié)合的 抗體（見(jiàn)例如 Tornetta M. (2007) Journal of Immunological Methods 328,34-44)。
[0010] 然而，無(wú)論是使用⑶R特異性抗獨(dú)特型抗體，還是使用非互補(bǔ)位抗獨(dú)特型抗體，都 無(wú)法僅為藥物-抗原復(fù)合物提供直接檢測(cè)和定量。為了量化結(jié)合的抗體，建立了多種基于 ELISA的測(cè)定法，但往往需要使用二級(jí)抗體，例如抗人Fc，以進(jìn)行間接檢測(cè)。使用Fc特異性 檢測(cè)抗體需要額外的步驟以及充分的洗滌，以由血清免疫球蛋白中捕獲和分離復(fù)合物，因 此這些測(cè)定法容易受到背景噪音和信號(hào)變化的影響。
[0011] 因此，需要更為靈敏和穩(wěn)健的替代方法來(lái)檢測(cè)和定量抗體-抗原復(fù)合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明公開(kāi)了這樣的抗體及抗體片段，其特異性地檢測(cè)和結(jié)合關(guān)聯(lián)抗體（cognate antibody)與其抗原的復(fù)合物。本公開(kāi)的抗體并不與所述的關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合部分或所述的 抗原單獨(dú)結(jié)合，并因此可用于直接檢測(cè)結(jié)合的治療性抗體，而不需要使用二級(jí)Fc特異性抗 體。
[0013] 本發(fā)明還公開(kāi)了這樣的抗體及抗體片段，其特異性地檢測(cè)和結(jié)合特異性關(guān)聯(lián)抗體 與其抗原的復(fù)合物。具體地，本發(fā)明的抗體和抗體片段不與具有相同抗原特異性的其它關(guān) 聯(lián)抗體的復(fù)合物結(jié)合。
[0014] 這些復(fù)合物特異抗體提供了優(yōu)越的對(duì)從人類患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中分離的樣品中的 抗體-抗原復(fù)合物以及游離或未結(jié)合的藥物進(jìn)行定量的方法。在本文中公開(kāi)了更靈敏且更 穩(wěn)健的測(cè)定法，例如ELISA體系（set-up)，為藥代動(dòng)力學(xué)提供替代的和改進(jìn)的測(cè)定法。此 外，可使用本文公開(kāi)的定量測(cè)定法開(kāi)發(fā)護(hù)理點(diǎn)測(cè)試（point of care tests)，使用例如橫向 流動(dòng)技術(shù)（lateral flow techniques)以監(jiān)測(cè)藥物水平。
[0015] 本公開(kāi)進(jìn)一步公開(kāi)了所述抗體在用于檢測(cè)所述復(fù)合物的測(cè)定中的用途。此外，本 公開(kāi)內(nèi)容公開(kāi)了鑒定特異性地檢測(cè)特異性關(guān)聯(lián)抗體與其抗原的復(fù)合物的抗體的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1示出了在ELISA中針對(duì)一系列不相關(guān)和相關(guān)的抗原以及阿達(dá)木單抗 (Adalimumab) /TNF- a復(fù)合物測(cè)試7個(gè)抗體的特異性結(jié)合的結(jié)果。每種抗原以5 y g/mL涂 覆在微量滴定板上過(guò)夜。在使用5% BSA洗滌和封閉后，加入Fab-Hl形式（format)(來(lái)自 2 yg/mL溶液中的20 yL)的抗阿達(dá)木單抗/TNF- a抗體。使用HPR標(biāo)記的抗His抗體和 QuantaBlu熒光過(guò)氧化酶底物進(jìn)行檢測(cè)。
[0017] 圖2示出了在ELISA中AdaTNF#5對(duì)于不同的固定化抗原的滴定結(jié)果。在測(cè)試的 濃度范圍（0. 03-2000ng/mL)內(nèi)，AdaTNF#5只與阿達(dá)木單抗/TNF-a復(fù)合物結(jié)合，但并不與 其單一組分和其它抗原結(jié)合。
[0018] 圖3示出了在ELISA中轉(zhuǎn)換為全長(zhǎng)人IgGl的純化AdaTNF#5針對(duì)不同抗原的測(cè)試 結(jié)果。結(jié)合HRP的純化AdaTNF#5-hIgGl特異性地與阿達(dá)木單抗和TNF-a的復(fù)合物結(jié)合。 [0019] 圖4示出了藥代動(dòng)力學(xué)ELISA分析的結(jié)果。將人TNF-a涂覆在微量滴定板上，將 增加濃度的阿達(dá)木單抗摻入10%人類血清，并將其涂覆到預(yù)涂覆板。在洗滌后，以2yg/ml 添加抗阿達(dá)木單抗/TNF-ahlgGl抗體AdaTNF#5 (結(jié)合至HRP)。通過(guò)添加QuantaBlu'?熒 光過(guò)氧化酶底物進(jìn)行檢測(cè)。在人類血清的存在下，AdaTNF#5以劑量依賴的方式結(jié)合阿達(dá)木 單抗/TNF-a復(fù)合物。
[0020] 圖5示出了在ELISA中IFX-TNF#1、IFX-TNF#2和IFX-TNF#3針對(duì)多種抗原的測(cè)試 結(jié)果。因此，將5yg/mL每種抗原涂覆在微量滴定板上，加入Fab-Hl形式（來(lái)自2yg/mL 溶液中的20 yL)的抗英夫利昔單抗（Infliximab)/TNF-a抗體。已證明IFX-TNF#1特異 性地檢測(cè)抗英夫利昔單抗/TNF- a復(fù)合物（圖5)。
[0021] 圖6示出了篩選ELISA以檢測(cè)抗M0R103/GM-CSF復(fù)合物抗體的結(jié)果。將5yg/mL 的每種抗體（BSA、GST、M0R03207和M0R103)涂覆在微量滴定板上。此外，M0R103/GM-CSF復(fù) 合物還固定化在該板上。M103GmCSF#l、M103GmCSF#2和M103GmCSF#3特異性地檢測(cè)M0R103/ GM-CSF復(fù)合物，但不單獨(dú)檢測(cè)GM-CSF或M0R103。
[0022] 圖7示出了測(cè)試M103GmCSF#l的靶標(biāo)選擇性的ELISA測(cè)試結(jié)果。將單獨(dú)的M0R103、 生物素化GM-CSF或結(jié)合M0R103的生物素化GM-CSF涂覆到抗生物素蛋白涂覆板上。以增 加的濃度加入His標(biāo)記的M103GmCSF#lFab并進(jìn)行檢測(cè)。M103GmCSF#l顯示出結(jié)合藥物-靶 復(fù)合物而不結(jié)合單獨(dú)蛋白質(zhì)（藥物和靶）的高選擇性。
