8的醋酸緩沖液6mL，攪拌均勾，在室溫下邊攪拌邊加 入225 μ L辛酸，攪拌30min，4°C靜置2h。將血清溶液4°C 800rpm離心30min，取上清，用2M NaOH調(diào)pH至7. 4。向上清液中邊攪拌邊加入等體積飽和硫酸銨溶液，此時硫酸銨溶液終濃 度為50%，攪拌30min后，4°C靜置2h。8000rpm離心30min，取沉淀，將沉淀溶于5mL PBS溶 液中。向沉淀懸浮液中邊攪拌邊加入飽和硫酸銨溶液，使其終濃度為45%，攪拌30min，4°C 靜置2h。8000rpm離心30min，取沉淀，將沉淀溶于2ml PBS溶液中。將沉淀懸浮液裝入透 析袋中，4°C，用PBS溶液透析，8h換液一次，透析2d。用萘氏試劑檢測，直至透析外液無黃 色物形成為止。0.45 μm濾器過濾，4°CIC存。
[0038] 抗原純化抗體法：
[0039] 剪取Imm -小條硝酸纖維膜，置于I. 5mL微量離心管中，浸沒于ImL lmg/mL的雞 CIV弱毒苗溶液中5min。取出膜，置于濾紙上干燥。將膜放置于裝有ImL Buffer A緩沖液 的微量離心管，輕輕震蕩混勻30min。移去Buffer A，用新鮮的Buffer A洗一次，將膜浸沒 于ImL純化雞抗CIV抗體中2h，于混勻器上輕輕震蕩混勻。移去純化的雞抗CIV抗體液，用 PBS洗膜4次，每次5min。
[0040] 將膜置于新配置IOOmM甘氨酸-HCl緩沖液（pH 2. 8)抗體洗脫液中，手輕搖混勻 2min，迅速將洗液轉(zhuǎn)移至裝有IOOu L IM Tris (pH 7. 4)離心管中中和，使抗體復(fù)性。第1次 洗脫用400 μ L抗體洗脫液，第2, 3次用200 μ L。往洗脫下來的液體中加入100 μ L Buffer A以穩(wěn)定抗體，并分裝成30 μ L每管，-20 °C保存。
[0041] 3、純化雞抗CIV抗體的檢測
[0042] 常規(guī)紫外分光光度法測定純化后抗體的含量為221. 076 μ g/mL。常規(guī)間接ELISA 法測定純化抗體效價為1 : 12800。
[0043] 二、膠體金的制備與鑒定
[0044] 1、膠體金的制備
[0045] 常規(guī)檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。將氯酸金（HAuCl4)溶解于三蒸水中配制成 0. 01 %的水溶液；0. 01 %的HAuCl4水溶液100mL加熱至沸，攪動下準(zhǔn)確加入1 %檸檬酸三鈉 (Na3C6H5O7CH 2O)水溶液2ml。繼續(xù)加熱煮沸15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液 在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成橙紅色。冷卻至室溫后用三 蒸水恢復(fù)至原體積。同樣方法制備三次。4°C備用。
[0046] 2、膠體金的鑒定
[0047] ①目測法：觀察膠體金的顏色、透明度和有無懸浮顆粒，初步確定制得的膠體金的 質(zhì)量，制備的膠體金外觀呈酒紅色，色澤鮮艷，晶瑩透亮，迎著日光燈可見有光帶。
[0048] ②紫外圖譜掃描法：在400-700nm紫外可見光范圍對制備的膠體金溶液進(jìn)行波 長掃描分析，獲得膠體金可見光區(qū)吸收光譜，記錄最大吸收波長。進(jìn)一步確定它的粒徑及 其均勻度。制備的膠體金在400-700nm處紫外圖譜掃描，得到掃描圖譜；制備的膠體金的 最大吸收峰為524nm，膠體金粒徑在10-70nm時其最大吸收峰與粒徑存在線性關(guān)系：Y = 0. 4271X+514. 56,得出制備的膠體金平均粒徑為22. lnm，屬于比較適合與蛋白結(jié)合的粒徑。
[0049] 三、雞抗CIV抗體與膠體金結(jié)合的最佳pH和最佳濃度的確定
[0050] ①梯度目測法
[0051] 用0.1111〇1/11(20)3把10支試管中11^膠體金溶液分別調(diào)為不同？!1(6.0,6.5， 7. 0, 7. 5,8. 0,8. 5,9. 0,9. 5,10.，10. 5)，每管分別加入 221. 076 μ g/mL 的抗體液 0. lmL，震 蕩20min后室溫放置IOmin ;然后每管分別加入0.1 mL的10% NaCl溶液，震蕩混合IOmin 后室溫下放置2h ;觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH，即為最佳pH。結(jié)果膠體 金pH8. 5-10. 5的試管均保持紅色，所以最適pH為8. 5。
[0052] ②OD值曲線法
[0053] 上述目測法的10支試管中各加入0.1 mL的10% NaCl溶液，震蕩混合IOmin后室 溫下放置2h后，3500rpm離心30min，用分光光度計測定溶液在520nm處的OD值，以O(shè)D值 為縱坐標(biāo)，pH值為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的點為最適pH值。結(jié)果最適 pH值為8. 5,說明在膠體金pH為8. 5時膠體金與CIV抗體的結(jié)合最好。
[0054] 2、CIV抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度的測定
[0055] ①梯度目測法
[0056] 把膠體金溶液調(diào)到pH 8. 5,10支試管每管各加 lmL，用PBS緩沖液把CIV抗體原 液按I : 2,1 : 4，…倍比稀釋成不同濃度，2~10號試管分別加入不同濃度雞抗CIV抗 體加 lmL，1號管加三蒸水lmL，震蕩混合20min后室溫下放置lOmin。然后1-9號管各加入 0.1 mL 10% NaCl，10號管加0.1 mL的三蒸水，震蕩混合IOmin后室溫下放置lOmin。觀察各 試管顏色變化。雞抗CIV抗體濃度為110. 54, 55. 27, 36. 85 μ g/mL的試管膠體金顏色保持 基本的紅色不變，最小抗體用量為36. 85 μ g/mL。在此基礎(chǔ)上再增加20%的抗體用量，CIV 抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度為44. 22 μ g/mL。
[0057] ②OD值曲線法
[0058] 在梯度目測法的試管中各加2mL三蒸水稀釋后，在波長520nm處測定吸光度，以 OD值為縱坐標(biāo)，雞抗CIV抗體濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，曲線最先與橫軸相接近的那一點處 的抗體濃度為穩(wěn)定ImL膠體金所需的最低穩(wěn)定抗體濃度，在此基礎(chǔ)上再增加20%的抗體用 量，即為CIV抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度。得出最低抗體穩(wěn)定量為36. 85ug/mL，雞抗CIV 抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度為44. 22 μ g/mL。
[0059] 四、雞抗CIV金標(biāo)抗體的制備、純化
[0060] 1.雞抗CIV金標(biāo)抗體的制備
[0061] ①取20mL膠體金，用0.1mol 1(20)3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8. 5,將膠體金溶液 3500r/min離心15min，棄沉淀。在磁力速攪拌下，向膠體金溶液中緩慢加入221. 076 μ g/ mLCIV抗體至終濃度為44. 22ug/mL持續(xù)攪拌30min。
[0062] ②加10% BSA牛血清白蛋白至終濃度1%，室溫攪拌IOmin。
[0063] ③加10% PEG 20000至終濃度0· 2%，室溫攪拌IOmin。
[0064] 2.雞抗CIV金標(biāo)抗體的純化
[0065] 采用低溫超速離心法純化雞抗CIV金標(biāo)抗體，以除去未標(biāo)記的雞抗CIV抗體、未標(biāo) 記的膠體金、及標(biāo)記過程中形成的聚合物。
[0066] 將金標(biāo)抗體溶液4°C 3500rpm離心20min，棄去沉淀；上清液4°C 12000rpm離心lh， 棄去上清液，沉淀用金標(biāo)抗體保存液稀釋至原體積，重復(fù)離心2次，沉淀用金標(biāo)抗體保存液 稀釋為原體積的1/20,用0. 45 μ m濾膜過濾，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0067] 金標(biāo)抗體保存液配制方法：BSA 0. lg，PEG200000. 05g，NaN30.0 2g，用 30mL 0.0 lM pH7. 4的磷酸鹽緩沖液溶解并定容至100mL，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0068] 3、雞抗CIV金標(biāo)抗體的質(zhì)量鑒定
[0069] 取兔抗雞抗體點樣于NC膜上，直接與雞抗CIV金標(biāo)抗體作用，可見有明顯的紅色 斑點，表明雞抗CIV金標(biāo)抗體有活性。
[0070] 五試紙條組成部分的制備
[0071] 1、玻璃纖維膜的處理
[0072] 進(jìn) 口玻璃纖維膜（Ahlstrom8964)剪成 0· 5cmX3. Ocm，用 ρΗ8· 5 的 Tris-HCl 緩沖 液將玻璃纖維膜漂洗三次，5min/次，將漂洗好的玻璃纖維膜37°C烘干。用含有2% BSA、 2. 5%蔗糖、1%吐溫20、0. 3% PVP-K30以及0. 02%疊氮鈉的0.0 lmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7. 4)封閉，于37°C溫箱中干燥。
[0073] 2雞抗CIV金標(biāo)抗體玻璃纖維膜的制備
[0074] 將金標(biāo)抗體原液用金標(biāo)抗體稀釋液進(jìn)行1 : 2稀釋，按4 μ g/cm2噴涂于玻璃纖維 膜一端上（〇. 5cmX0. 5cm)，37°C吸附lh，然后浸泡在封閉液中封閉0. 2cm，于37°C溫箱中干 燥。4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0075] 封閉液的配制：BSA3g、蔗糖 2. 5g、吐溫 20 100 μ L、PVP-K30 0· 3g，疊氮鈉 (λ Olg， 加入0. 01mol/L Tr