用于檢測(cè)支原體抗體的組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測(cè)支原體抗體的組合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis)，屬于支原體科（Mycoplasmataceae)支原 體屬（Mycoplasma)成員，最早由Carler和Mckay于1953年從傳染性萎縮性鼻炎豬的鼻腔 內(nèi)分離獲得，故定名為豬鼻支原體。豬鼻支原體是臨床豬場(chǎng)中常見(jiàn)病原菌，通常由母豬或大 豬傳染給小豬，通常通過(guò)飛沫或直接接觸由上呼吸道感染傳播。豬只一旦感染，該支原體 在上呼吸道迅速傳播并且能從感染豬的肺臟和鼻咽管中分離到，而后可經(jīng)呼吸道移行至全 身。豬鼻支原體能夠引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎、肺炎等病癥。其臨床感染率在 不同國(guó)家地區(qū)普遍可達(dá)60-70%以上。同時(shí)豬鼻支原體亦可與其他病原菌形成混合感染，加 重疾病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。近年來(lái)的研宄發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體屬于人獸共患性疾病病原，其 感染與多種人類(lèi)癌癥，包括胃癌、大腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等有明顯的相關(guān)性。豬鼻 支原體可誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞惡性程度增加，導(dǎo)致這一轉(zhuǎn)化現(xiàn)象發(fā) 生的機(jī)制尚不十分清楚，可能包括誘導(dǎo)遺傳不穩(wěn)定性，如染色體異常、突變率增加；誘導(dǎo)宿 主代謝過(guò)程的改變；誘導(dǎo)多種腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)改變等。此外豬鼻支原體也是細(xì)胞培養(yǎng) 中引起培養(yǎng)污染的最常見(jiàn)支原體之一，污染后可導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)、增殖周期等受到 影響。
[0003] 目前報(bào)道用于檢測(cè)豬鼻支原體病原（抗原）或感染后抗體的方法主要包括聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)、原位雜交、免疫組織化學(xué)、酶連免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)方法。PCR技術(shù)用于 檢測(cè)病原，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，因此PCR技術(shù)用于豬鼻支原體的檢測(cè)發(fā)展較為 迅速，是目前最常用的方法。但PCR技術(shù)通常以鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液或組織為待檢樣 本，其中鼻拭子樣本的檢出率較低，適合用于群體感染情況的判定，對(duì)于個(gè)體而言，易出現(xiàn) 假陰性的結(jié)果；支氣管肺泡灌洗液及組織樣本的采集通常需要剖殺動(dòng)物獲取，臨床上很難 操作。原位雜交和免疫組織化學(xué)方法用于檢測(cè)抗原，可以對(duì)體內(nèi)抗原實(shí)現(xiàn)組織定位，但同樣 需要剖殺動(dòng)物取組織樣本才可進(jìn)行，操作技術(shù)要求高、且難以實(shí)現(xiàn)量化，臨床上很少使用。 ELISA方法具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，可用于抗原或抗體檢測(cè)，是微生物感染檢測(cè)的 首選方法。有報(bào)道利用制備的特異性單抗建立了雙抗體夾心ELISA法用于檢測(cè)豬鼻支原體 抗原，但以抗原為檢測(cè)對(duì)象同樣面臨前述三個(gè)方法存在的應(yīng)用局限；在抗體檢測(cè)方面，通常 可利用全菌蛋白為檢測(cè)抗原，但由于不同支原體之間存在很多交叉抗原，檢測(cè)時(shí)與宿主中 感染的其他支原體產(chǎn)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。豬群除了豬鼻支原體外，還可能感染另 外幾種支原體，包括豬肺炎支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體，其中又以豬肺炎支原體感 染嚴(yán)重程度最重，這些支原體的抗體都可能干擾豬鼻支原體抗體的檢測(cè)和判斷，因此必須 從豬鼻支原體全蛋白中篩選高特異性的合適蛋白作為檢測(cè)抗原。近期有文獻(xiàn)報(bào)道利用豬鼻 支原體P37蛋白為包被抗原初步建立ELISA方法檢測(cè)血清抗體，但實(shí)際上通過(guò)序列比對(duì)可 發(fā)現(xiàn)P37蛋白與多種其他豬源支原體，尤其是豬肺炎支原體有明顯交叉表位，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生 嚴(yán)重的假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。故而，建立豬鼻支原體抗體檢測(cè)ELISA方法的關(guān)鍵在于尋找豬鼻 支原體特異性的抗原蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)支原體抗體的組合物，可以特異性的檢測(cè)豬鼻支原 體抗體。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供所述組合物在檢測(cè)支原體抗體的試劑盒或金標(biāo)試紙中 的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0007] 用于檢測(cè)支原體抗體的組合物，含有7種多肽，所述各多肽的氨基酸序列分別如 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7 所示。
[0008] 在本發(fā)明中，所述支原體抗體為豬鼻支原體抗體。
[0009] 由于豬鼻支原體不同菌株Vlp家族III區(qū)重復(fù)肽段序列之間存在一定變異，因此， 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述7種多肽中的一種或兩種以上取代、插入或缺失1-3個(gè)氨基酸殘 基。多肽與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到多肽與載體蛋白的偶聯(lián)物。
[0010] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述7種多肽中的一種或兩種以上與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，以 克服長(zhǎng)度較短的多肽直接包被酶標(biāo)板后，受到空間位阻影響表位暴露不好，反應(yīng)效率不夠 尚的缺點(diǎn)。
[0011] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述載體蛋白為鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH)、牛血清白蛋白（BSA)、 卵清蛋白（OVA)或牛甲狀腺球蛋白（THY)。
[0012] 本發(fā)明還提供所述組合物在制備檢測(cè)支原體抗體的試劑盒或金標(biāo)試紙中的應(yīng)用。 在本發(fā)明中，所述支原體抗體為豬鼻支原體抗體。
[0013] 本發(fā)明所述多肽可以通過(guò)人工化學(xué)合成的方式得到，也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員知 曉的其他生物化學(xué)或分子生物學(xué)的方法得到。
[0014] 本發(fā)明所述組合物中多肽之間的濃度比不限。優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述組合物中 各多肽的摩爾濃度相同，即多肽之間的摩爾比為1:1:1:1:1:1:1。
[0015] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明組合物包被酶標(biāo)板時(shí)7種多肽的總濃度為0. 1-50 μ g/ ml，每孔加入的體積為100 μ 1。
[0016] 本發(fā)明用于檢測(cè)支原體抗體的組合物，可以特異性的檢測(cè)豬鼻支原體抗體，不會(huì) 與豬常見(jiàn)其他支原體或其他病原感染樣品發(fā)生交叉反應(yīng)，假陽(yáng)性率極低。檢測(cè)樣品易于獲 得，不會(huì)影響豬場(chǎng)正常飼養(yǎng)管理。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1本發(fā)明豬鼻支原體抗原肽組合物與四種豬源支原體抗體交叉反應(yīng)性檢測(cè)，其 中A是以豬鼻支原體抗原肽組合物為包被抗原的間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果；B是以豬鼻支 原體Ρ37蛋白為包被抗原的間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果。
[0018] 圖2本發(fā)明豬鼻支原體抗原肽組合物與常見(jiàn)豬病抗體交叉反應(yīng)性檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述和論證，但是本發(fā)明所包括的內(nèi)容并不 局限于此。
[0020] 實(shí)施例1豬鼻支原體抗原肽的制備
[0021] 1.豬鼻支原體抗原肽的選擇
[0022] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)豬鼻支原體全序列進(jìn)行大量的比對(duì)工作，篩選高特異性的合適蛋 白作為檢測(cè)豬鼻支原體抗體的抗原。最終，發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體表面可變脂蛋白（variable lipoprotein, vlp)家族的部分多肽可以作為抗原肽用于特異性檢測(cè)豬鼻支原體抗體，不會(huì) 受到豬肺炎支原體、豬滑液支原體或絮狀支原體干擾。vlp家族共包含7個(gè)成員，分別為vl pA, vlpB, vlpC, vlpD, vlpE, vlpF, vlpGovlp成員的基因編碼區(qū)結(jié)構(gòu)相同，分為三部分：I區(qū)、 II區(qū)和III區(qū)。其中，III區(qū)編碼重復(fù)肽段，大約由12-13個(gè)氨基酸的肽段串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成，豬鼻 支原體各vlp的重復(fù)肽段在序列上具有特異性，且重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)容易改變，從而導(dǎo) 致vlp產(chǎn)物大小發(fā)生變化。由于vlp成員表達(dá)的多種組合以及III區(qū)重復(fù)肽段重復(fù)次數(shù)的改 變，使得豬鼻支原體具有多變的表面抗原性，有效躲避宿主的免疫系統(tǒng)，最終達(dá)到長(zhǎng)期持續(xù) 感染宿主的狀態(tài)。
[0023] vlp家族蛋白作為豬鼻支原體的表面蛋白，通常具有良好的免疫反應(yīng)性，適合作為 檢測(cè)抗原。III區(qū)為Vlp蛋白的重要抗原區(qū)，通過(guò)大量序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，Vlp蛋白的III區(qū)重 復(fù)肽段序列種屬特異性很好，與包括豬肺炎支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體在內(nèi)的3種 常見(jiàn)豬源支原體，以及其他支原體之間都沒(méi)有明顯的交叉表位，是建立豬鼻支原體抗體特 異性檢測(cè)方法的理想候選抗原。因此，本發(fā)明選擇7種vlp蛋白的III區(qū)重復(fù)肽段混合物為 包被抗原，建立豬鼻支原體抗體檢測(cè)ELISA方法。
[0024] 2. 7條豬鼻支原體vlp抗原肽的制備
[0025] 每個(gè)vlp抗原肽的重復(fù)肽段選取兩段重復(fù)以保證涵蓋所有線性表位，同時(shí)兼顧菌 株之間可能存在的個(gè)別氨基酸變異。申請(qǐng)人共設(shè)計(jì)了 7條豬鼻支原體vlp抗原肽，命名為 vlpA抗原肽、vlpB抗原肽、vlpC抗原肽、vlpD抗原肽、vlpE抗原肽、vlpF抗原肽和vlpG抗 原肽，如表1所示。為便于偶聯(lián)載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH)，在每條抗原肽的N端添加一個(gè) 半胱氨酸，分別命名為 PepvlpA、PepvlpB、PepvlpC、PepvlpD、PepvlpE、PepvlpF*PepvlpG。 PepvlpA、PepvlpB、PepvlpC、PepvlpD、PepvlpE、PepvlpF 和 PepvlpG (由 Synpeptide 有限 公司合成）合成肽經(jīng)高效液相色譜純化，純度大于85%。
[0026] 表1 vlp抗原肽名稱(chēng)、序列及對(duì)應(yīng)的各衍生物命名
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)支原體抗體的組合物，含有7種多肽，所述各多肽的氨基酸序列分別如SEQ IDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6 和SEQID NO:7所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求I所述用于檢測(cè)支原體抗體的組合物，其特征在于所述支原體抗體為 豬鼻支原體抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述用于檢測(cè)支原體抗體的組合物，其特征在于所述7種多肽中的 一種或兩種以上取代、插入或缺失1-3個(gè)氨基酸殘基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述用于檢測(cè)支原體抗體的組合物，其特征在于所述7種多肽 中的一種或兩種以上與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述用于檢測(cè)支原體抗體的組合物，其特征在于所述載體蛋白為鑰 孔血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或牛甲狀腺球蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述用于檢測(cè)支原體抗體的組合物，其特征在于所述各多肽的摩爾 濃度相同。
7. 權(quán)利要求1-6之一所述組合物在制備檢測(cè)支原體抗體的試劑盒或金標(biāo)試紙中的應(yīng) 用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于所述支原體抗體為豬鼻支原體抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其特征在于所述組合物用于包被酶標(biāo)板時(shí)，7種多肽的總 濃度為〇.l_5〇M€/ml，包被體積為IOOMl/孔。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供用于檢測(cè)支原體抗體的組合物及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述組合物，含有7種多肽，所述各多肽的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。本發(fā)明組合物，可以特異性的檢測(cè)豬鼻支原體抗體，不會(huì)與豬常見(jiàn)其他支原體或其他病原感染樣品發(fā)生交叉反應(yīng)，假陽(yáng)性率極低。檢測(cè)樣品易于獲得，不會(huì)影響豬場(chǎng)正常飼養(yǎng)管理。
【IPC分類(lèi)】G01N33-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104730256
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510157998
【發(fā)明人】熊祺琰, 邵國(guó)青, 王佳, 劉茂軍, 馮志新, 韋艷娜, 馬慶紅, 華利忠, 倪博
【申請(qǐng)人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年4月3日