[0023] 圖8示出了基于MSD?(MesoScaleDiscovery)配體結(jié)合測(cè)定法以定量人 類血清中的M0R103/GM-CSF復(fù)合物的結(jié)果。M0R103/GM-CSF復(fù)合物補(bǔ)充有人血清，并在 Multi-array?_96孔板標(biāo)準(zhǔn)板上進(jìn)行滴定。使用ECL標(biāo)記的M103GmCSF#lIgG檢測(cè)M0R103/ GM-CSF復(fù)合物。在整個(gè)滴定曲線中，M0R103/GM-CSF復(fù)合物在50 %人類血清的存在下以劑 量依賴的方式被特異性地檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 因此，在一個(gè)方面，本公開(kāi)涉及分離的單克隆抗體或其片段，其特異性地結(jié)合至特 異性關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合部分與其抗原的復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，分離的單克隆抗體或其片 段特異性地結(jié)合至特異性關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合部分與其抗原的復(fù)合物，且不單獨(dú)與所述關(guān)聯(lián)抗原 結(jié)合部分或所述抗原結(jié)合。
[0025] 分離的單克隆抗體或其片段
[0026] 在另一方面，本公開(kāi)涉及一種分離的單克隆抗體或其片段，其中所述分離的單克 隆抗體或其片段特異性地結(jié)合至特異性關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合部分與其抗原的復(fù)合物，且EC 5(I濃度 為小于 lOOnM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、 4nM、3nM、2nM 或 InM。
[0027] 在另一方面，本公開(kāi)涉及一種分離的單克隆抗體或其片段，其中所述分離的單克 隆抗體或其片段特異性地結(jié)合至特異性關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合部分與其抗原的復(fù)合物，且解離常數(shù) (心）為小于1\10 7]^1、108]^1、109]^ 1、101°]^1、1011]^1、10 12]^1或1013]^1。
[0028] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)涉及一種分離的單克隆抗體或其片段，其中所述分離的單克 隆抗體或其片段是單克隆抗體或多克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的抗體或其片 段是人抗體或人源化抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的抗體或其片段是嵌合抗體。在 一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的抗體或其片段包括人重鏈恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí) 施方式中，所述分離的抗體為IgG同種型。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體可為任意同種型（例 如 IgG、IgE、IgM、IgD 和 IgA)、類（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或其衍生物 (例如IgGlf LALA)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體為IgGlf LALA同種型。在一個(gè)實(shí)施方 式中，所述分離的抗體或其片段選自？&13、？(&&2)'、？( &13)2'或8(^￥。在一個(gè)實(shí)施方式中， 所述分離的抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體和合成抗體。在一個(gè) 實(shí)施方式中，所述的抗體或其片段為人抗體或人源化抗體。
[0029] 關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合部分
[0030] 在一方面，本公開(kāi)涉及一種分離的單克隆抗體或其片段，其特異性地結(jié)合至關(guān)聯(lián) 抗原結(jié)合部分與其抗原的復(fù)合物。在另一方面，本公開(kāi)涉及一種分離的單克隆抗體或其片 段，其特異性地結(jié)合至特異性關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合部分與其抗原的復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所 述關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合部分或所述特異性關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合部分為關(guān)聯(lián)抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方 式中，所述關(guān)聯(lián)抗體或其片段、或所述特異性關(guān)聯(lián)抗體或其片段為治療性抗體或治療性抗 體片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述關(guān)聯(lián)抗體或其片段、或所述特異性關(guān)聯(lián)抗體或其片段為 診斷性抗體或診斷性抗體片段。
[0031] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述關(guān)聯(lián)抗體或其片段為特異性關(guān)聯(lián)單克隆抗體或其 片段。"特異性關(guān)聯(lián)單克隆抗體"意指一種，且僅有一種與其抗原特異性地結(jié)合的單克隆抗 體。所謂的"domino抗體"（見(jiàn)US 2012/0157663)的靶抗體在此定義下并非特異性關(guān)聯(lián)抗 體，因?yàn)閐omino抗體與其祀抗體的恒