專利名稱：血小板檢驗(yàn)方法和血小板檢驗(yàn)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用少量血液來測定血液的血小板機(jī)能的方法和檢驗(yàn)裝置，更具 體而言，涉及一種使用微芯片來檢驗(yàn)血液的血小板機(jī)能的方法和檢驗(yàn)裝置。
背景技術(shù)：
(血小板凝集檢驗(yàn)的現(xiàn)有技術(shù)中的問題)血小板的活化和凝集在動脈的血栓形成(白色血栓)和一次止血中起到關(guān)鍵作用。當(dāng)血管受損時(shí)，血小板直接和間接地與血管內(nèi)皮細(xì)胞下存在的膠原蛋白結(jié)合。在 血液緩慢流動的環(huán)境下(在低剪切應(yīng)力下)，它們的結(jié)合主要是經(jīng)由諸如GPVI等膠原蛋白 受體的直接結(jié)合，而在血液快速流動的環(huán)境下(在高剪切應(yīng)力下)，VffF與膠原蛋白結(jié)合，并 且血小板的GPrt α受體與vWF結(jié)合，從而導(dǎo)致血小板與膠原蛋白的間接結(jié)合。與膠原蛋白 的直接和間接相互作用使血小板活化，并且通過這種刺激，從致密顆粒和α -顆粒釋放諸 如ADP和血清素等各種血小板活化物質(zhì)。這樣釋放出的血小板活化因子活化各自的血小板和附近的血小板。在活化的血小 板中，纖維蛋白原受體GPnb和IIIa在結(jié)構(gòu)上變?yōu)榛罨?，從而使血小板對于纖維蛋白原 變?yōu)楦哂H和型。通過二聚的纖維蛋白原，活化的血小板彼此順次交聯(lián)，從而造成血小板凝集。然而，大多數(shù)常規(guī)的血小板凝集計(jì)利用因大量血小板活化試劑的刺激引起的血小 板活化和凝集過程的方法(非專利文獻(xiàn)1)。因此，在與生理血小板活化條件極為不同的環(huán)境下誘發(fā)血小板活化反應(yīng)，并且盡 管可以測定在諸如各受體的先天機(jī)能異常等機(jī)能方面的明顯差異，但是難于測定更多的生 理血小板機(jī)能。PFA-100 (血小板機(jī)能分析儀非專利文獻(xiàn)2)是一種測定由于接觸固定膠原蛋白、 剪切應(yīng)力和接觸血小板誘發(fā)物質(zhì)的血小板總活化引起的孔堵塞的系統(tǒng)。與使用單獨(dú)的血小 板活化誘發(fā)物質(zhì)的刺激引起的常規(guī)血小板凝集相比，這是一種使用更近似于生理環(huán)境的測 定系統(tǒng)。然而，不可以控制數(shù)據(jù)變化以及通過孔的血液中所含的誘發(fā)物質(zhì)的濃度變化。因 此，不能適宜地測定在血小板活化誘發(fā)物質(zhì)處于極低濃度或不存在的條件下(在已經(jīng)因血 栓癥發(fā)展而活化血小板的患者中觀察到)誘發(fā)的血小板凝集；以及在血小板機(jī)能異常的患 者中測定血小板機(jī)能的情況下利用極高濃度的血小板誘發(fā)物質(zhì)的刺激引起的血小板凝集 能力。此外，專利文獻(xiàn)1公開了一種測量血小板機(jī)能的方法，其中血液被允許通過毛細(xì) 管內(nèi)部，然后通過分隔件的開口部，并測量因血栓形成而堵塞分隔件的開口部所需的時(shí)間。 然而，由于在這種方法中加入大量的血小板活化試劑，所以例如在血小板被活化但血小板 數(shù)量減少的情況下以及在血小板數(shù)量正常但血小板機(jī)能減弱的情況下，難以測定反映體內(nèi) 狀況的詳細(xì)血小板機(jī)能。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 JP 2007-29851IA非專利文獻(xiàn)__專禾[I文獻(xiàn) 1 :“Platelet Aggregability Test",Thrombosis and Circulation, vol. 12，No. 4，pl7-20，2004非專禾O 文獻(xiàn) 2 "‘Measurement of Platelet Aggregability with PFA-100"Thrombosis and Circulation, vol. 13, No. 3, p90-94,200
發(fā)明內(nèi)容
在諸如敗血癥和播散性血管內(nèi)凝血綜合征(DIC)等疾病中，由于血管內(nèi)皮紊亂和 血栓形成，血小板處于活化狀態(tài)，并且還形成血小板和白血球之間的復(fù)合體等。此外，由于 持續(xù)的血栓形成非常消耗血小板，所以盡管體內(nèi)血栓形成但仍可能出現(xiàn)出血癥狀。在常規(guī)的血小板機(jī)能檢驗(yàn)中，難以進(jìn)行嚴(yán)格反映這種癥狀的檢查。例如，在濁度法中，即使在血小板減少的情況下，當(dāng)針對血小板誘發(fā)物質(zhì)的反應(yīng)性 提高時(shí)，血小板機(jī)能也被判定為提高(增強(qiáng))。此外，由于因體內(nèi)的炎癥反應(yīng)等形成并大大 影響血栓形成的血小板和白血球之間的復(fù)合體在用于制備富血小板血漿的離心分離過程 中與紅血球一起沉積，所以它們未包含在富血小板血漿中。此夕卜，當(dāng)使用PFA-100時(shí)，在強(qiáng)血小板機(jī)能的患者和弱血小板機(jī)能的患者中測定 時(shí)使用相同濃度的誘發(fā)物質(zhì)，使得不能適宜地進(jìn)行確認(rèn)在誘發(fā)物質(zhì)不存在或處于極低濃度 條件下的自然凝集誘發(fā)或者確認(rèn)在給予抗血小板劑的患者中在誘發(fā)物質(zhì)的濃度極高條件 下藥劑的藥效的檢驗(yàn)。此外，即使在使用PFA-100測定時(shí)堵塞時(shí)間延長的情況下，也難以進(jìn) 行血小板機(jī)能減弱的情況與血小板數(shù)量減少但血小板機(jī)能提高(在活體內(nèi)活化)的情況之 間的比較。有鑒于上述情形，本發(fā)明的目的是提供一種使用少量血液在與血流同等環(huán)境下能 夠有效和正確地評價(jià)血小板機(jī)能的裝置和方法。為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，其中包括使抗凝固 處理的血液經(jīng)過在至少內(nèi)表面的一部分上具有血小板粘合面的毛細(xì)管，并觀察或測定血液 在所述毛細(xì)管內(nèi)的行為來檢驗(yàn)血小板機(jī)能。這里，優(yōu)選使用檸檬酸、肝素或水蛭素進(jìn)行抗凝固處理。此外，所述血小板粘合面優(yōu)選由膠原蛋白涂層或玻璃制成。此外，所述抗凝固處理的血液優(yōu)選經(jīng)受弱血小板活化處理，并且優(yōu)選通過將所述 抗凝固處理的血液與未引起不可逆血小板凝集的量的血小板活化試劑混合來進(jìn)行所述弱 血小板活化處理。這里，優(yōu)選使用血小板活化試劑進(jìn)行所述血小板活化處理，并且所述血小板活化 試劑優(yōu)選是腺苷二磷酸，它與所述抗凝固處理的血液混合至濃度為0. 001 5 μ M，或者所 述血小板活化試劑優(yōu)選是花生四烯酸，它與所述抗凝固處理的血液混合至濃度為0. 001 ImM0此外，所述毛細(xì)管內(nèi)部的至少一部分優(yōu)選具有包括流路分割壁的流路分割部，所述流路分割壁沿著在所述毛細(xì)管內(nèi)的血液流動方向延伸并將所述毛細(xì)管的寬度分割成多 個流路。所述流路分割部的各流路的寬度優(yōu)選為10 200 μ m。所述血小板粘合面優(yōu)選設(shè)置在所述毛細(xì)管的流路分割部中。所述毛細(xì)管優(yōu)選形成在微芯片內(nèi)。在本發(fā)明的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法中，血小板機(jī)能優(yōu)選通過以下方法檢驗(yàn)，其中 利用泵將所述抗凝固處理的血液，優(yōu)選經(jīng)受弱血小板活化處理的抗凝固處理的血液，導(dǎo)入 所述毛細(xì)管內(nèi)，并利用壓力傳感器測量因血液流入所述毛細(xì)管內(nèi)而施加在所述泵上的壓 力。這里，所述抗凝固處理的血液優(yōu)選保存在與所述毛細(xì)管和所述泵連接的血液收容部內(nèi)， 通過利用所述泵將比重小于血液的液體導(dǎo)入所述血液收容部內(nèi)而將血液導(dǎo)入所述毛細(xì)管 內(nèi)，并測量所述液體的流入壓力，從而間接測量因血液流入所述毛細(xì)管內(nèi)而施加的壓力。此外，所述抗凝固處理的血液優(yōu)選保存在與所述毛細(xì)管和所述泵連接的血液收容 部內(nèi)，通過利用所述泵將血小板活化試劑導(dǎo)入所述血液收容部內(nèi)而在所述血液收容部內(nèi)將 抗凝固處理的血液與血小板活化試劑混合，并將與所述血小板活化試劑混合的血液導(dǎo)入所 述毛細(xì)管內(nèi)，同時(shí)測量所述血小板活化試劑的流入壓力，從而間接測量因血液流入所述毛 細(xì)管內(nèi)而施加的壓力。此外，優(yōu)選地，在本發(fā)明的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法中，所述毛細(xì)管與所述血液收容 部連接，并且允許在所述血液收容部內(nèi)與血小板活化試劑混合的抗凝固處理的血液經(jīng)過所 述毛細(xì)管。這里，所述血小板活化試劑優(yōu)選就在測定之前與所述抗凝固處理的血液混合?？?選擇地，所述血小板活化試劑與所述抗凝固處理的血液混合使得所述血小板活化試劑在抗 凝固處理的血液和血小板活化試劑的混合物中的濃度沿著線性濃度梯度或階躍濃度梯度 增大?？鼓烫幚淼难汉脱“寤罨噭┑幕旌衔飪?yōu)選被攪拌。本發(fā)明還提供一種血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，其包括在至少內(nèi)表面的一部分上具有 血小板粘合面的毛細(xì)管；和設(shè)置在所述毛細(xì)管的至少一部分上的流路分割部，所述流路分 割部具有流路分割壁，所述流路分割壁沿著在所述毛細(xì)管內(nèi)的血液流動方向延伸并將所述 毛細(xì)管的寬度分割成多個流路。這里，所述毛細(xì)管優(yōu)選形成在微芯片內(nèi)，并且優(yōu)選地，不少于兩個毛細(xì)管形成在微 芯片內(nèi)。在后一種情況下，所述各毛細(xì)管優(yōu)選具有10 150μπι和50 200μπι范圍的不 少于2種的寬度。此外，所述血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置優(yōu)選具有送液泵。此外，它優(yōu)選具有照相機(jī)，用于 拍攝所述微芯片內(nèi)部的圖像。此外，所述血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置優(yōu)選具有在所述微芯片內(nèi)部的血小板粘合面下游 的廢液貯存部，所述廢液貯存部用于保存已經(jīng)通過所述血小板粘合面的血液廢液。在這種 情況下，所述廢液貯存部的深度優(yōu)選不小于100 μ m。更優(yōu)選地，在所述廢液貯存部的位置處 設(shè)置貫通至所述微芯片外部的孔，特別優(yōu)選地，在相應(yīng)于所述微芯片的表面上的孔的位置 設(shè)置血液吸收材料。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，通過使抗凝固處理的 血液經(jīng)過在至少內(nèi)表面的一部分上具有血小板粘合面的毛細(xì)管，并觀察或測定血液在所述 毛細(xì)管內(nèi)的行為，從而用作在血液經(jīng)過所述血小板粘合面時(shí)引起的剪切應(yīng)力造成的血小板活化的指標(biāo)，可以檢驗(yàn)血小板機(jī)能。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求2所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于檸檬酸、肝素或 水蛭素用于抗凝固處理，因而可以廉價(jià)地進(jìn)行抗凝固處理。在膠原蛋白涂層用作所述血小板粘合面并且將要使用的所述抗凝固處理劑是諸 如檸檬酸等鈣螯合劑的情況下，更適于通過將血液與血小板活化試劑混合并使混合物經(jīng)過 膠原蛋白涂層而進(jìn)行血小板機(jī)能的測定。另一方面，在使用鈣螯合劑之外的抗凝固處理劑 的情況下，特別是使用水蛭素，與在使用檸檬酸進(jìn)行抗凝固處理的情況下相比，血小板凝集 在膠原蛋白上更迅速更強(qiáng)烈地發(fā)生，造成所述毛細(xì)管的堵塞，使得即使在未使用血小板活 化試劑時(shí)也可以進(jìn)行穩(wěn)定的血小板機(jī)能檢驗(yàn)。當(dāng)由于血小板機(jī)能異?；蚩寡“鍎┑氖褂?等而未發(fā)生血小板凝集時(shí)，通過在測定之前混合血小板活化試劑可以測量血小板機(jī)能的降 低程度或抗血小板劑的效果。通過在一個芯片內(nèi)配置具有不同流路寬度的流路并使用用水 蛭素和檸檬酸抗凝固處理的血液，可以綜合測定血小板凝集能力的強(qiáng)度、血小板誘發(fā)物質(zhì) 的敏感度和抗血小板劑的效果等。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求3所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述血小板粘合 面由膠原蛋白涂層制成，因而可以測定更為生理的血小板機(jī)能。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求4所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述血小板粘合 面由玻璃制成，因而可以使用更廉價(jià)的物質(zhì)測定血小板機(jī)能。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求5所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述抗凝固處理 的血液經(jīng)受弱血小板活化處理，因而可以在更為生理的條件下測定血小板機(jī)能并且可以獲 得反映各種疾病的檢驗(yàn)結(jié)果。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求6所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于通過將所述抗凝 固處理的血液與未引起不可逆血小板凝集的量的血小板活化試劑混合來進(jìn)行所述弱血小 板活化處理，因而可以簡便地進(jìn)行弱血小板活化處理，并且血小板活化試劑引起的血小板 活化與血小板粘合面上的剪切應(yīng)力引起的血小板活化的組合允許觀察更為生理的血小板活化。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求7所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述血小板活化 試劑是腺苷二磷酸，它與所述抗凝固處理的血液混合至濃度為0. 001 5 μ Μ,因而可以在 更為生理的條件下檢驗(yàn)血小板機(jī)能并且可以獲得反映各種疾病的結(jié)果。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求8所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述血小板活化 試劑是花生四烯酸，它與所述抗凝固處理的血液混合至濃度為0. 001 ImM，因而可以在更 為生理的條件下檢驗(yàn)血小板機(jī)能并且可以獲得反映各種疾病的結(jié)果。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求9所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述毛細(xì)管內(nèi)部 的至少一部分具有包括流路分割壁的流路分割部，所述流路分割壁沿著在所述毛細(xì)管內(nèi)的 血液流動方向延伸并將所述毛細(xì)管的寬度分割成多個流路，因而容易發(fā)生剪切應(yīng)力引起的 血小板活化。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求10所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述流路分割 部的各流路的寬度為10 200 μ m，允許各流路提供支架(scaffold)，因而在形成小的血小 板凝集體時(shí)，即使在快速血流和高剪切應(yīng)力下，血小板凝集體也可增大內(nèi)部壓力，而不會被 血流沖走。
使用本發(fā)明的如權(quán)利要求11所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述血小板粘 合面設(shè)置在所述毛細(xì)管的流路分割部中，因而血小板凝集體容易保持在流路分割部中。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求12所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述毛細(xì)管形 成在微芯片內(nèi)，因而可以使用少量血液進(jìn)行檢驗(yàn)。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求13所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于利用泵將所述 抗凝固處理的血液導(dǎo)入所述毛細(xì)管內(nèi)，并利用壓力傳感器測量因血液流入所述毛細(xì)管內(nèi)而 施加在所述泵上的壓力，從而檢驗(yàn)血小板機(jī)能，因而可以定量地測定血小板機(jī)能。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求14所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述抗凝固處 理的血液保存在與所述毛細(xì)管和所述泵連接的血液收容部內(nèi)，通過利用所述泵將比重小于 血液的液體導(dǎo)入所述血液收容部內(nèi)而將血液導(dǎo)入所述毛細(xì)管內(nèi)，并測量所述液體的流入壓 力，從而間接測量因血液流入所述毛細(xì)管內(nèi)而施加的壓力，因而泵未被血液污染。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求15所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述抗凝固處 理的血液保存在與所述毛細(xì)管和所述泵連接的血液收容部內(nèi)，通過利用所述泵將血小板活 化試劑導(dǎo)入所述血液收容部內(nèi)而在所述血液收容部內(nèi)將抗凝固處理的血液與血小板活化 試劑混合，并將與所述血小板活化試劑混合的血液導(dǎo)入所述毛細(xì)管內(nèi)，同時(shí)測量所述血小 板活化試劑的流入壓力，從而間接測量因血液流入所述毛細(xì)管內(nèi)而施加的壓力，因而可以 快速地進(jìn)行檢驗(yàn)。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求16所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于所述血小板活 化試劑與所述抗凝固處理的血液混合使得所述血小板活化試劑在抗凝固處理的血液和血 小板活化試劑的混合物中的濃度沿著線性濃度梯度或階躍濃度梯度增大，因而可以測定寬 范圍濃度的血小板活化試劑引起的血小板活化，并且可以在一次實(shí)驗(yàn)中測定血小板的機(jī)能 亢進(jìn)和機(jī)能減退。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求17所述的檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，由于抗凝固處理的 血液和血小板活化試劑的混合物被攪拌，因而可以獲得更準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求17所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，由于血小板機(jī)能檢驗(yàn) 裝置包括在至少內(nèi)表面的一部分上具有血小板粘合面的毛細(xì)管；和設(shè)置在所述毛細(xì)管的 至少一部分上的流路分割部，所述流路分割部具有流路分割壁，所述流路分割壁沿著在所 述毛細(xì)管內(nèi)的血液流動方向延伸并將所述毛細(xì)管的寬度分割成多個流路，因而血小板可以 被有效地活化。因此，所述裝置適于上述檢驗(yàn)血小板的方法。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求18所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，由于所述毛細(xì)管形成 在微芯片內(nèi)，因而可以容易的制作毛細(xì)管并且可以使用少量樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求19所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，由于不少于兩個毛細(xì) 管形成在微芯片內(nèi)，因而可以同時(shí)進(jìn)行多種檢驗(yàn)。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求20所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，由于所述各毛細(xì)管具 有10 150 μ m和50 200 μ m范圍的不少于2種的寬度，因而可以使用少量樣品同時(shí)進(jìn) 行多種檢驗(yàn)。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求21所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，由于所述裝置具有送 液泵，因而可以控制血液流入毛細(xì)管的流量，這是優(yōu)選的。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求22所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，由于所述裝置具有照相機(jī)，用于拍攝所述微芯片內(nèi)部的圖像，因而可以觀察血小板活化。設(shè)置的照相機(jī)優(yōu)選能夠 拍攝靜止或活動圖像。如果照相機(jī)能夠以恒定間隔自動地拍攝內(nèi)部的靜止或活動圖像，則 可以在測定之后隨著時(shí)間推移來視覺評價(jià)血小板活化的狀態(tài)，這是優(yōu)選的。如果整個流路 內(nèi)部的圖像被作為全景照片或連續(xù)靜止圖像拍攝，則可以容易地進(jìn)行它們的保存和比較， 這是更優(yōu)選的。當(dāng)拍攝靜止或活動圖像時(shí)，安裝透過型光源，即，在所述照相機(jī)相對側(cè)的光 源，能夠拍攝更清楚的圖像。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求23所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，由于所述裝置具有在 所述微芯片內(nèi)部的血小板粘合面下游的廢液貯存部，所述廢液貯存部用于保存已經(jīng)通過所 述血小板粘合面的血液廢液，因而不需要吸收和除去血液廢液，因此可以簡便地進(jìn)行檢驗(yàn)。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求M所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，由于所述廢液貯存部 的深度不小于100 μ m,因而可以充分地保存血液廢液。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求25所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，由于在所述廢液貯存 部的位置處設(shè)置貫通至所述微芯片外部的孔，因而所述廢液貯存部內(nèi)的空氣被排出到外 部，因此可以在未增大內(nèi)部壓力的情況下將血液保存在貯存部中。使用本發(fā)明的如權(quán)利要求沈所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，由于在相應(yīng)于所述微 芯片的表面上的孔的位置設(shè)置血液吸收材料，因而血液廢液可以被吸收進(jìn)血液吸收材料 內(nèi)，因此血液廢液未飛散。


圖1是構(gòu)成本發(fā)明的血小板監(jiān)測裝置的微芯片的第一實(shí)施方案的示圖。圖2是本發(fā)明的血小板監(jiān)測裝置的第一實(shí)施方案的示圖。圖3是構(gòu)成本發(fā)明的血小板監(jiān)測裝置的微芯片的第二實(shí)施方案的示圖。圖4是本發(fā)明的血小板監(jiān)測裝置的第二實(shí)施方案的示圖。圖5是實(shí)施例1中的泵109的壓力變化的示圖。圖6是實(shí)施例2中的泵109的壓力變化的示圖。圖7是實(shí)施例3中的泵109的壓力變化的示圖。圖8是實(shí)施例4中的泵109的壓力變化的示圖。圖9是實(shí)施例5中的泵109的壓力變化的示圖。圖10是實(shí)施例6中的泵109的壓力變化的示圖。圖11是實(shí)施例7中的血小板活化的狀態(tài)的示圖(照片)。A 無ADP ；B :0. 025 μ M ADP ；C 0. 05 μ M ADP ；D 0. 1 μ M ADP。圖12是實(shí)施例8 10中的泵209的壓力變化的示圖。圖13是本發(fā)明的血小板監(jiān)測裝置的第三實(shí)施方案的示圖。圖14是實(shí)施例11 13中的泵209的壓力變化的示圖。圖15是實(shí)施例14和15中的泵209的壓力變化的示圖。圖16是在20μ Ι/min下壓力上升的結(jié)果，使用加入花生四烯酸的血液得到該結(jié) 果。A顯示在20 μ Ι/min下壓力上升的結(jié)果，使用實(shí)施例16a的受試體G的加入花生四烯酸 的血液得到該結(jié)果。B顯示在與16a相似的實(shí)驗(yàn)中的壓力上升，其中受試體G已經(jīng)預(yù)先服用 IOOmg阿司匹林。
圖17是在10 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用加入花生四烯酸的血液得到該結(jié) 果。C顯示在10 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用實(shí)施例16b的受試體G的加入花生四烯酸 的血液得到該結(jié)果。D顯示在與16b相似的實(shí)驗(yàn)中的壓力上升，其中受試體G已經(jīng)預(yù)先服用 IOOmg阿司匹林。圖18是在5 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用加入花生四烯酸的血液得到該結(jié)果。 E顯示在5 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用實(shí)施例16c的受試體G的加入花生四烯酸的 血液得到該結(jié)果。F顯示在與16c相似的實(shí)驗(yàn)中的壓力上升，其中受試體G已經(jīng)預(yù)先服用 IOOmg阿司匹林。圖19是在20 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用加入膠原蛋白的血液得到該結(jié)果。 A顯示在20 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用實(shí)施例16d的受試體G的加入6 μ 1膠原蛋白 的血液得到該結(jié)果。B、C和D分別顯示在與實(shí)施例16d相似的實(shí)驗(yàn)中的壓力上升，使用在 實(shí)施例18中加入18 μ 1膠原蛋白的血液、其中使用在實(shí)施例18中加入12 μ 1膠原蛋白的 血液和其中受試體G已經(jīng)預(yù)先服用IOOmg阿司匹林。圖20是在10 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用加入膠原蛋白的血液得到該結(jié)果。 E顯示在10 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用實(shí)施例16e的受試體G的加入膠原蛋白的血液 得到該結(jié)果。F顯示在與16e相似的實(shí)驗(yàn)中的壓力上升，其中受試體G已經(jīng)預(yù)先服用IOOmg 阿司匹林。圖21是在5 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用加入膠原蛋白的血液得到該結(jié)果。F 顯示在5 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用實(shí)施例16f的受試體G的加入膠原蛋白的血液得 到該結(jié)果。G顯示在與16f相似的實(shí)驗(yàn)中的壓力上升，其中受試體G已經(jīng)預(yù)先服用IOOmg阿 司匹林。圖22是在20 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用實(shí)施例21中的用0. 4 μ g/ml或 0.8 μ g/ml ReoPro處理的血液得到該結(jié)果?！畬φ铡@示在20 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果， 使用實(shí)施例19中的血液(未用ReoPro處理)得到該結(jié)果。圖23是在7 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用實(shí)施例21中的用0. 4 μ g/ml或 0. 8 μ g/ml ReoPro處理的血液得到該結(jié)果?！畬φ铡@示在7 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果， 使用實(shí)施例20中的血液(未用ReoPro處理)得到該結(jié)果。圖M是在20 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用實(shí)施例22中的用0. 01 μ g/ml或 0. 1 μ g/ml OS-I處理的血液得到該結(jié)果。‘對照’顯示在20 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使 用未用OS-I處理的血液得到該結(jié)果。圖25是在7 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使用實(shí)施例22中的用0. 01 μ g/ml或 0. 1 μ g/ml OS-I處理的血液得到該結(jié)果?！畬φ?，顯示在7 μ 1/min下壓力上升的結(jié)果，使 用未用OS-I處理的血液得到該結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面參照

本發(fā)明的血小板檢驗(yàn)裝置。在本發(fā)明中，‘血液’包括全血和富 血小板血漿。圖1是構(gòu)成本發(fā)明的血小板檢驗(yàn)裝置的微芯片的第一實(shí)施方案的概念圖。下面基 于圖1進(jìn)行說明。
圖KA)是第一基板100的平面圖，其中在表面上刻有相應(yīng)于微芯片1的毛細(xì)管 101的凹槽。凹槽的截面形狀可以是任意的，可以是矩形、U形或V形等。由于血小板凝集 體是脆性的，因此為測量壓力上升，凹槽的深度優(yōu)選不超過10 200 μ m。凹槽的寬度優(yōu)選 為 10 100 μ m。在相應(yīng)于毛細(xì)管101的凹槽的第一端部(入口側(cè)的端部)和第二端部(出口側(cè)的 端部)之間的部分中，設(shè)有沿著血液流動方向延伸的多個流路分割壁103，從而形成將毛細(xì) 管的寬度分割成多個流路的流路分割部102。此外，流路分割壁103之間的間隔優(yōu)選不超過200 μ m。由于寬度不超過200 μ m， 因此當(dāng)形成血小板凝集體時(shí)，即使在快速血流和高剪切應(yīng)力下，血小板凝集體也可增大內(nèi) 部壓力，而不會被血流沖走。此外，在流路分割部102中，毛細(xì)管101的寬度優(yōu)選被流路分 割壁103分割成不少于5個流路。也就是說，在流路的寬度被分割成不少于5個流路的情 況下，各分割流路的堵塞被平均化，因此可以容易地獲得偏差較小的數(shù)據(jù)。流路分割壁103的形狀不受限制，只要它們可以將毛細(xì)管101的寬度分割成多個 流路。圖I(B)是第二基板110的平面圖，其上刻有相應(yīng)于微芯片1的入口 104和出口 105的貫通孔。貫通孔相應(yīng)于入口 104和出口 105的位置是在與第一基板100疊置時(shí)分別 相應(yīng)于第一基板100上的毛細(xì)管101的第一端部和毛細(xì)管101的第二端部的位置。此外， 通過用膠原蛋白等涂布第二基板Iio的覆蓋第一基板100上的流路分割部102的背面，形 成血小板粘合面106。更具體而言，如圖I(C)所示，膠原蛋白等從安全性的觀點(diǎn)來看寬泛地 涂布在將要用作血小板粘合面106的區(qū)域上。如圖3所示(第二實(shí)施方案)，血小板粘合面還可以在毛細(xì)管的整個長度上延伸。 在第二實(shí)施方案中，第二基板210的材料是玻璃，并且微芯片2的毛細(xì)管201內(nèi)部的第二基 板側(cè)的整個長度用作血小板粘合面206?？蛇x擇地，如圖1和圖3所示，代替在相應(yīng)于毛細(xì)管的第二端部在第二基板中的位 置處設(shè)置貫通孔并從而提供出口，如圖13所示(第三實(shí)施方案)，通過設(shè)置凹槽使其包圍相 應(yīng)于毛細(xì)管301的第二端部在第二基板310上的位置并用第一基板300覆蓋凹槽，可以設(shè) 置用于保存已經(jīng)通過血小板粘合面306的血液廢液的廢液貯存部307。通過設(shè)定廢液貯存 部307的容量大于檢驗(yàn)用的血液量，可以消除象第一和第二實(shí)施方案中那樣使用泵等從出 口抽吸血液廢液并排出的操作，使得可以更容易地進(jìn)行檢驗(yàn)。貫通孔可以設(shè)置在廢液貯存 部307中，以提供氣孔305。通過將血液吸收材料308放置在相應(yīng)于微芯片3的表面上的 貫通孔305的位置，即使在血液樣品量很大的情況下也可以避免血液廢液向微芯片外部擴(kuò) 散。將要貼附的血液吸收材料的例子包括海綿和布。圖I(C)是微芯片1的平面圖，其中第一基板100和第二基板110彼此疊置，使得 第一基板100的凹槽和第二基板110的血小板粘合面向內(nèi)面對。波浪線顯示毛細(xì)管103存 在于微芯片1的內(nèi)部。血小板粘合面的例子包括膠原蛋白涂層和玻璃。其中，由于膠原蛋白容易獲得和 處理并且能夠提供近似于實(shí)際血管的模型，因而是特別優(yōu)選的。血小板粘合面也可以是含 有膠原蛋白和組織促凝血酶原激酶的血小板粘合面。諸如膠原蛋白等物質(zhì)以高粘合強(qiáng)度涂 布在血小板粘合面106上，從而避免被血流沖走。
通過例如JP 05-260950A和Blood. 1995 Apr 1 ；85(7) 1擬6_35 中所記載的，將膠 原蛋白溶解在酸性溶液中，并將得到的溶液涂布在被賦予親水性的諸如玻璃或聚苯乙烯等 基板的預(yù)定位置上，然后洗滌和干燥基板，可以高粘合強(qiáng)度簡便地涂布膠原蛋白涂層。在將要涂布疏水性樹脂等的情況下，通過經(jīng)等離子體處理等使樹脂表面親水化， 然后將膠原蛋白溶液涂布到所需區(qū)域，然后風(fēng)干或減壓干燥，可以獲得涂層。在塑料用作基材的情況下，通過經(jīng)等離子體處理等使其表面親水化，然后使用諸 如吸液管或注射器等分配器將膠原蛋白溶液涂布到所需區(qū)域，然后風(fēng)干或減壓干燥，可以 用膠原蛋白或含有組織促凝血酶原激酶的膠原蛋白容易地進(jìn)行涂布。在玻璃用作血小板粘合面的情況下，可以使用其中僅相應(yīng)于血小板粘合面106的 位置由玻璃形成而其他區(qū)域由塑料或硅樹脂等形成的第二基板110，或者如圖3所示，在玻 璃基板用作第二基板210并且第二基板與由塑料或硅樹脂等形成的第一基板200疊置的情 況下，血小板粘合面206可以在毛細(xì)管201的整個長度上延伸。微芯片1的材料優(yōu)選是金屬、玻璃、塑料或硅樹脂等。從在血液監(jiān)測(尤其是圖像 分析)中的用途的觀點(diǎn)來看，透明材料是優(yōu)選的。此外，從回路形成的觀點(diǎn)來看，塑料是優(yōu) 選的，透明塑料是特別優(yōu)選的。在材料是諸如PDMS(聚二甲基硅氧烷)等硅樹脂的情況下， 在各基板之間獲得優(yōu)異的粘合，使得第一基板100甚至通過按壓就可以與第二基板110疊 置，無需使用粘合劑等進(jìn)行粘合，但是在向微芯片1的內(nèi)部施加高壓力的情況下，優(yōu)選使用 粘合劑。通過使用聚(丙烯酸2-甲氧基乙酯)(PMEA)，還可以在意料之外的部位容易和有 效地抑制血液凝固?？梢允褂玫毒呋蚣す馐坛鲈谖⑿酒?的基板上設(shè)置的凹槽和孔，并 且在微芯片1的材料是塑料的情況下，也可以通過射出成型來形成。通過射出成型來形成 是優(yōu)選的，因?yàn)榭梢杂行У刂谱骶哂幸恢沦|(zhì)量的微芯片1。下面基于圖1 (C)說明使用本實(shí)施方案的微芯片1的血小板機(jī)能檢驗(yàn)的一個例子。 將管子(圖未示)與第一入口 104連接，經(jīng)由該管子連接血液貯存器(血液收容部)107和 送液泵109(圖未示)。通過將連接的泵109中的液體注入貯存器107內(nèi)，將貯存器內(nèi)的血 液注入微芯片1。如果泵內(nèi)的液體是血小板活化試劑，則貯存器內(nèi)的抗凝固處理的血液的 血小板被活化，并且當(dāng)通過血小板粘合面時(shí)由于剪切應(yīng)力而被進(jìn)一步活化。此外，貯存器內(nèi) 的血小板活化試劑的濃度可以持續(xù)上升。通過在血液貯存器內(nèi)放置攪拌子并攪拌內(nèi)部的血 液，使血小板活化試劑與血液不斷混合，這是優(yōu)選的。送液泵內(nèi)的液體可以是比重小于血液的液體，如礦物油或生理鹽水，并且該液體 可以被導(dǎo)入預(yù)先填充抗凝固處理的血液的貯存器內(nèi)，從而允許血液被導(dǎo)入毛細(xì)管內(nèi)。通過 測量該液體的流入壓力，可以間接測量因血液流入毛細(xì)管而施加的壓力。貯存器所預(yù)先填 充的抗凝固處理的血液優(yōu)選是與血小板活化試劑的混合物。還可以將干燥或液體狀態(tài)的血 小板活化試劑預(yù)先放置在貯存器內(nèi)，然后與血液混合。此外，通過以階躍方式增大送液泵的 流量，還可以階躍方式增大剪切應(yīng)力。抑制血液凝固的抗凝固處理用的抗凝固處理劑的例子包括檸檬酸鈉或鉀；草酸鈉 或鉀；A⑶(酸性檸檬酸葡萄糖)；和乙二胺四乙酸(EDTA)鹽。這些抗凝固處理劑可以作為 粉末、凍干品或溶液(如水溶液)使用。在這些抗凝固處理劑中，常用的3. 2%檸檬酸鈉是 優(yōu)選的，因?yàn)槿菀撰@得。在這種情況下，優(yōu)選的是9體積的血液使用1體積的這種抗凝固處理劑。
可以使用的其他抗凝固處理劑的例子包括肝素、水蛭素、凝血酶適體和玉米胰蛋 白酶抑制劑(1977. J.Biol. Chem 252.8105)?？梢允褂贸^一種的抗凝固處理劑。在使用 的抗凝固處理劑是水蛭素的情況下，與使用檸檬酸的抗凝固處理的情況相比，即使沒有使 用血小板活化試劑處理也引起更強(qiáng)的血小板凝集，使得水蛭素適于測定剪切應(yīng)力依賴性的 血小板機(jī)能。在使用檸檬酸抗凝固處理血液的情況下，可以準(zhǔn)確地測定依賴于血小板活化 試劑的刺激的血小板機(jī)能，使得檸檬酸更適于抗血小板劑的評價(jià)等。獲得抗凝固處理的血液的方法的例子包括其中上述抗凝固處理劑預(yù)先放置在注 射器或真空采血管中，然后用其采集血液的方法，以及其中在采集血液后立即將抗凝固處 理劑快速加到血液中的方法。還可以使用含有肝素的真空采血管等收集血液，然后加入肝素酶和適于監(jiān)測目的 的抗凝固處理劑，從而利用肝素酶使肝素分解，實(shí)現(xiàn)用適于測定目的的抗凝固處理劑置換 肝素。將要與抗凝固處理的血液混合的血小板活化試劑的例子包括ADP、膠原蛋白、凝血 酶、花生四烯酸和利托菌素。血小板活化試劑以引起弱血小板活化的濃度與抗凝固處理的 血液混合。引起弱血小板活化的濃度是在靜止?fàn)顟B(tài)下未引起不可逆的血小板凝集(血小板 二次凝集)的濃度。例如，在ADP的情況下，濃度為0.001 5μΜ，在花生四烯酸的情況下， 濃度為0. 001 ImM。然而，在由于血小板機(jī)能異?；蚪o予抗血小板劑而使得對于這些血小 板活化試劑的反應(yīng)性明顯降低的情況下，優(yōu)選在加入濃度高于上述濃度的血小板活化試劑 下進(jìn)行降低程度的測定。特別地，在測定氯吡格雷(clopidogrel)或阿司匹林的效果程度 的情況下，優(yōu)選的是分別使用ADP或花生四烯酸的增大濃度進(jìn)行測定。從入口 104引入并經(jīng)過毛細(xì)管101的弱血小板活化試劑和抗凝固處理的血液的混 合物經(jīng)過流路分割部102，同時(shí)產(chǎn)生剪切應(yīng)力，并因而增強(qiáng)血小板的活化，導(dǎo)致血小板在血 小板粘合面上的粘合和積聚。通過調(diào)節(jié)流量和微芯片并在高剪切應(yīng)力和低剪切應(yīng)力下進(jìn)行 比較實(shí)驗(yàn)，可以更詳細(xì)地評價(jià)血小板機(jī)能、評價(jià)抗血小板劑的藥效等。通過觀察經(jīng)過流路分 割部102的混合物的流量和性狀，可以監(jiān)測血小板機(jī)能。被監(jiān)測的血液從設(shè)置在毛細(xì)管101 端部的出口 105排出。下面說明使用微芯片1的本發(fā)明的血小板檢驗(yàn)裝置。圖2是作為本發(fā)明的血小板檢驗(yàn)裝置的第一實(shí)施方案的血小板檢驗(yàn)裝置A的概念 圖，其中微芯片1由透明基板構(gòu)成并組裝到裝置中。下面基于圖2說明第一實(shí)施方案。將其中放置抗凝固處理的血液并包含攪拌子108的貯存器107(血液收容部)以 倒立位置與微芯片1的入口 104連接，將供應(yīng)血小板活化試劑的送液泵109經(jīng)由管子與貯 存器107連接。將壓力傳感器(圖未示)與送液泵109連接。從送液泵109將血小板活化試劑注入貯存器107內(nèi)，并利用由磁力攪拌器113驅(qū) 動的攪拌子108將血小板活化試劑與抗凝固處理的血液混合。通過在將血小板活化試劑從送液泵109導(dǎo)入貯存器107內(nèi)時(shí)調(diào)節(jié)泵的流量，從而 使血小板活化試劑在與血液的混合物中的濃度從0自動地增大到能夠充分誘發(fā)血小板的 濃度，可以在一次實(shí)驗(yàn)中測定血小板機(jī)能亢進(jìn)和血小板機(jī)能減退，這是優(yōu)選的。例如，ADP 濃度可以沿著0 0. 1 μ M的濃度梯度增大，或者誘發(fā)物質(zhì)的濃度可以階躍方式從0增大到 0. 02,0. 04,0. 06,0. 08 和 0. 1 μ Μ。
與血小板活化試劑混合的抗凝固處理的血液注入到微芯片1的毛細(xì)管101內(nèi)?；?合物經(jīng)過毛細(xì)管101并到達(dá)具有諸如膠原蛋白或玻璃等血小板粘合面的流路分割部102。通過使用照相機(jī)111觀察血小板在流路分割部102的活化(粘合、凝集等)和引 起的毛細(xì)管堵塞，可以檢驗(yàn)血小板機(jī)能?？蛇x擇地，通過利用與送液泵109連接的壓力傳感 器測量流路中的壓力，可以進(jìn)行更定量的血小板機(jī)能檢驗(yàn)。此外，通過測量血液與血小板活 化試劑的混合物經(jīng)過毛細(xì)管101所需的時(shí)間長度或已經(jīng)經(jīng)過毛細(xì)管101的混合物量，也可 以進(jìn)行血小板機(jī)能檢驗(yàn)。照相機(jī)111與圖像分析儀114連接，它們能夠使血小板活化的狀態(tài)成像等。從患 者血液狀態(tài)的綜合判斷的觀點(diǎn)來看，通過采集毛細(xì)管內(nèi)部的血小板活化的圖像而視覺評價(jià) 和基于壓力上升的血小板活化的定量檢驗(yàn)的組合非常重要。例如，在諸如DIC等病態(tài)中血 小板已經(jīng)體內(nèi)活化但顯著消耗和減少的情況下，壓力上升和堵塞延遲。即使在這種情況下， 使用照相機(jī)采集內(nèi)部圖像也能夠從檢驗(yàn)開始之后立即確認(rèn)血小板粘合面上的血小板粘合 和凝集上升等，使得可以綜合判斷患者血液的狀況。照相機(jī)111可以沿著毛細(xì)管101中的血流方向移動。也可以通過使用奎納克林等熒光標(biāo)記血小板來分析血小板。在這種情況下，可以 通過利用圖像分析來監(jiān)測因?yàn)闊晒舛繂挝幻娣e的亮度，使監(jiān)測結(jié)果數(shù)值化，從而獲得作 為數(shù)據(jù)的監(jiān)測結(jié)果。將微芯片1置于平臺狀加熱器115上，通過利用加熱器115加熱微芯片1達(dá)至 37°C，可以在與身體內(nèi)部相似的條件下進(jìn)行監(jiān)測。含有已經(jīng)經(jīng)過流路分割部102的血液的混合物從出口 105平穩(wěn)地排出到出口管 112。攪拌子優(yōu)選被進(jìn)行抗凝固處理?？鼓烫幚砜梢允峭ㄟ^在熔融樹脂中浸漬磁性材 料而用肝素、聚乙烯基乳酰胺(PVLA)或聚(丙烯酸2-甲氧基乙酯)(PMEA)等在磁性材料 的表面上形成的涂層或者通過利用諸如模具內(nèi)射出成型等樹脂加工形成攪拌子的表面。盡管上面基于例子說明了其中血小板活化試劑與抗凝固處理的血液在微芯片外 部在貯存器內(nèi)混合，然后導(dǎo)入微芯片內(nèi)的毛細(xì)管中的實(shí)施方案，但是本發(fā)明的血小板機(jī)能 檢驗(yàn)裝置不限于上述實(shí)施方案。例如，還可以構(gòu)造以下裝置，其中在微芯片內(nèi)設(shè)置將抗凝固處理的血液與血小板 活化試劑混合在一起的混合部，并且在微芯片內(nèi)將血液與血小板活化試劑混合在一起，其 后允許混合物從混合部流入毛細(xì)管。實(shí)施例下面通過具體實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。[微芯片和血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置的制作]準(zhǔn)備兩個透明基板，S卩，圖I(A)所示的第一基板100和圖I(B)所示的第二基板 110 (Richell Corporation制造的射出成型品)。利用硅烷偶聯(lián)劑和60°CT 16小時(shí)的熱 壓粘合，將第一基板100的相應(yīng)于毛細(xì)管101的凹槽打開的側(cè)面和第二基板110的具有血 小板粘合面106的側(cè)面貼合到一起，使得它們彼此面對，從而提供圖I(C)所示的微芯片1。 在第一基板100中，流路(毛細(xì)管)101的長度、深度和寬度分別為20mm、50ym和2mm。關(guān) 于流路分割部102，長度為2mm、寬度為25 μ m和高度為50 μ m的各分割壁103以25 μ m的等間隔設(shè)置，并且這一部分用作流路分割部102。在第二基板100中，相應(yīng)于入口 104和出 口 105的各個孔是具有圓形截面且內(nèi)徑為2mm和深度為2mm的貫通孔。在第二基板110上 的與第一基板100的流路分割部102重疊的位置處，涂布3mg/ml的I型膠原蛋白(Nitta Gelatin Inc.制)，并真空干燥以提供血小板粘合面106。如圖2所示，將制成的微芯片1放置在平臺狀加熱器115上，并將貯存器107與微 芯片1的入口 104連接。將泵109經(jīng)由管子與貯存器107連接，并使用壓力傳感器(圖未 示)測量施加在泵上的壓力。在貯存器107中，包含通過用PMEA涂布鐵制圓柱制得的直徑 為2mm和長度為5mm的圓柱形攪拌子108。攪拌子108被設(shè)置成利用在加熱到37°C的加熱 器115下方設(shè)置的攪拌器113的磁力使其能夠以60 ISOrpm的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動。出口管112與 出口連接，使得可以排出分析后的血液。與圖像分析儀114連接的照相機(jī)111設(shè)置在微芯 片1的流路分割部102的上方，從而允許觀察在流路分割部102中的血小板活化的狀態(tài)。實(shí)施例1)使用圖1所示的微芯片1和圖2所示的血小板檢驗(yàn)系統(tǒng)A，進(jìn)行測定。從受試體A 采集用檸檬酸抗凝固處理的血液。將用檸檬酸抗凝固處理的全血充滿貯存器107，使用連接的泵109從入口將生理 鹽水注入貯存器107，從而從貯存器107擠出血液并允許血液流入微芯片1內(nèi)。在貯存器 107內(nèi)，包含攪拌子108，并利用攪拌子108攪拌血液。泵109的流量最初10秒為100μ 1/min，然后為3μ 1/min。泵109的壓力變化示于圖5。實(shí)施例2)按與實(shí)施例1相同方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了流量為6 μ/min，代替3 μ 1/min。(使用來自與實(shí)施例1中相同的受試體A的血液樣品。)泵109的壓力變化示于 圖6。(討論)使用相同樣品通過將流量從3μ 1/min增大到6 μ 1/min，剪切應(yīng)力增大， 并且確認(rèn)壓力上升。實(shí)施例3)按與實(shí)施例2相同方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了用0.5μΜ ADP溶液填充泵109，代替生理鹽 水。(使用來自與實(shí)施例中相同的受試體A的血液樣品。)泵109的壓力變化示于圖7。實(shí)施例4 6)使用來自另一個受試體(受試體B)的樣品通過測定進(jìn)行實(shí)施例1 3中的實(shí)驗(yàn)。 泵109的壓力變化分別示于圖8、圖9和圖10。比較實(shí)驗(yàn))將來自受試體A和B的血液在800rpm下離心分離，得到富血小板血漿，使用血小 板凝集計(jì)(PA-20, Kowa Company, Ltd.)測定ADP誘發(fā)的血小板凝集能力。ΙμΜ ADP在來 自受試體A的血液中誘發(fā)的大凝集大約是在來自受試體B的血液中的一半。討論)基于受試體A和B的結(jié)果，可以確認(rèn)，由于在剪切應(yīng)力下對膠原蛋白的粘合和凝集 而造成的壓力上升在受試體A中比在受試體B中更弱。然而，在受試體A中，ADP誘發(fā)的凝 集能力更強(qiáng)，并且確認(rèn)在加入ADP時(shí)由于對膠原蛋白的粘合和凝集而造成的壓力上升與在受試體B中的相同。實(shí)施例7)使用圖像診斷用實(shí)施例1中的微芯片1和系統(tǒng)A進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。泵109中填充礦物油， 貯存器107充滿用檸檬酸抗凝固處理的血液。使用泵109以8μ Ι/min的流量將礦物油送 至貯存器107，從而允許血液流入微芯片1。使用通過將ADP加到檸檬酸處理的血液中至最 終濃度分別為0.025 μ M、0.05 μ M和0. 1 μ M而制備的血液，進(jìn)行完全相同的實(shí)驗(yàn)。圖11中 的各畫板顯示實(shí)驗(yàn)1分鐘后微芯片1內(nèi)部的狀態(tài)經(jīng)使用照相機(jī)111拍攝的圖像。討論)當(dāng)加入ADP時(shí)，觀察到貼附到梳子部上的血小板量以ADP濃度依賴性方式上升，并 且可以視覺確認(rèn)即使在未發(fā)生壓力上升水平下的血小板附著。[微芯片和血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置的制作]將圖3Α所示的第一基板200和圖所示的第二基板210彼此疊置并粘合，從而 提供圖3C所示的微芯片2。關(guān)于基板200，使用由PDMS制成的基板(Fluidware)，全部流 路的深度為120 μ m ；流路寬度為Imm ；梳子的長度為Imm ；梳子的寬度為50 μ m ；凹槽寬度為 50 μ m。關(guān)于基板210，使用載玻片，并且象基板110中那樣設(shè)置相應(yīng)于入口和出口的貫通 孔，但是與基板110不同的是，由于玻璃起到血小板粘合面的作用，因而未涂布膠原蛋白。 也就是說，毛細(xì)管201內(nèi)部的第二基板側(cè)的總長度用作血小板粘合面206。圖4中所示的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置B與圖2中的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置A相同，除了 使用微芯片2，代替微芯片1，并且沒有攪拌子和攪拌器。因?yàn)樵谝韵聦?shí)施例中，預(yù)先與ADP 混合的抗凝固處理的血液被放置在貯存器內(nèi)，所以不需要攪拌子和攪拌器。實(shí)施例8)使用圖3中所示的微芯片2和圖4中所示的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置B。將大約600 μ 1 的用檸檬酸抗凝固處理的血液填充入血液貯存器207。泵209填充礦物油，泵209與貯存 器207連接，其前端進(jìn)一步連接到微芯片2的入口 204。以20μ Ι/min的流量將礦物油從泵 209注入微芯片2，并利用壓力傳感器(圖未示)測量礦物油的流入壓力。實(shí)施例9)通過進(jìn)行與實(shí)施例8中相同的實(shí)驗(yàn)測定壓力變化，除了 ADP(Wakc) Pure Chemical Industries, Ltd.制)進(jìn)一步加到貯存器207內(nèi)的用檸檬酸抗凝固處理的血液，至最終濃 度為&ιΜ。實(shí)施例10)通過進(jìn)行與實(shí)施例9中相同的實(shí)驗(yàn)測定壓力變化，除了使用服用75mg氯吡格雷 (Sanofi-aventis)后3小時(shí)采集的血液。實(shí)施例8 10中的泵209的壓力變化示于圖12。加入極少量ADP造成壓力上升， 并且通過給予氯吡格雷抑制這種上升。[微芯片和血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置的制作]準(zhǔn)備兩個透明基板，S卩，圖I(A)所示的第一基板100和圖I(B)所示的第二基板 110 (Richell Corporation制造的射出成型品)。利用硅烷偶聯(lián)劑和熱壓粘合，將第一基板 100的相應(yīng)于毛細(xì)管101的凹槽打開的側(cè)面和第二基板110的具有血小板粘合面106的側(cè) 面貼合到一起，使得它們彼此面對，從而提供圖1(c)所示的微芯片1。在第一基板100中，流路(毛細(xì)管)101的長度、深度和寬度分別為20mm、50 μ m和2mm。關(guān)于流路分割部102，長 度為1.5mm、寬度為50 μ m和高度為50 μ m的各分割壁103以50 μ m的等間隔設(shè)置，并且這 一部分用作流路分割部。在第二基板100中，相應(yīng)于入口和出口的各個孔是具有圓形截面 且內(nèi)徑為2mm和深度為2mm的貫通孔。在第二基板110上的與第一基板100的流路分割部 102重疊的位置處，涂布大約10 μ 1的3mg/ml的I型膠原蛋白(Nitta Gelatin Inc.制)， 并真空干燥以提供血小板粘合面106。涂布膠原蛋白的區(qū)域是從梳子上游4mm到梳子下游 2mm，包括梳子。如圖4所示，將制成的微芯片1放置在加熱器215上，并且象實(shí)施例8中那樣將泵 209和貯存器207與微芯片1連接。實(shí)施例11)(a)使用水蛭素采血管(Multiplate Services GmbH)從受試體D采集血液，將大 約600 μ 1的用水蛭素抗凝固處理的血液填充入貯存器207。泵209填充礦物油，并與貯存 器207連接，其前端進(jìn)一步連接到微芯片1的入口 104。最初5秒以200μ1/π η的流量、然 后以20μ Ι/min的流量將礦物油從泵209注入貯存器，從而使貯存器內(nèi)的血液以相同流量 注入微芯片1，同時(shí)利用壓力傳感器(圖未示)測量礦物油的流入壓力。(b)按與(a)中相同方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了最初5秒以200μ1/π η的流量、然后以 ΙΟμΙ/min的流量將礦物油注入貯存器，從而使貯存器內(nèi)的血液以相同流量注入微芯片1， 同時(shí)測量礦物油的流入壓力。(c)按與(a)中相同方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了最初5秒以200μ1/π η的流量、然后以 5μ Ι/min的流量將礦物油注入貯存器，從而使貯存器內(nèi)的血液以相同流量注入微芯片1， 同時(shí)測量礦物油的流入壓力。實(shí)施例11(a)、(b)和(c)的結(jié)果示于圖14(A)。橫軸代表時(shí)間，縱軸代表由于芯 片中的堵塞造成的壓力上升。受試體D中按實(shí)施例(a)、(b)和(c)的順序引起壓力上升， 即，按剪切應(yīng)力遞減順序。實(shí)施例12)使用受試體E進(jìn)行與實(shí)施例11中相同的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示于圖14(B)。實(shí)施例13)使用受試體F進(jìn)行與實(shí)施例11中相同的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示于圖14(C)。參考例)使用全血血小板凝集計(jì)Multiplate (Dynabyte)針對受試體D、E和F測定血小板 凝集能力。使用水蛭素采血管采集血液，并測定由6μ M ADP誘發(fā)的凝集能力。結(jié)果如下 D，691AU/min ；E,525AU/min ；和F，652AU/min。ADP誘發(fā)的凝集能力在受試體D中最強(qiáng)，然后 按順序是受試體F和受試體E。討論在D、E和F中，壓力上升最初在高剪切應(yīng)力下發(fā)生，然后按順序是中和低剪切 應(yīng)力。此外，壓力上升最初在受試體D中發(fā)生，然后按順序是F和E，并將該結(jié)果與使用 Multiplate進(jìn)行的有關(guān)ADP誘發(fā)的凝集能力的檢驗(yàn)結(jié)果相關(guān)聯(lián)。按與實(shí)施例Ila相同方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了使用檸檬酸采血管采集血液并用檸檬酸 鈉進(jìn)行抗凝固處理。在這種情況下，即使在10分鐘后也未觀察到壓力上升。
實(shí)施例14)將大約600μ1用檸檬酸抗凝固處理的受試體E的血液與6μ1 100 μ MADP試劑 (Chrono-log Corporation)混合，在其后立即將貯存器充滿血液。象實(shí)施例Ila中那樣，將 充滿礦物油的泵與貯存器連接，再與微芯片連接。將微芯片1放置在加熱器上，允許血液最 初5秒以200 μ 1/min的流量流動，然后為20 μ 1/min。實(shí)施例I5)a)按與實(shí)施例14相同方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了使用受試體D的血液。b)按與實(shí)施例 14相同方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了使用在口服給予IOOmg氯吡格雷后6小時(shí)采集的受試體D的血 液。實(shí)施例15和14的結(jié)果示于圖15。在圖5中，A代表實(shí)施例15a)的結(jié)果；B代表 實(shí)施例15b的結(jié)果；和C代表實(shí)施例14的結(jié)果?？梢钥闯?，在受試體D中，由于給予氯吡格 雷壓力上升延遲，并且在給予氯吡格雷后壓力上升比受試體E的血液更慢。實(shí)施例I6)a)將大約600 μ 1用檸檬酸抗凝固處理的受試體G的血液與6 μ 1 50mM花生四烯 酸(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即將貯存器充滿血液。象實(shí)施例Ila中那樣， 將充滿礦物油的泵與貯存器連接，再與微芯片連接。將微芯片1放置在加熱器上，允許血液 最初5秒以200 μ 1/min的流量流動，然后為20 μ 1/min。b)將大約600 μ 1用檸檬酸抗凝固處理的受試體G的血液與6 μ 1 50mM花生四烯 酸(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即將貯存器充滿血液。象實(shí)施例Ila中那樣， 將充滿礦物油的泵與貯存器連接，再與微芯片連接。將微芯片1放置在加熱器上，允許血液 最初5秒以200 μ 1/min的流量流動，然后為10 μ 1/min。c)將大約600 μ 1用檸檬酸抗凝固處理的受試體G的血液與6 μ 1 50mM花生四烯 酸(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即將貯存器充滿血液。象實(shí)施例Ila中那樣， 將充滿礦物油的泵與貯存器連接，再與微芯片連接。將微芯片1放置在加熱器上，允許血液 最初5秒以200 μ 1/min的流量流動，然后為5 μ 1/min。d)將大約600 μ 1用檸檬酸抗凝固處理的受試體G的血液與6 μ 1 100 μ g/ml膠原 蛋白(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即將貯存器充滿血液。象實(shí)施例Ila中那 樣，將充滿礦物油的泵與貯存器連接，再與微芯片連接。將微芯片1放置在加熱器上，允許 血液最初5秒以200 μ 1/min的流量流動，然后為20 μ 1/min。e)將大約600 μ 1用檸檬酸抗凝固處理的受試體G的血液與6 μ 1 100 μ g/ml膠原 蛋白(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即將貯存器充滿血液。象實(shí)施例Ila中那 樣，將充滿礦物油的泵與貯存器連接，再與微芯片連接。將微芯片1放置在加熱器上，允許 血液最初5秒以200 μ 1/min的流量流動，然后為10 μ 1/min。f)將大約600 μ 1用檸檬酸抗凝固處理的受試體G的血液與6 μ 1 100 μ g/ml膠原 蛋白(Chrono-log Corporation)混合，在其后立即將貯存器充滿血液。象實(shí)施例Ila中那 樣，將充滿礦物油的泵與貯存器連接，再與微芯片連接。將微芯片1放置在加熱器上，允許 血液最初5秒以200 μ 1/min的流量流動，然后為5 μ 1/min。實(shí)施例17)在服用IOOmg阿司匹林后6小時(shí)對受試體G進(jìn)行實(shí)施例16中的實(shí)驗(yàn)a f。
實(shí)施例18)使用在服用IOOmg阿司匹林后6小時(shí)采集的受試體G的血液，按與實(shí)施例16d f相同方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了加入的膠原蛋白量增大為12μ 1或18μ 1。實(shí)施例16 18的結(jié)果示于圖16 21。從這些結(jié)果顯示出，通過將花生四烯酸或膠原蛋白加到檸檬酸處理的血液中并在 測定壓力上升的同時(shí)允許得到的混合物在微芯片中流動，可以分析阿司匹林的抗血小板效 果。此外，如圖19所示，揭示出在服用阿司匹林后采集的血液通過增大加入的膠原蛋白量 也可以引起壓力上升。因此，揭示出本發(fā)明的方法不僅允許評價(jià)阿司匹林效果的有無，而且 允許評價(jià)血小板機(jī)能抑制的程度。因此，基于因成像能力帶來的活化的血小板凝集體的視覺確認(rèn)和壓力上升的組合 診斷，可以更詳細(xì)地掌握患者血小板的狀況。實(shí)施例I9)按與實(shí)施例11 (a)相同方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了使用受試體H的血液。實(shí)施例2O)按與實(shí)施例19相同方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，除了最初5秒以200μ Ι/min的流量、然后以 7 μ 1/min的流量將礦物油從泵209注入貯存器，從而使貯存器內(nèi)的血液以相同流量注入微 芯片1，同時(shí)測量礦物油的流入壓力。實(shí)施例21)按與實(shí)施例19和實(shí)施例20相同方式進(jìn)行測定，除了將分別為Ojyg/ml和 0. 8 μ g/ml的作為針對血小板膜上的受體6 1113/1113的抗體的1^0 1~0伍11 lilly)加到用 水蛭素抗凝固處理的血液中。實(shí)施例22)按與實(shí)施例19和實(shí)施例20相同方式進(jìn)行測定，除了將分別為0. 01 μ g/ml和 0. 1 μ g/ml的作為血小板膜上的受體GPIb的抑制劑的OS-I (Biochemistry. 2008 Apr 22 ； 47(16) :4674-82)加到用水蛭素抗凝固處理的血液中。實(shí)施例19,20和21的結(jié)果示于圖22和圖23。圖22表示在20 μ 1/min的流量下ReoPro的抑制效果，圖23表示在7 μ 1/min的 流量下ReoPro的抑制效果。實(shí)施例22的結(jié)果示于圖M和圖25。圖M表示在20 μ 1/min的流量下OS-I的抑制效果，圖25表示在7 μ 1/min的流 量下OS-I的抑制效果。討論)GPIIb/IIIa主要結(jié)合到纖維蛋白原并涉及到血小板凝集，GPrt是與vWF結(jié)合并涉 及到高剪切應(yīng)力下的血小板粘合反應(yīng)的受體。抑制血小板粘合反應(yīng)的OS-I在高剪切應(yīng)力下表現(xiàn)出強(qiáng)的抗血小板作用，而 ReoPro在低剪切應(yīng)力下表現(xiàn)出相當(dāng)強(qiáng)的抗血小板效果。符號說明A，B血小板監(jiān)測裝置；1，2，3微芯片；
100，200，300第一基板；101，201，301毛細(xì)管；102,202,302流路分割部；103，203，303流路分割壁;104,204，304入口；105，205出口；106，206，306血小板粘合面；107,207貯存器；108攪拌子；109，209泵；110，210笛一.基板；111，211照相機(jī)；112，212出口管；113攪拌器；114，214圖像分析儀；115，215加熱器；305氣孔;307廢液貯存部；308血液吸收材料
權(quán)利要求
1.一種檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，包括使抗凝固處理的血液經(jīng)過在至少內(nèi)表面的一部分 上具有血小板粘合面的毛細(xì)管，并觀察或測定血液在所述毛細(xì)管內(nèi)的行為來檢驗(yàn)血小板機(jī) 能。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗凝固處理是使用檸檬酸、肝素或水蛭素進(jìn)行 的處理。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述血小板粘合面由膠原蛋白涂層制成。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述血小板粘合面由玻璃制成。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗凝固處理的血液經(jīng)受弱血小板 活化處理。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中通過將所述抗凝固處理的血液與未引起不可逆血小 板凝集的量的血小板活化試劑混合來進(jìn)行所述弱血小板活化處理。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述血小板活化試劑是腺苷二磷酸，它與所述抗凝 固處理的血液混合至濃度為0. 001 5 μ Μ。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述血小板活化處理是花生四烯酸，它與所述抗凝 固處理的血液混合至濃度為0. 001 ImM。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述毛細(xì)管內(nèi)部的至少一部分具有包 括流路分割壁的流路分割部，所述流路分割壁沿著在所述毛細(xì)管內(nèi)的血液流動方向延伸并 將所述毛細(xì)管的寬度分割成多個流路。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述流路分割部的各流路的寬度為10 200μ m。
11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述血小板粘合面設(shè)置在所述毛細(xì)管的流路 分割部中。
12.如權(quán)利要求1 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述毛細(xì)管形成在微芯片內(nèi)。
13.如權(quán)利要求1 12中任一項(xiàng)所述的方法，其中利用泵將所述抗凝固處理的血液導(dǎo) 入所述毛細(xì)管內(nèi)，并利用壓力傳感器測量因血液流入所述毛細(xì)管內(nèi)而施加在所述泵上的壓 力，從而檢驗(yàn)血小板機(jī)能。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抗凝固處理的血液保存在與所述毛細(xì)管和所 述泵連接的血液收容部內(nèi)，通過利用所述泵將比重小于血液的液體導(dǎo)入所述血液收容部內(nèi) 而將血液導(dǎo)入所述毛細(xì)管內(nèi)，并測量所述液體的流入壓力，從而間接測量因血液流入所述 毛細(xì)管內(nèi)而施加的壓力。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抗凝固處理的血液保存在與所述毛細(xì)管和所 述泵連接的血液收容部內(nèi)，通過利用所述泵將血小板活化試劑導(dǎo)入所述血液收容部內(nèi)而在 所述血液收容部內(nèi)將抗凝固處理的血液與血小板活化試劑混合，并將與所述血小板活化試 劑混合的血液導(dǎo)入所述毛細(xì)管內(nèi)，同時(shí)測量所述血小板活化試劑的流入壓力，從而間接測 量因血液流入所述毛細(xì)管內(nèi)而施加的壓力。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述血小板活化試劑與所述抗凝固處理的血液混 合使得所述血小板活化試劑在抗凝固處理的血液和血小板活化試劑的混合物中的濃度沿 著線性濃度梯度或階躍濃度梯度增大。
17.如權(quán)利要求15或16所述的方法，其中抗凝固處理的血液和血小板活化試劑的混合 物被攪拌。
18.—種血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，其包括在至少內(nèi)表面的一部分上具有血小板粘合面 的毛細(xì)管；和設(shè)置在所述毛細(xì)管的至少一部分上的流路分割部，所述流路分割部具有流路 分割壁，所述流路分割壁沿著在所述毛細(xì)管內(nèi)的血液流動方向延伸并將所述毛細(xì)管的寬度 分割成多個流路。
19.如權(quán)利要求18所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，其中所述毛細(xì)管形成在微芯片內(nèi)。
20.如權(quán)利要求19所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，其中不少于兩個毛細(xì)管形成在微芯片內(nèi)。
21.如權(quán)利要求20所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，其中所述各毛細(xì)管具有10 150μ m 和50 200 μ m范圍的不少于2種的寬度。
22.如權(quán)利要求18 21中任一項(xiàng)所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，其中所述裝置具有送液泵。
23.如權(quán)利要求19 22中任一項(xiàng)所述的血小板機(jī)能測定裝置，其中所述裝置具有照相 機(jī)，用于拍攝所述微芯片內(nèi)部的圖像。
24.如權(quán)利要求19 23中任一項(xiàng)所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，其中所述裝置具有在所 述微芯片內(nèi)部的血小板粘合面下游的廢液貯存部，所述廢液貯存部用于保存已經(jīng)通過所述 血小板粘合面的血液廢液。
25.如權(quán)利要求M所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，其中所述廢液貯存部的深度不小于 100 μ m0
26.如權(quán)利要求M或25所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，其中在所述廢液貯存部的位置處 設(shè)置貫通至所述微芯片外部的孔。
27.如權(quán)利要求沈所述的血小板機(jī)能檢驗(yàn)裝置，其中在相應(yīng)于所述微芯片的表面上的 孔的位置設(shè)置血液吸收材料。
全文摘要
本發(fā)明公開一種檢驗(yàn)血小板機(jī)能的方法，其中通過使已經(jīng)與弱血小板活化試劑混合的抗凝固處理的血液經(jīng)過在至少內(nèi)表面的一部分上具有血小板粘合面的毛細(xì)管，并觀察或測定血液在所述毛細(xì)管內(nèi)的行為來檢驗(yàn)血小板機(jī)能。
文檔編號G01N33/49GK102150042SQ200980135990
公開日2011年8月10日 申請日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月11日
發(fā)明者寺田真紀(jì), 深澤征司, 細(xì)川和也 申請人:藤森工業(yè)株式會社