專利名稱:血小板形態(tài)掃描成像和血小板活化功能評估的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血小板形態(tài)掃描成像和血小板活化功能評估的方法。
背景技術(shù)血小板是血液中具有特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生化組成的有形成分之一，其主要生理功能是參與凝血與止血。血小板結(jié)構(gòu)復(fù)雜且個(gè)體差異較大，因能運(yùn)動(dòng)和變形，往往表現(xiàn)為多形態(tài)。循環(huán)血液中正常狀態(tài)的血小板呈橢圓形或圓盤形，平均直徑約2 4微米。血小板易受機(jī)械、化學(xué)刺激而活化并導(dǎo)致形態(tài)改變。當(dāng)血小板一旦與創(chuàng)傷面或激活劑接觸，可擴(kuò)展成為圓片狀血小板，以增加凝血與止血的面積。凝血酶、ADP、腎上腺素和膠原等都是血小板的激活劑。任何凝血與止血過程也都涉及血小板的活化，因此通過體外實(shí)時(shí)檢測激活劑作用下血小板形態(tài)的變化，即可直觀評估血小板的生理功能。目前用于檢測血小板形態(tài)的方法和儀器種類較多，其中普通光學(xué)顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡的分辨率僅能達(dá)到200納米左右，不能滿足血小板微觀形貌高分辨率觀測的需要。掃描電鏡(SEM)盡管具有足夠高的分辨率，但需要對血小板進(jìn)行固化和特別處理以實(shí)現(xiàn)樣品的導(dǎo)電性，這勢必會(huì)改變、甚至破壞血小板表面的微觀結(jié)構(gòu)，因此根本不適合活體血小板的觀測。而掃描探針顯微鏡家族中作為高分辨率生物成像研究有力工具的原子力顯微鏡(AFM)，已被用于血小板微形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)研究，但由于其利用探針針尖與血小板膜間的相互作用力進(jìn)行負(fù)反饋控制以實(shí)現(xiàn)掃描成像，掃描中探針與活體血小板的輕微接觸不可避免，不僅會(huì)損傷血小板的表面結(jié)構(gòu)，其機(jī)械作用力也可激活血小板引起形態(tài)變化，因此也不能滿足血小板激活劑作用前后微形貌成像的需要。
為了克服原子力顯微鏡需要掃描探針與樣品接觸而損傷或激活生物樣品的缺點(diǎn)，加州大學(xué)的Hansma教授于1989年發(fā)明了非接觸式的掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)(scanningion conductance microscopy, SICM),由于當(dāng)時(shí)負(fù)反饋控制方法及精確定位技術(shù)的局限與不足，纖細(xì)的玻璃微滴管探針在掃描時(shí)經(jīng)常意外地與樣品接觸并導(dǎo)致針尖或樣品損壞，SICM技術(shù)在其發(fā)明后的很長一段時(shí)間僅適用于平坦的聚酯薄膜掃描成像。近年來SICM技術(shù)通過改進(jìn)定位及掃描控制技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在生理液態(tài)培養(yǎng)條件下實(shí)時(shí)、非接觸式地對活體生物樣品表面三維微觀結(jié)構(gòu)的探測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種血小板形態(tài)掃描成像的方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種血小板活化功能評估方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
一種血小板形態(tài)掃描成像的方法，包括如下步驟
( I)血小板樣品的制備
取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL的纖維蛋白原的35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中室溫下孵育20-30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的血小板后，加入
I.5-2mLPBS緩沖液后備用；
(2)將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟(I)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的探測電極放置在步驟(I)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，所述探測電極是一設(shè)置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內(nèi)的Ag/AgCl電極；
(3)用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡監(jiān)控流入探測電極電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設(shè)定的距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計(jì)算機(jī)繪制得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。
一種血小板活化功能評估方法，包括如下步驟
(I)血小板樣品的制備
取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL纖維蛋白原的35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中室溫下孵育20-30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的血小板后，加入
I.5-2mLPBS緩沖液后備用；
(2)將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟(I)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的探測電極放置在步驟(I)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，所述探測電極是一設(shè)置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內(nèi)的Ag/AgCl電極；
(3)用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡監(jiān)控流入探測電極電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設(shè)定的距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計(jì)算機(jī)繪制得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖；
(4)再向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入激活劑，作用10-20分鐘，通過計(jì)算機(jī)繪制得到加入所述激活劑10-20分鐘血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。
所述激活劑為凝血酶或ADP,所述凝血酶的加入量是使凝血酶的終濃度為2U/mL,所述ADP的加入量是使ADP的終濃度為5 μ M0
激活劑還可以選擇腎上腺素或膠原，其濃度可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。
