一種雞傳染性貧血病毒檢測膠體金試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞傳染性貧血病毒檢測膠體金試紙 條。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性貧血?。–IA)是由雞傳染性貧血病毒（CIV)引起的以雛雞再生障礙性貧 血、全身淋巴組織萎縮、皮下肌肉出血等為特征的一種免疫抑制性傳染病。CIA引起雞群的 死亡增加、成活率和體增重降低。又因免疫器官損傷引起嚴重的免疫抑制，降低雞群的抵抗 力，增加雞群對各種病原的易感性，降低雞群對各種常規(guī)疫苗免疫接種效果，給其他疾病的 防治帶來很大困難，同時會造成繼發(fā)感染，給養(yǎng)雞業(yè)帶來很大的損失。CIA自1979年Yuasa 等在日本首次報道以來，德國、瑞典、英國等相繼分離到CIV。我國于1992年首次分離到 CIV，近年來，在某些地區(qū)本病的發(fā)生有增加趨勢。
[0003] 目前，診斷CIA的方法包括：病毒分離鑒定、血清學診斷（包括病毒中和試驗 (NV)、間接免疫熒光試驗（IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA))和生物技術(shù)方法診斷（包括 PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)）等。病毒分離鑒定雖然是診斷CIA的有效手段，優(yōu)點是特異性強， 但費時費力，容易延誤該病的治療；免疫熒光、ELASA等血清學診斷方法雖然具有微量、特 異、快速、準確的優(yōu)點，但需要比較完備的儀器設備和經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員來操作和判斷結(jié) 果，對于基層獸醫(yī)站或雞場等不適用。PCR及核酸探針的診斷更需要有特殊的儀器和藥品， 且技術(shù)含量高，很難在基層推廣應用。因此，迫切需要建立一種簡單、快速，靈敏，廉價，適合 于基層應用的雞傳染性貧血病毒的快速檢測方法。國內(nèi)外己研制出了雞傳染性貧血病病毒 抗體的ELISA快速檢測試劑盒，此試劑盒是檢測血清中雞傳染性貧血病病毒抗體，但在用 這種診斷試劑盒的操作過程中，一些試劑需要現(xiàn)場配制，此試劑盒的使用也顯得不太方便。 國內(nèi)梁智選進行過雞傳染性貧血病毒抗體斑點免疫膠體金滲濾試驗檢測方法，是對血清中 雞傳染性貧血病病毒抗體的檢測，但是存在硝酸銀對環(huán)境污染的危險。迄今為止，還未見有 關(guān)雞傳染性貧血病毒膠體金快速檢測試紙條方法建立的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)對雞傳染性貧血病毒快速檢測的技術(shù)缺陷，旨在提供一種雞 傳染性貧血病毒檢測膠體金試紙條，提供了一種簡單、快速、廉價，不需任何儀器，特別適合 于基層應用檢測雞傳染性貧血病毒（CIV)的新方法。既可以用于雞傳染性貧血?。–IA)的 診斷，也可以用于CIA的檢疫，具有廣闊應用前景，對于有效控制CIA的發(fā)生和流行具有重 要意義。
[0005] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0006] -種雞傳染性貧血病毒檢測膠體金試紙條，包括雞抗CIV金標抗體玻璃纖維膜、 硝酸纖維膜、吸水墊和PVC底板，其中硝酸纖維膜粘貼于PVC底板中央，玻璃纖維膜由樣品 墊與結(jié)合墊組成，結(jié)合墊端粘貼在硝酸纖維膜劃有T線的一端，并重疊0. 2cm，硝酸纖維膜 劃有C線的一端粘貼有吸水墊，并重疊0. 2cm。
[0007] 所述的硝酸纖維素膜通過以下方法制備：硝酸纖維素膜剪成0. 5cmX 2. 5cm，用包 被液將雞抗CIV抗體稀釋成2 μ g/cm2在硝酸纖維素膜的一端劃線作為檢測線T線，用包 被液將兔抗雞IgG抗體稀釋成1. 5 μ g/cm在硝酸纖維素膜另一端劃線作為檢測線C線，兩 線間距0. 5cm，室溫放置15min，待抗體完全吸附于膜上后，移至封閉液封閉30min，然后用 0.01m〇l/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4)漂洗三次，2min/次，置于37°C烘箱中干燥，密封，4°C保 存。所述的雞抗CIV抗體和兔抗雞IgG抗體的稀釋度為1 : 2。
[0008] 所述的雞抗CIV金標抗體玻璃纖維膜通過以下方法制備：將金標抗體原液用金 標抗體稀釋液進行1 : 2稀釋，按4yg/cm2噴涂于玻璃纖維膜結(jié)合墊端，噴涂的面積為 0· 5cmX0. 5cm，37°C吸附lh，然后浸泡在封閉液中封閉0· 2cm，于37°C溫箱中干燥。4°C保存 備用。
[0009] 所述的封閉液為：BSA3g、蔗糖2. 5g、吐溫20 100 yL、PVP-K30 0. 3g，疊氮鈉 0.0 lg，加入0. 01mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8. 5)液溶解并定容至100mL。
[0010] 所述的玻璃纖維膜通過以下預處理方法得到：玻璃纖維膜剪成〇. 5cmX3. 0cm，用 pH8. 5的Tris-HCl緩沖液將玻璃纖維膜漂洗三次，5min/次，將漂洗好的玻璃纖維膜37°C烘 干，用含有2% BSA、2.5%蔗糖、1%吐溫20、0.3% PVP-K30以及0.02%疊氮鈉的O.Olmol/ L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4)封閉，于37°C溫箱中干燥。
[0011] 本發(fā)明雞抗CIV金標抗體通過以下方法制備：
[0012] 1)取20mL膠體金，用0· Imol K2COJ節(jié)膠體金溶液pH至8. 5,將膠體金溶液 3500r/min離心15min，棄沉淀，在磁力攪拌下，向膠體金溶液中緩慢加入221. 076 μ g/mL雞 CIV抗體至終濃度為44. 22ug/mL，持續(xù)攪拌30min ;
[0013] 2)加10% BSA牛血清白蛋白至終濃度1%，室溫攪拌IOmin ;
[0014] 3)加 10% PEG 20000 至終濃度 0· 2%，室溫攪拌 IOmin。
[0015] 4)將金標抗體溶液4°C 3500rpm離心20min，上清液4°C 12000rpm離心lh，沉淀 用金標抗體保存液稀釋至原體積，重復離心2次，沉淀用金標抗體保存液稀釋為原體積的 1/20,用0. 45 μ m濾膜過濾，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0016] 所述的金標抗體保存液為：BSA 0· lg，PEG20000 0· 05g，NaN3 0· 02g，用 30mL 0.0 lM pH7. 4的磷酸鹽緩沖液溶解并定容至100mL。
[0017] 本發(fā)明所述的膠體金通過常規(guī)檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，具體為：將氯酸金 (HAuCl 4)溶解于三蒸水中配制成0. 01 %的水溶液；取0. 01 %的HAuCl4水溶液IOOrnl加熱 至沸，攪動下準確加入1%檸檬酸三鈉（Na3C6H 507 *2H20)水溶液2ml。繼續(xù)加熱煮沸15min。 此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后 逐漸穩(wěn)定成橙紅色。冷卻至室溫后用三蒸水恢復至原體積。同樣方法制備三次。4°C備用。
[0018] 本發(fā)明的有益效果為：檢樣用量極小，可以低至2-3滴；簡便，一步操作，無需任 何儀器，非常適合現(xiàn)場使用；安全可靠，沒有有害物質(zhì)（如放射性同位素、鄰苯二胺、硝酸銀 等）的參與，不會造成環(huán)境污染；檢測所需時間短，幾分鐘即可出結(jié)果；由于抗原抗體反應 的的特異性，所以靈敏性、特異性較高；結(jié)果穩(wěn)定，顏色不受時間和光照的影響，實驗結(jié)果可 長期保存；檢測成本低，如果批量生產(chǎn)，成本僅需5-8元。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發(fā)明試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；
[0020] 圖2是本發(fā)明試紙條的俯視圖；
[0021] 圖3是本發(fā)明實施例試紙條的特異性檢測；
[0022] 圖4是本發(fā)明實施例試紙條的靈敏性檢測；
[0023] 圖5是本發(fā)明實施例試紙條的穩(wěn)定性檢測；
[0024] 圖6是本發(fā)明實施例試紙條對感染CIV雞的實例檢測；
[0025] 圖7是感染組PCR擴增檢測結(jié)果；M :DNAMaker DL2000 ; 1-5 :心、肝、脾、肺、骨髓；
[0026] 圖8是對照組PCR擴增檢測結(jié)果；M :DNA Maker DL2000 ;1、2 :陽性對照；3-7 :心、 肝、脾、肺、骨髓；8:空白；
[0027] 附圖1、2中標示說明：1樣品墊；2結(jié)合墊；3硝酸纖維膜；4檢測線；5質(zhì)控線；6吸 水墊；7PVC底板。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實質(zhì)對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0029] 實施例1
[0030] 一種雞傳染性貧血病毒檢測膠體金試紙條通過以下方法制備：
[0031] 一、雞抗CIV抗體的制備、純化、檢測
[0032] 1、雞抗CIV抗體的制備
[0033] SPF雞用雞CIV弱毒苗（德國羅曼動物保健有限公司）免疫4次，采血，制備血清 抗體。
[0034] 2、雞抗CIV血清抗體的純化
[0035] 用辛酸-飽和硫酸銨法和抗原純化抗體法先后對血清抗體進行兩次純化。
[0036] 常規(guī)辛酸-飽和硫酸銨法：
[0037] 取血清3ml，加入0. 06M pH4.