本發(fā)明一種血小板形態(tài)掃描成像的方法及一種血小板活化功能評估方法，能實(shí)時(shí)直觀地觀察在添加激活劑前后血小板的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，不僅可簡便快捷地精準(zhǔn)測定掃描范圍內(nèi)血小板數(shù)量(PLT)和平均血小板體積(MPV)等形態(tài)參數(shù)，更可以通過上述血小板在添加激活劑后的活化形態(tài)改變來評估血小板的活化功能。此檢測方法無需染色及任何特殊處理，更無需昂貴的試劑，且操作簡便。


圖IA為計(jì)算機(jī)繪制的實(shí)施例I得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。
圖IB為計(jì)算機(jī)繪制的實(shí)施例2得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I
一種血小板形態(tài)掃描成像的方法，包括如下步驟
( I)血小板樣品的制備[0026]抽取健康人2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，150Xg離心15分鐘得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL人纖維蛋白原的35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中室溫下孵育30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的血小板后，加入I. 5mL PBS緩沖液后備用；
(2)將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟(I)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的探測電極放置在步驟(I)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，所述探測電極是一設(shè)置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內(nèi)的Ag/AgCl電極；
(3)用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡監(jiān)控流入探測電極電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設(shè)定的恒定距離(即探測電極與血小板不發(fā)生任何物理接觸)，記錄下所述探測電極的位置(記錄下在掃描范圍內(nèi)達(dá)到距血小板表面設(shè)定距離時(shí)探測電極的針尖的位置)，通過計(jì)算機(jī)繪制得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖，見圖1A，并能準(zhǔn)確獲得掃描范圍內(nèi)血小板數(shù)量(PLT)為20和平均血小板體積(MPV)經(jīng)掃描離子電導(dǎo)顯微鏡圖形處理軟件分析計(jì)算為9. 93fL。
實(shí)施例2
一種血小板活化功能評估方法，包括如下步驟
(I)- (3)同實(shí)施例 I 的(I)- (3);
(4)再向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入激活劑凝血酶，使凝血酶的終濃度為2U/mL作用10分鐘，利用SICM技術(shù)對加入凝血酶10分鐘后活體血小板表面形貌進(jìn)行觀測以SICM控制器監(jiān)控流入探測電極電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得探測電極與血小板保持恒定距離，探測電極在細(xì)胞表面的軌跡即為加入一定濃度激活劑10分鐘后活體血小板的表面三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并準(zhǔn)確獲得激活后的圓片狀血小板的數(shù)量；通過計(jì)算機(jī)繪制得到加入凝血酶血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖，(見圖1Β，50Χ50μπι)。血小板活化后展開成圓片狀，圓片狀血小板數(shù)量與激活劑作用前相比增加了 2. 5倍。)
利用SICM圖像處理分析軟件比較激活劑作用前后血小板形貌的變化來評估其活化功能。
實(shí)施例3
一種血小板形態(tài)掃描成像的方法，包括如下步驟
( I)血小板樣品的制備
取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL人纖維蛋白原的35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中室溫下孵育20分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的血小板后，加入2mLPBS緩沖液后備用；
(2)同實(shí)施例I的(2);(3)用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡監(jiān)控流入探測電極電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設(shè)定的恒定距離(即探測電極與血小板不發(fā)生任何物理接觸)，記錄下所述探測電極的位置(記錄下在掃描范圍內(nèi)達(dá)到距血小板表面設(shè)定距離時(shí)探測電極的針尖的位置)，通過計(jì)算機(jī)繪制得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖，該圖與實(shí)施例I的通過計(jì)算機(jī)繪制得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖相似。
實(shí)施例4[0041]一種血小板形態(tài)掃描成像的方法，包括如下步驟
( I)血小板樣品的制備
取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL人纖維蛋白原的35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中室溫下孵育30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的血小板后，加入2mLPBS緩沖液后備用；
(2)同實(shí)施例I的(2);
(3)用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡監(jiān)控流入探測電極電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設(shè)定的恒定距離(即探測電極與血小板不發(fā)生任何物理接觸)，記錄下所述探測電極的位置(記錄下在掃描范圍內(nèi)達(dá)到距血小板表面設(shè)定距離時(shí)探測電極的針尖的位置)，通過計(jì)算機(jī)繪制得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖，該圖與實(shí)施 例I的通過計(jì)算機(jī)繪制得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖相似。
實(shí)施例5
一種血小板活化功能評估方法，包括如下步驟
(I)- (3)同實(shí)施例 I 的(I)- (3);
(4)再向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入ADP，使ADP的終濃度為5μ M作用20分鐘，通過計(jì)算機(jī)繪制得到加入ADP 20分鐘血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。所述血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖與實(shí)施例2的血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖相似。
實(shí)驗(yàn)證明，激活劑凝血酶或ADP的終濃度作適當(dāng)調(diào)整，也可以用于本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)證明，選用腎上腺素或膠原作激活劑，也可以用于本發(fā)明。
通過商用膜片鉗技術(shù)測量探測電極的阻值110ΜΩ。
通過SICM掃描軟件設(shè)定好掃描參數(shù)后，通過負(fù)反饋控制使得探測電極逐漸接近血小板，并最終達(dá)到探測電極與血小板保持恒定距離的狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)監(jiān)控流入探測電極電流的變化，以監(jiān)測整個(gè)接近過程的穩(wěn)定性。探測電極達(dá)到in control狀態(tài)時(shí)，即可開始對血小板形貌進(jìn)行掃描成像，其走過的軌跡即為正常血小板的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(見圖2A，50Χ50μπι)。在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡血小板形貌的三維拓?fù)涑上駡D中，可以精確地得到在掃描范圍內(nèi)的血小板數(shù)量(PLT)為20 (見圖1A);這些血小板的平均血小板體積(MPV)經(jīng)掃描離子電導(dǎo)顯微鏡圖形處理軟件分析計(jì)算為9. 93fL。
掃描完成后，加入血小板激活劑凝血酶，其終濃度為2U/mL，作用時(shí)間為10分鐘，再進(jìn)行掃描，即可得到被凝血酶激活后血小板形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(見圖1Β，50Χ50μπι)。血小板活化后展開成圓片狀，圓片狀血小板數(shù)量與激活劑作用前相比增加了 2. 5倍。
本發(fā)明的掃描離子電導(dǎo)顯微鏡采用英國ionscope公司掃描離子電導(dǎo)顯微鏡及圖像處理軟件。
掃描離子電導(dǎo)顯微鏡包括掃描離子電導(dǎo)顯微鏡掃描頭、掃描控制器及信號(hào)米集處理器、壓電陶瓷電源與驅(qū)動(dòng)器等構(gòu)成，用于實(shí)時(shí)記錄血小板在加入一定濃度激活劑前后微觀形貌的變化。
上述所說的生理液態(tài)體外掃描環(huán)境為PBS緩沖液。
上述所說的組成探測電極的納米吸管(硼硅酸鹽或石英微電極玻璃毛細(xì)管)均由微探針拉制儀拉制而成。
權(quán)利要求
1.ー種血小板形態(tài)掃描成像的方法，其特征是包括如下步驟 (1)血小板樣品的制備 取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL的纖維蛋白原的35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中室溫下孵育20-30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的血小板后，加入I. 5-2mLPBS緩沖液后備用； (2)將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟(I)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的探測電極放置在步驟(I)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，所述探測電極是一設(shè)置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內(nèi)的Ag/AgCl電極； (3)用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡監(jiān)控流入探測電極電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得跳躍 的探測電極與血小板間保持設(shè)定的距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計(jì)算機(jī)繪制得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。
2.—種血小板活化功能評估方法，其特征是包括如下步驟 (1)血小板樣品的制備 取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL纖維蛋白原的35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中室溫下孵育20-30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的血小板后，加入I.5-2mLPBS緩沖液后備用； (2)將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟(I)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的探測電極放置在步驟(I)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，所述探測電極是一設(shè)置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內(nèi)的Ag/AgCl電極； (3)用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡監(jiān)控流入探測電極電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設(shè)定的距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計(jì)算機(jī)繪制得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖； (4)再向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入激活劑，作用10-20分鐘，通過計(jì)算機(jī)繪制得到加入所述激活劑10-20分鐘血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的ー種血小板活化功能評估方法，其特征是所述激活劑為凝血酶或ADP，所述凝血酶的加入量是使凝血酶的終濃度為2U/mL，所述ADP的加入量是使ADP的終濃度為5 μ M0
專利摘要
本發(fā)明公開了一種血小板形態(tài)掃描成像和血小板活化功能評估的方法，血小板形態(tài)掃描成像方法的步驟為(1)血小板樣品的制備；(2)將連接在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的參比電極和探測電極放置在步驟(1)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；(3)用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡監(jiān)控流入探測電極電流的變化，通過負(fù)反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設(shè)定的距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計(jì)算機(jī)繪制得到血小板表面形貌的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。本發(fā)明的方法，能實(shí)時(shí)直觀地觀察在添加激活劑前后血小板的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，不僅可簡便快捷地精準(zhǔn)測定掃描范圍內(nèi)血小板數(shù)量和平均血小板體積等參數(shù)，還可評估血小板的活化功能。本發(fā)明的方法操作簡便，成本低。
文檔編號(hào)G01Q60/44GKCN102662088SQ201210156850
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月18日
發(fā)明者張建寧, 張彥軍, 董京飛 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan