專利名稱：用于檢測疾病的血小板生物標志物的制作方法
相關申請的相互參考
本申請在美國的35U.S.C.§119(e)下要求2004年4月26日提交的美國臨時申請系列號60/565,286、2004年8月2日提交的美國臨時申請系列號60/598,387、2004年9月13日提交的美國臨時申請系列號60/609,692、2004年12月3日提交的美國臨時申請系列號60/633,027、和2004年12月6日提交的美國臨時申請系列號60/633,613的優(yōu)先權，在此全文引入這些文獻作為參考。
背景技術：
血管發(fā)生是組織血管化的過程，包括新發(fā)生的血管生長到組織中，并且也稱作新血管化。血管是氧氣和營養(yǎng)物供應到活組織，并且從活組織清除廢物的途徑。合適時，血管發(fā)生是關鍵的生物過程。例如，血管發(fā)生在生殖、發(fā)育和創(chuàng)傷修復方面是關鍵的。相反，不適當?shù)难馨l(fā)生會具有嚴重不良后果。例如，僅僅在實體瘤由于血管發(fā)生而血管化后，腫瘤才具有足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應，使得其迅速生長和轉(zhuǎn)移。血管發(fā)生依賴性疾病是需要或誘導了血管生長的疾病。所述疾病占尋求醫(yī)學治療的所有疾病的顯著部分，并且誘導了炎性病癥，如免疫和非免疫炎癥、慢性關節(jié)風濕和牛皮癬、與不適當或不合適的血管侵入相關的病癥，如糖尿病視網(wǎng)膜病、新血管性青光眼、再狹窄、動脈粥樣硬化斑中的毛細血管增生和骨質(zhì)疏松，以及癌癥相關病癥，如實體瘤、實體瘤轉(zhuǎn)移、血管纖維瘤、晶狀體后纖維增生、血管瘤、卡波西肉瘤等癌癥，其需要新血管化，以支持腫瘤生長。在Folkman最近的綜述中，估計所有40-50歲的女性中超過三分之一具有乳腺原位腫瘤。所述腫瘤在身體中處于靜息狀態(tài)，僅僅在很少數(shù)情況下診斷出乳腺癌。認為男性中存在涉及前列腺癌的相似現(xiàn)象。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，癌癥可能定義為具有兩個不同的階段(1)獲得將正常細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞的突變，和形成原位腫瘤；和(2)轉(zhuǎn)變?yōu)檠馨l(fā)生表型，從而給原位腫瘤提供新血管，支持迅速的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移(Nature，Vol.427，F(xiàn)eb.26，2004，p.787)。需要在血管發(fā)生轉(zhuǎn)變，即在形成原位腫瘤前檢測腫瘤的方法。血管發(fā)生是由影響毛細血管生長速度的不同陽性和陰性效應分子之間的平衡驅(qū)動的。目前已經(jīng)克隆并且已知了多種血管發(fā)生和抗血管發(fā)生因子(Leung et al.，Science.2461306-9，1989；Ueno et al.，Biochem Biophys Acta.138217-22，1998；Miyazono et al.，ProgGrowth Factor Res.3207-17，1991)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板反應蛋白-1(TSP-1)是最充分研究的兩種。VEGF是與TSP-1作用相反的血管發(fā)生因子，TSP-1是作為抗血管發(fā)生因子而起作用的(Tuszynski et al.，Bioessays.1871-6，1996；Dameron，et al；.Science.2651582-4，1994)。由這些作用相反因子的平衡和協(xié)調(diào)表達導致了正常血管生長。通過上調(diào)血管發(fā)生刺激劑或下調(diào)血管發(fā)生抑制劑可以發(fā)生從正常到不受控制的血管生長的轉(zhuǎn)變，表明血管發(fā)生過程受到這些作用相反的力之間的擺動的緊密調(diào)節(jié)(Bouck et al.，Adv Cancer Res.69135-74，1996)。例如，在腫瘤組織中，向血管發(fā)生表型的轉(zhuǎn)變是作為進展到腫瘤表現(xiàn)前的一個不同步驟發(fā)生的，并且與外遺傳或遺傳改變相關(Hanahan et al.，Cell.86353-64，1996)。為了支持該理論，VEGF的mRNA表達在表達活化的ras癌基因的迅速進展的腫瘤細胞系中上調(diào)(Rak et al.，Neoplasia.123-30，1999)。相反，VEGF的轉(zhuǎn)錄在破壞突變的ras等位基因后在這些相同的腫瘤細胞中下調(diào)，由此消除了VEGF表達，并且使得細胞不能在體內(nèi)形成腫瘤(Stiegler et al.，J Cell Physiol.179233-6，1999)。向血管發(fā)生表型的轉(zhuǎn)變也與腫瘤阻抑物基因p53的滅活相關(Holmgren et al.，Oncogene.17819-24，1998)。相反，p16缺失的細胞系在恢復野生型細胞周期蛋白依賴性激酶(cdk)抑制劑p16后恢復到抗血管發(fā)生表型(Harada et al.，Cancer Research.593783-3789，1999)。大多數(shù)癌癥是用諸如MRIs、生物標志物如PSA、乳腺X線照像術、觸診和組織活檢的技術檢測的。采用這些方法，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)癌癥是在相當程度發(fā)展或轉(zhuǎn)移后才發(fā)現(xiàn)的。因此，通常錯過了任何早期治愈的機會。這部分是由于常規(guī)診斷方法的低準確性以及需要昂貴的設備，如NMRS、體層X線照像術等，這對患者是經(jīng)濟負擔。此外，患者必須住院接受準確測定，如組織活檢。因此，常規(guī)診斷方法對于癌癥的早期診斷不是最佳的，前述技術都不能作為早期檢測癌癥的迅速或簡便的程序。認為血管發(fā)生過程是以內(nèi)皮細胞(EC)分泌，由諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、白介素-8(IL-8)、胎盤樣生長因子(PLGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和其它的有絲分裂原活化的蛋白酶對基底膜的降解開始的。細胞遷移并增殖，導致在基質(zhì)間隙中形成實體內(nèi)皮細胞芽，然后，形成血管環(huán)，隨著緊密連接的形成和新基底膜的沉積發(fā)生毛細血管。血管發(fā)生也可涉及血管發(fā)生阻抑蛋白，如血小板反應蛋白的下調(diào)。血管發(fā)生生長因子的治療暗示首先在30多年前由Folkman及其同事描述(Folkman，N.Engl.J.Med.，2851182-1186(1971)。當身體喪失對血管發(fā)生的至少一些控制時，發(fā)生異常血管發(fā)生，導致過量或不足的血管生長。例如，諸如潰瘍、卒中和突發(fā)心臟事件的狀況可能由于缺乏血管發(fā)生導致的，所述血管發(fā)生是自然愈合正常需要的。相反，過量的血管增殖會導致腫瘤生長、腫瘤傳播、早發(fā)性或糖尿病視網(wǎng)膜病、牛皮癬和類風濕關節(jié)炎。血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑具有非常短的半衰期，例如，天然VEGF在血漿中的半衰期是大約3分鐘。因此，目前用于測量血管發(fā)生生長因子水平以檢測所述調(diào)節(jié)劑的方法沒有提供血管發(fā)生活性的可靠指示。用于早期檢測癌癥和其它血管發(fā)生疾病和病癥的方法是高度需要的。
發(fā)明概述
本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，血小板能螯合血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑，并且防止它們降解。因此，通過分析血小板中的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑，目前可以檢測血管發(fā)生活性。通過監(jiān)測血管發(fā)生活性的改變，可以預測癌癥或其它血管發(fā)生疾病或病癥的存在。因此，本發(fā)明提供了用于檢測個體中的癌癥的新方法。優(yōu)選地，早期檢測癌癥。在一種優(yōu)選實施方案中，在第一時間點從個體(患者)分離血小板。分析血小板，得到至少一種血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的水平。血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑可以是血管發(fā)生的正或負調(diào)節(jié)劑。在第二，即后面的時間點，從患者分離血小板，分析血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的水平。隨后，將來自第一樣品的血小板的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平與來自第二樣品的血小板的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平進行比較。與第一樣品中的血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平相比，來自第二樣品的血小板中至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平增加，表明癌癥或其它血管發(fā)生疾病或病癥?；蛘?，與第一樣品中的血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平相比，來自第二樣品的血小板中至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平減少，表明癌癥或其它血管發(fā)生疾病或病癥。在一種優(yōu)選實施方案中，從血液樣品分離血小板。優(yōu)選地，測量一種以上血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑。血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑包括，但不限于VEGF-A(VPC)、VEGF-C、bFGF、HGF、促血管生成素(angiopoietin)-1、PDGF、EGF、IGF-1、IGF BP-3、BDNF、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、玻連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、乙酰肝素酶(heparanase)和鞘氨醇-1PO4。血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑包括，但不限于，PF-4、血小板反應蛋白-1和2、HGF的NK1、NK2、NK3片段、TGF-β-1、纖維蛋白原(制管張素)、纖維蛋白原激活劑抑制劑1、α-2抗纖溶酶及其片段、α-2巨球蛋白、金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMPs)、β-血小板球蛋白、內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素(tumstatin)、BDNF(腦來源的神經(jīng)生長因子)和可溶性VEGFR2。用于分析血管發(fā)生的正調(diào)節(jié)劑或負調(diào)節(jié)劑的方法包括，例如，蛋白陣列、ELISA、蛋白印跡、表面增強激光解吸電離譜或質(zhì)譜。在一種實施方案中，個體具有癌癥的遺傳傾向。該傾向可以是腫瘤阻抑物基因中的突變。腫瘤阻抑物基因可以包括，例如，BRCA1、BRCA2、p53、p10、LKB1、MSH2和WT1。在另一種實施方案中，個體以前進行過癌癥治療?；蛘?，認為患者是健康無病的個體。在一種優(yōu)選實施方案中，在第二個時間點進行的血液分離發(fā)生在第一次分離后至少1個月。但是，第二個時間點可以是第一次分離后2個月、6個月、10個月、或1年以上。要用本發(fā)明的方法檢測和治療的癌癥包括，但不限于，胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系統(tǒng)癌、膀胱癌、成血管細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在本發(fā)明的一種實施方案中，描述了治療患有血管發(fā)生疾病或病癥，如癌癥的患者的方法。在所述方法中，在第一時間點從個體分離第一血小板樣品，并且分析至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或負調(diào)節(jié)劑的水平。從個體獲得在后面的時間點分離的第二血小板樣品，分析至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或負調(diào)節(jié)劑的水平。隨后，將來自第一血小板樣品的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平與來自第二血小板樣品的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平進行比較。與第一樣品中的水平相比，第二樣品中血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的水平改變，表明存在血管發(fā)生疾病或病癥。診斷后，施用治療。優(yōu)選血管發(fā)生治療。本發(fā)明的方法可以用于監(jiān)測治療過程。采用該方法，不必診斷確切的疾病或病癥。所有的要求是以表明治療起作用的方式改變血小板譜。如果發(fā)現(xiàn)特定治療無效，可以改變該治療，以提供更有效的治療。優(yōu)選地，抗癌治療包括施用血管發(fā)生抑制劑?；蛘?，可以用化療、放療或如果大到能夠檢測，可以手術切除腫瘤。在另一實施方案中，給患者施用上述抗癌治療的組合?？梢杂醚“逅瓦f抗血管發(fā)生治療。本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)血小板可以螯合各種血管發(fā)生因子，并且防止其降解。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，血小板在生理合適的位置，例如，腫瘤上選擇性釋放它們的加載物。因此，一旦被診斷，可以給血小板加載抗癌化合物，并且送遞到需要其的患者。在這樣的方法中，將化合物選擇性送遞到需要治療的位點，即，腫瘤。公知的血管發(fā)生抑制劑包括但不限于直接血管發(fā)生抑制劑、制管張素、Bevacizumab(Avastin)、美替克侖、Canstatin、Caplostatin、Combretastatin、內(nèi)皮抑制素、NM-3、血小板反應蛋白、腫瘤抑制素、2-甲氧基雌二醇和Vitaxin；和間接血管發(fā)生抑制劑ZD1839(Iressa)、ZD6474、OSI774(Tarceva)、CI1033、PKI1666、IMC225(Erbitux)、PTK787、SU6668、SU11248、Herceptin和IFN-α。CELEBREX(塞來昔布)、THALOMID(沙立度胺)和IFN-α也被認為是血管發(fā)生抑制劑(Kerbel et al.，Nature Reviews，Vol.2，October 2002，pp.727。本發(fā)明也包括用“有節(jié)奏的”化療治療血管發(fā)生疾病/病癥。有節(jié)奏的化療包括施用低劑量的化療劑，參見Folkman，APIS1122004。診斷后，本發(fā)明的方法使得能夠評估采用的治療。治療后，該方法可用于復發(fā)的早期診斷。本發(fā)明的方法也可以用于血管發(fā)生疾病或病癥，包括，例如視網(wǎng)膜病、糖尿病視網(wǎng)膜病或黃斑變性的早期診斷。此外，本發(fā)明的方法可以用于早期檢測和治療慢性炎性病癥，包括，pyresis、疼痛、骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、偏頭痛、神經(jīng)退化性疾病(如多發(fā)性硬化)、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松、哮喘、狼瘡和牛皮癬。在本發(fā)明的另一種實施方案中，建立了與特定血管發(fā)生疾病或病癥，如癌癥相應的血小板譜。該血小板譜也稱作標準物或記錄。在這樣的實施方案中，分離來自個體的血小板樣品，并且分析特定血管發(fā)生因子的存在與否。通過比較該譜與標準物而進行診斷。例如，對于脂肪肉瘤的診斷，通過分析患有診斷的脂肪肉瘤的患者而建立血管發(fā)生因子譜標準物。采用該標準物進行比較，可以分析來自個體的血小板樣品。如果個體(測試)樣品與標準物相關，則進行陽性診斷。同樣，可以將這類診斷用于任何數(shù)目的癌癥、血管發(fā)生疾病和病癥、炎性疾病或病癥，或血管異常。此外，本發(fā)明提供了監(jiān)測抗血管發(fā)生治療的有效性，或檢測化合物在調(diào)節(jié)宿主中血小板血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平中的有效性的方法。在該實施方案中，在第一時間點獲得來自個體(宿主或宿主動物)的血小板，并且篩選血管發(fā)生正或負調(diào)節(jié)劑的存在與否。建立血小板譜(或記錄)。然后給個體(或宿主)施用血管發(fā)生治療(或測試化合物)。在第二，即后面的時間點，獲得來自相同個體(或宿主)的血小板，并且篩選血管發(fā)生正和負調(diào)節(jié)劑的存在與否。獲得第二血小板譜(或記錄)。通過比較第一和第二血小板譜而確定血管發(fā)生治療(或測試化合物)的有效性。與第一樣品相比，第二樣品中血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平減少，表明是有效的抗血管發(fā)生治療。同樣，與第一樣品相比，第二樣品中血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平增加，表明是有效的抗血管發(fā)生治療。該實施方案允許相對容易和快速地分析多種治療的有效性和篩選測試化合物的有效性的方法。如果發(fā)現(xiàn)特定治療無效，則可以改變治療，以提供更有效的治療。宿主動物包括哺乳動物，如小鼠和大鼠。在該實施方案中，可以在開始施用抗血管發(fā)生治療后的任何時間獲得個體(或宿主)的第二血小板樣品。例如，可以在開始治療后約1周-約1個月獲得第二血小板樣品。或者，可以在治療開始后2個月、3個月、6個月或最多到1年獲得第二樣品。本發(fā)明的該實施方案和其它實施方案也包括在兩個以上的時間點進行分析。例如，可以在抗血管發(fā)生治療的一些時間點分析血小板。以此方式，可以隨時間分析抗血管發(fā)生治療的有效性，并且可以分析治療方案的改變。血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑(正和負)是本領域公知的，但也可以是未鑒定的蛋白或沒有鑒定為“血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑”的已知蛋白。這樣，本發(fā)明的方法可以鑒定已知或未知蛋白作為血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑。血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑也可以在本文中稱作生物標志物，并且將在下文詳細描述。本發(fā)明的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑包括蛋白、蛋白片段，如裂解的蛋白，和融合蛋白，如bcr-ab1。


用內(nèi)皮抑制素對人血小板進行體外加載。將富含血小板的血漿(PRP)與濃度增加的內(nèi)皮抑制素一起溫育1小時，然后分離血小板，洗滌并且裂解，以獲得純蛋白提取物，然后進行SDS-PAGE。采用抗人內(nèi)皮抑制素、抗人VEGF和抗人bFGF進行的標準蛋白印跡發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮抑制素的增加與VEGF和bFGF的細胞內(nèi)含量的減少呈負相關。
圖2通過SDS-PAGE檢測的血小板蛋白的體外選擇性替代。內(nèi)皮抑制素在預先加載了VEGF的血小板中攝取與內(nèi)皮抑制素預先加載的對照相比不僅僅是完全的、沒有阻礙的和增強的(圖2的第1道)，也導致預先加載的VEGF的完全替代(圖2的第2道)。相反，在相反的實驗中，即將VEGF加載到用內(nèi)皮抑制素預先加載的血小板中，導致內(nèi)皮抑制素的較不完全的替代。
圖3圖3表明肝、Matrigel、脾、腎、血漿和血小板級分中每克組織中的計數(shù)(×105)。碘化的VEGF在血小板中濃集為超過其在血漿中濃度的很多倍。
圖4圖4顯示來自對照、非血管發(fā)生和血管發(fā)生樣品的血小板和血漿中PF4(圖4A)、PDGF(圖4B)和VEGF(圖4C)的譜。結果表明了血小板樣品中PF4、PDGF和VEGF的濃度。
圖5圖5顯示來自攜帶脂肪肉瘤的小鼠的血小板和血漿中bFGF(圖5A)、VEGF(圖5B)、PDGF(圖5C)和ES(圖5D)的譜。
圖6示出了用免疫熒光檢測的血小板活化前、活化期間和活化后VEGF的細胞內(nèi)分布。在靜息的血小板中，大多數(shù)VEGF定位于血小板的細胞內(nèi)、細胞質(zhì)部分(圖6)，沿著細胞膜移動到VEGF的環(huán)形排列(圖6D插圖)，然后沿著活化的血小板的偽足(圖6D)?；罨T導的血小板胞吐作用的模式更加表明血小板的細胞內(nèi)容物與組織的直接交換，而不是常規(guī)采用的血小板的細胞內(nèi)容物“釋放”到循環(huán)中。
圖7靜息和活化的血小板中的VEGF定位。用固定和透化的靜息血小板的雙標記免疫熒光顯微術確定VEGF的細胞內(nèi)定位。微管蛋白在靜息血小板中的邊緣微管帶中濃集，該結構限定了血小板的外周(圖7A)?？筕EGF抗體一致地用在血小板細胞質(zhì)中分布的具點的、小泡樣結構標記(圖7B)。用熒光標記的毒傘素和VEGF進行的活化的血小板的雙染色發(fā)現(xiàn)VEGF與血小板的持續(xù)相關，甚至在活化時也是如此(圖7F)。與活化一致的血小板形狀改變由板足(lamelipodia)和絲足的形成明確表現(xiàn)出來。發(fā)現(xiàn)VEGF在活化的、伸展的血小板中是具點的模式，但更多的VEGF沿著絲足和沿著板足外周定位，而不是保留在細胞質(zhì)中。
圖8顯示VEGF在血小板中的細胞內(nèi)分布。圖8A血小板被毒傘素染色。圖8B血小板被抗VEGF染色。圖8C層疊圖。
圖9顯示血小板(右側(cè))與巨核細胞(左側(cè))的相互作用。由免疫熒光顯示VEGF的細胞內(nèi)分布。
圖10顯示血小板和巨核細胞中VEGF(圖10A)、vWF(圖10B)的細胞內(nèi)分布和層疊圖(圖10C)。
圖11顯示血小板內(nèi)的血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑和負調(diào)節(jié)劑。
圖12顯示小鼠中matrigel(50ng125IVEGF)的放置。
圖13顯示血管化的人腫瘤、非血管發(fā)生性靜息細胞和血管發(fā)生性生長細胞的示意圖。
顯示裸鼠中非血管發(fā)生與血管發(fā)生性人脂肪肉瘤。通過133天時的熒光酶發(fā)光而分析血管發(fā)生。
圖15顯示用SELDI-TOF進行血小板和血漿蛋白表達的程序。
圖16顯示腫瘤植入后30天，來自攜帶非血管發(fā)生和血管發(fā)生性人脂肪肉瘤的SCID小鼠的血小板和血漿提取物的蛋白表達圖。標出了VEGF。
圖17顯示了腫瘤植入后30天，來自攜帶非血管發(fā)生和血管發(fā)生性人脂肪肉瘤的SCID小鼠的血小板和血漿提取物的蛋白表達圖。標出了PF-4。
圖18顯示了腫瘤植入后30天，來自攜帶非血管發(fā)生和血管發(fā)生性人脂肪肉瘤的SCID小鼠的血小板和血漿提取物的蛋白表達圖。標出了PDGF。
圖19顯示了攜帶腫瘤的小鼠的血小板中bFGF的螯合的時程。僅僅包含了1820道爾頓的分子量。
圖20顯示了從對照動物(灰線)和植入了靜息腫瘤的動物(黑線)取出的血小板提取物的質(zhì)量分光光度表達圖。x軸上的數(shù)字表示觀察到的顆粒的質(zhì)量與電荷之比(m/z)，曲線的高度相應于觀察到的峰的強度。如實施例的描述，采用的提取物是從初始的陰離子交換分級分離的級份2獲得的。在WCX2ProteinChip陣列上分析來自該級份的樣品。鑒定出CTAPIII和PF4在攜帶腫瘤的小鼠中是上調(diào)的。圖20b顯示CTAPIII和PF4(箭頭)在攜帶靜息和血管發(fā)生腫瘤的小鼠的血小板中是上調(diào)的，但在血漿中沒有上調(diào)。
圖21a顯示了分別在取自三組小鼠的血小板的提取物中測量的歸一化CTAPIII峰強度的曲線圖，所述三組小鼠是對照、攜帶靜息(非血管發(fā)生)性人脂肪肉瘤和攜帶血管發(fā)生性人脂肪肉瘤小鼠。圖21B顯示了分別在取自三組小鼠的血漿的提取物中測量的歸一化CTAPIII峰強度的曲線圖，所述三組小鼠是對照、攜帶靜息(非血管發(fā)生)性人脂肪肉瘤和攜帶血管發(fā)生性人脂肪肉瘤小鼠。
圖21C顯示了與21A和21B相同組的小鼠的血小板中歸一化的PF4峰強度的曲線圖。圖21D顯示了與21A、21B和21C相同組的小鼠的血漿中歸一化的PF4峰強度的曲線圖。
圖22A顯示了生長的第19天、32天和120天時攜帶腫瘤的小鼠的血小板中歸一化的CTAPIII峰強度的曲線圖，表明血小板CTAPIII水平在研究的時程中增加，而圖22B顯示血漿CTAPIII水平在相同時間段中減少，或沒有改變。
圖22C顯示了生長的第19天、32天和120天時攜帶腫瘤的小鼠的血小板中歸一化的PF4峰強度的曲線圖，明血小板PF4水平在研究的時程中增加，而圖22D顯示血漿PF4水平在相同時間段中減少，或沒有改變。圖22中示出了每組的峰強度的中值±標準誤。
圖23a顯示了用抗堿性成纖維細胞生長因子(抗bFGF)抗體得到的血小板和血漿提取物的抗體相互作用發(fā)現(xiàn)圖。具體地，該圖顯示了攜帶靜息(非血管發(fā)生)腫瘤的小鼠的血小板中bFGF及其片段是上調(diào)的。
圖23b顯示了使得能夠比較血小板與血漿提取物中改變的表達水平的表達圖，還顯示了攜帶非血管發(fā)生和血管發(fā)生腫瘤的小鼠中表達的差異。
圖24顯示了用抗血小板來源的生長因子(抗PDGF)抗體得到的血小板提取物的抗體相互作用發(fā)現(xiàn)圖。該圖顯示了攜帶靜息腫瘤的小鼠的血小板中PDGF及其片段的上調(diào)(植入后30天)。
圖25顯示了在陰離子交換柱上進行血小板提取物的分級分離，然后在WCX2ProteinChip陣列上對這些級份之一(級份1)進行譜分析后觀察到的生物標志物的表達圖。該圖顯示了與來自對照小鼠(灰色)的血小板提取物相比，一些標志物，包括20400Da的蛋白在取自攜帶腫瘤的小鼠(黑色)的血小板中上調(diào)。
圖26顯示了在陰離子交換柱上進行血小板提取物的分級分離，然后在WCX2ProteinChip陣列上對這些級份之一(級份1)進行譜分析后觀察到的生物標志物的表達圖。該圖表示鑒定了一些標志物在攜帶靜息腫瘤的小鼠(黑色)中相對于在對照小鼠(灰色)得到了上調(diào)。
圖27從ADP或凝血酶活化的血小板釋放生長因子。用可商購ELISA的分析暴露于濃度增加的內(nèi)皮抑制素的PRP的血漿部分中的VEGF和bFGF。用內(nèi)皮抑制素對血小板進行的簡單加載不將VEGF或bFGF釋放到上清液(血漿)中，由經(jīng)典的脫顆粒劑，如凝血酶或ADP進行的這些因子的釋放是高度選擇性的。一些(但不是全部)VEGF是由凝血酶(而不是ADP)活化的血小板釋放的。這兩種試劑都不能將bFGF從血小板釋放出來。
圖28血小板進行的選擇性VEGF蛋白攝取。用放射性碘標記VEGF蛋白，將100μlMatrigel中的大約50ng125I標記的VEGF皮下植入C57BLK/6小鼠的左側(cè)脅腹中。3天后，處死小鼠，通過末梢取血采集檸檬酸化的血液。在γ計數(shù)器上對每個組織樣品的放射性進行定量，校正數(shù)值的組織重量差異，表示為每克組織每分鐘的計數(shù)[cpm/g組織]。在兩個分開的場合重復該實驗，每個實驗5只小鼠，該圖代表平均值±標準誤。
圖29A-H攜帶腫瘤的小鼠的血小板蛋白譜的代表性分析。在凝膠上展示來自健康小鼠(“對照”)、攜帶非血管發(fā)生性靜息腫瘤異種移植物的小鼠(“非血管發(fā)生”)和攜帶血管發(fā)生性腫瘤異種移植物的小鼠(“血管發(fā)生”)的譜。檢測了幾種肽的差別表達模式。例如，在血小板裂解物的基本級分中，在8200Da鑒定了一個條帶，隨后通過免疫耗竭證實是血小板因子-4(PF-4)。橫坐標從m/z值計算的相對MW，縱坐標通過免疫耗竭或免疫沉淀證實的鑒定的肽。帶強度與蛋白的相對表達譜相關。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及對癌癥和血管發(fā)生疾病和病癥進行早期檢測、診斷和治療的方法。具體地，用分離靜息血小板的標準實驗室程序(Fujimura H，Thrombos Haemost 2002，87(4)728-34)在第一時間點從患者分離血小板。分析血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平。在第二，即后面的時間點，從個體分離血小板，分析至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平。隨后，將來自第一樣品的血小板的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平與來自第二樣品的血小板的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平進行比較。與第一樣品中的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的水平相比，來自第二樣品的血小板中血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的水平改變，表明血管發(fā)生疾病或病癥，如癌癥的存在。
具體地，與第一樣品中的血管發(fā)生正和/或負調(diào)節(jié)劑的水平相比，來自第二樣品的血小板中至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平增加或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平減少，表明血管發(fā)生疾病或病癥，如癌癥的存在。
本發(fā)明的血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑包括，但不限于VEGF-A(VPC)、VEGF-C、bFGF、HGF、促血管生成素-1、PDGF、EGF、IGF-1、IGFBP-3、BDNF、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、玻連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、乙酰肝素酶(heparanase)和鞘氨醇-1PO4。
本發(fā)明要分析的血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑包括，但不限于，PF-4、血小板反應蛋白-1和2、HGF的NK1、NK2、NK3片段、TGF-β-1、纖維蛋白原(制管張素)、纖維蛋白原激活劑抑制劑1、α-2抗纖溶酶及其片段、α-2巨球蛋白、金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMPs)、β-血小板球蛋白、內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素和可溶性VEGFR2。
除了已知的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明也包括常規(guī)沒有分類為血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑，但也存在于血小板中的蛋白、蛋白片段和融合蛋白。本發(fā)明的方法提供了所述蛋白的發(fā)現(xiàn)。
典型地在早期檢測由本發(fā)明的方法檢測的癌癥。例如，腫瘤大小在毫米范圍。所述腫瘤采用腫瘤檢測的常規(guī)方法很難檢測，所述方法如MRI、觸診、乳腺X線照像術等。要檢測的癌癥的實例包括，但不限于，胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系統(tǒng)癌和膀胱癌。
具體地，可以通過本發(fā)明的方法鑒定和測量包含在分離自個體的血液的血小板中的血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑和負調(diào)節(jié)劑，所述個體被認為是健康和無病的，或所述個體傾向于患癌癥、患有癌癥或以前進行過癌癥治療。
分離血小板的方法是本領域技術人員公知的，并且描述于″Current Protocols in Immunology by F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，K.Struhl and V.B.Chanda(Editors)，John Wiley & Sons，2004.″，在此引入該文獻作為參考。例如，將全血從供體收集到含有檸檬酸鈉或其它抗凝劑的真空容器中。然后，在低轉(zhuǎn)速下離心全血，以便在第一階段中使富含血小板的血漿與其它成分分離。在該程序的第二階段，將富含血小板的血漿分離到新的試管中，通過以較高的速度離心血小板而獲得血小板濃縮物。然后將血小板濃縮物重懸于標準裂解緩沖液中，分離相關的蛋白。
從細胞，包括血小板中分離蛋白的方法是本領域技術人員公知的，并且描述于″Current Protocols in Immunology，F(xiàn).M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，K.Struhl and V.B.Chanda(Editors)，John Wiley & Sons，2004.″，在此引入作為參考。在描述于在此引入作為參考的WO02/077176的一個實例中，該程序通常包括采用非常小體積的獨特緩沖液，以一個溶解步驟提取蛋白。該程序的結果是得到完整蛋白，基本無交叉污染。分離的蛋白保持活性，使得能夠通過多種測定進行分析。
蛋白分離步驟的緩沖液可以包括一種或多種緩沖液成分、鹽、去污劑、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。具體地，用于提取要通過免疫組織化學分析的蛋白的一種有效緩沖液包括緩沖液Tris-HCl、NaCl、去污劑Nonidet(g)P-40、EDTA和焦磷酸鈉、蛋白酶抑制劑-牛胰蛋白酶抑制劑和亮抑蛋白酶肽，以及磷酸酶抑制劑脫氧膽酸鈉、原釩酸鈉和4-2氨基乙基苯磺酰氟(AEBSF)?？梢允褂玫牧硪环N鹽是LiCl，而甘油是可以加入級分緩沖液中的合適乳化劑。另一種任選的蛋白酶抑制劑包括大豆胰蛋白酶抑制劑和胃蛋白酶抑制劑。其它合適的磷酸酶抑制劑包括苯基甲基磺酰氯、鉬酸鈉、氟化鈉和β磷酸甘油酯。
對于二維凝膠分析，用1％SDS進行簡單裂解是有效的，而采用SELDI程序進行的最終分析需要溶于標準PBS堿中的Triton-X-100；即一種去污劑(Sigma，St.Louis，MO)、MEGA109(ICN，Aurora，OH)和辛基B-吡喃葡糖苷(ESA，Chelmsford，MA)。在二維凝膠分析前采用的另一種緩沖液是7M脲、2M硫脲、CHAPS、MEGA 10、辛基B-吡喃葡糖苷、Tris、DTT、三丁基膦和Pharmalytes。
一旦溶解了蛋白，可以將多種不同的免疫或生化分析用于表征分離的蛋白。通過ELISA和蛋白印跡進行分析的方法是本領域技術人員公知的，并且進一步描述于″Current Protocols in MolecularBiology，F(xiàn).M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，K.Struhl and V.B.Chanda(Editors)，John Wiley & Sons，2004″，在此引入該文獻作為參考。進行質(zhì)譜法的方法是本領域技術人員公知的，并且進一步描述于Methods of Enzymology，Vol.193″MassSpectrometry″(J.A.McCloskey，editor)，1990，Academic Press，NewYork。
可以進行的一種類型的測定是可溶性免疫測定，其中使用了目的蛋白的特異性抗體?？梢杂枚喾N標記物對抗體進行標記，例如化學發(fā)光、熒光或放射性標記物。為了得到最佳結果，可以采用高靈敏度測定，如微粒酶免疫測定(MEIA)。通過應用用于估計血清中免疫檢測的分子的校準曲線，可以估計每個細胞的分子數(shù)目。因此，目前描述的方法提供了定量免疫測定，其可以體內(nèi)測量目的蛋白分子的實際數(shù)目。
可以用于分析提取的蛋白的第二類測定是二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)。通過對第一時間點提取的蛋白和第二時間點提取的蛋白進行電泳，并且比較印跡，可以觀察到差異蛋白表達。具體地，通過將染色的凝膠掃描到計算機中，并且采用圖像比較軟件，可以確定存在于一種細胞類型而不存在另一種細胞類型(反之亦然)的蛋白的位置。此外，可以從凝膠中蛋白存在的位置分離這些改變的蛋白，并且如果序列存在于數(shù)據(jù)庫中，可以用質(zhì)譜MS-MS測序鑒定蛋白。以此方式，可以更完全地理解第一和第二時間點之間的蛋白差異。
在一種優(yōu)選實施方案中，用表面增強激光解吸電離譜技術或SELDI(Ciphergen Biosystems Inc.，Palo Alto，CA)進行分析。
該方法可以分離不能由二維凝膠分析分開聚焦的蛋白，特別是非常堿性、非常小(＜7000道爾頓)或在細胞中以低或中等水平表達的蛋白。SELDI也比凝膠分析更快地分離蛋白。SELDI利用“蛋白芯片“，使得能夠從粗樣品中以毫微微摩爾水平解吸和檢測完整蛋白。將目的蛋白直接施加到鋁支持物上排列為8-24個預定區(qū)域的蛋白芯片的確定的小表面積上。這些表面包被了確定的化學“誘餌”基質(zhì)，其包含標準色譜支持物，如疏水、陽離子或陰離子或生化誘餌分子，如純化的蛋白配體、受體、抗體或DNA寡核苷酸(參見Strauss，Science2821406，1998)。在血小板收集的樣品中，將溶解的蛋白施加到SELDI芯片的表面。蛋白與表面的結合依賴于采用的誘餌表面的性質(zhì)和洗滌條件。然后通過激光解吸和電離，以及隨后從靈敏的分子量檢測器產(chǎn)生的飛行時間(TOF)質(zhì)量分析，對結合的蛋白的混合物進行表征。這些數(shù)據(jù)產(chǎn)生了樣品的蛋白指紋，SELDI具有1000-300,000道爾頓的實際分辨和檢測工作范圍，這取決于利用的能量吸收分子和采用的誘餌表面/洗滌條件。
本發(fā)明包括給患者施用有效量的具有抗血管發(fā)生活性的抗癌治療。抗癌治療可以包括，例如，施用血管發(fā)生抑制劑。血管發(fā)生抑制劑的施用可以通過本領域技術人員公知的常規(guī)方法或通過本發(fā)明的方法，例如給血小板(患者或匹配的供體)加載血管發(fā)生抑制劑并且將這些加載的血小板施用給有需要的個體。通過抑制血管發(fā)生，可以干預疾病、緩解癥狀，并且在某些情況下治愈疾病。或者，抗癌治療可以包括給患者施用化療或放療。最后，抗癌治療可以包括手術切除腫瘤。該治療可以包含上述治療的組合。
本發(fā)明也涉及用于對血管發(fā)生疾病或病癥進行早期檢測、診斷和治療性處理的方法。
認為血管發(fā)生在多種疾病或病癥中是重要的，所述疾病或病癥稱作血管發(fā)生疾病或病癥。這里用到的術語血管發(fā)生疾病或病癥或狀況的特征在于異?；蛴泻?如刺激或抑制)的血管化或由異常或有害的血管化導致。異?；蛴泻Φ难馨l(fā)生可能直接導致特定疾病，或加重存在的病理狀況。血管發(fā)生疾病的實例包括眼病，如糖尿病視網(wǎng)膜病、黃斑變性、新血管性青光眼、早發(fā)性視網(wǎng)膜病、角膜移植物排斥、晶狀體后纖維瘤、虹膜發(fā)紅、由于干擾導致的視網(wǎng)膜新血管化、眼腫瘤和沙眼，以及眼的其它異常新血管化狀況，其中新血管化可能導致失明。
本發(fā)明包括的其它血管發(fā)生疾病或病癥包括但不限于贅生性疾病，如腫瘤，包括膀胱、腦、乳腺、宮頸、結腸、直腸、腎、肺、卵巢、胰腺、前列腺、胃和子宮、腫瘤轉(zhuǎn)移、良性腫瘤，如血管瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、沙眼；和膿性肉芽腫、增生，如心肌肥厚、炎性狀況，如免疫和非免疫炎癥、慢性關節(jié)風濕和牛皮癬、與不適當或不合適的血管侵入相關的病癥，如再狹窄、動脈粥樣硬化斑中的毛細血管增生和骨質(zhì)疏松，以及癌癥相關病癥，如實體瘤、實體瘤轉(zhuǎn)移、血管纖維瘤、晶狀體后纖維增生、血管瘤、卡波西肉瘤等癌癥，其需要新血管化以支持腫瘤生長。也包括淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，如慢性和急性淋巴細胞白細胞和淋巴瘤。在本發(fā)明的一種優(yōu)實施方案中，該方法涉及抑制患有癌癥的哺乳動物中的血管發(fā)生。
在本發(fā)明的很多實施方案中檢測的患者理想地是人類患者，但應該理解，本發(fā)明的原理表明，本發(fā)明對于所有的哺乳動物都是有效的，它們意欲包括在術語“患者”中。在該上下文中，哺乳動物應理解為包括任何哺乳動物物種。
在一種替代的實施方案中，本發(fā)明的方法可以用于刺激有需要的患者中的血管發(fā)生。已經(jīng)建議將血小板用于多種疾病治療中的藥物送遞用途，如1998年6月2日授權的美國專利No.5,759,542中的討論。該專利公開了制備由包含結合于血小板外膜的尿激酶型纖溶酶原激活劑的A鏈的融合藥物形成的復合物的制備。因此，根據(jù)本發(fā)明，血小板可以被分離，并且用血管發(fā)生刺激因子締合(“加載”)。因此，可以認為“加載的”血小板被送遞到需要血管化的位點。
本發(fā)明的方法可以用于增加有需要的患者中的血管化。因此，本發(fā)明的方法可以用于治療從血液循環(huán)增加中獲益的疾病或狀況，用于提供用于移植的血管化位點，用于增強傷口愈合，用于減少瘢痕組織形成，即，在損傷或手術后，用于可能從特定位點的免疫應答的定向抑制獲益的狀況等。
包括了從血流增加獲益的任何狀況，例如，壞疽、糖尿病、循環(huán)不良、動脈硬化、動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、主動脈瘤、下肢的動脈疾病、腦血管疾病等。以此方式，本發(fā)明的方法可以用于給血小板預先加載血管發(fā)生刺激劑并且將其輸入患者，從而促進血管化，由此治療外周血管病。同樣，該方法可以用于治療患病或缺氧的心臟，特別是當通向心臟的血管堵塞時。具有動脈硬化的其它器官可以從該方法獲益。同樣，可以通過更高的血管化而增強功能的器官可以通過施用預先加載了血管發(fā)生刺激劑的血小板而得到改進。這包括需要改進功能的腎臟或其它器官。以相同的方式，動脈硬化的其它靶包括缺血性腸病、腦血管病、基于血管的陽痿，等。此外，心臟中新血管的形成在保護心肌免受冠狀動脈阻塞的后果方面是非常重要的。給具有缺血心肌的患者施用加載過的血小板，可以增強側(cè)枝的發(fā)育，促進壞死組織的愈合，并且防止梗塞擴展和心臟擴大。
由于血小板在與腫瘤相關的新形成的血管中循環(huán)，它們能夠以定位的方式送遞抗有絲分裂藥物，同樣，在腫瘤的新血管中循環(huán)的血小板可以沉積抗血管發(fā)生藥物，以阻斷腫瘤的血液供應。血小板加載了選定的藥物，如內(nèi)皮抑制素，替代了促血管發(fā)生因子，如VEGF或bFGF。根據(jù)本發(fā)明，可以制備加載了抗血管發(fā)生因子的血小板，并且輸入患者，用于治療應用。加載了藥物的血小板特別適于血液攜帶的藥物送遞，例如選定的藥物導向于血小板介導的形成中的血栓或血管損傷部位。如此加載的血小板對至少一種激動劑，特別是對凝血酶具有正常反應。由于腫瘤表現(xiàn)出血小板刺激物如組織因子或凝血酶的上調(diào)，“預先加載”了血管發(fā)生抑制劑的血小板可以直接送遞到腫瘤部位。
本發(fā)明的方法中也包括了用已知從血小板釋放血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的試劑(下文稱作“釋放劑”)和在其它實施方案中用已知阻抑血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑釋放的試劑(下文稱作“阻抑劑”)對這些“預先加載的”血小板在特定時間和/或在特定組織中的控制的釋放。
在一種實施方案中，釋放劑是蛋白酶活化的受體(PAR)激動劑。在一種優(yōu)選實施方案中，PAR激動劑是PAR4激動劑。在另一種實施方案中，釋放劑是PAR1拮抗劑。PAR1和PAR4激動劑是本領域技術人員公知的，并且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，參見，例如Ma et al.，PNAS，January 4，2005，vol.102(1)，在此全文引入作為參考。
由于PAR1和PAR4以相反的調(diào)節(jié)方式影響血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑從血小板的釋放，可以給需要阻抑或活化血管發(fā)生的患者施用激動劑和拮抗劑。以此方式，通過給個體控制釋放PAR激動劑和拮抗劑，調(diào)整對有需要的位點的調(diào)節(jié)劑送遞。
血管發(fā)生抑制劑包括但不限于制管張素、Bevacizumab(Avastin)、美替克侖、Canstatin、CaplostatinTM、Combretastatin、內(nèi)皮抑制素、NM-3、血小板反應蛋白、腫瘤抑制素、2-甲氧基雌二醇、Vitaxin、ZD1839(Iressa)、ZD6474、OSI774(Tarceva)、CI1033、PKI1666、IMC225(Erbitux)、PTK787、SU6668、SU11248、Herceptin和IFN-α、CELEBREX(塞來昔布)、THALOMID(沙立度胺)、羅格列酮、bortezomib(Velcade)、bisphosphonate zolendronate(Zometa)和IFN-α。
在本發(fā)明的另一種實施方案中，描述了建立血管發(fā)生疾病或病癥的血小板記錄或譜的方法。該血小板譜也稱作標準物。在該實施方案中，從兩組個體分離血小板，一組患有已知的血管發(fā)生疾病或病癥(血管發(fā)生組)，第二組沒有血管發(fā)生疾病或病癥(對照組)。分析血小板中血小板相關生物標志物的水平。計算每一組的生物標志物的平均值，并且進行評估，以確定兩組之間的差異。然后建立特定血管發(fā)生疾病或病癥的血小板記錄或譜，其中該記錄列出了在血管發(fā)生組與對照組中差異表達的生物標志物。
本發(fā)明使得能夠檢測和分辨血管發(fā)生相關的狀況，特別是癌癥。本發(fā)明涉及用血小板中發(fā)現(xiàn)的生物分子作為與血管發(fā)生狀態(tài)相關的臨床狀況，特別是癌癥狀態(tài)的生物標志物。此處用到的血管發(fā)生狀態(tài)包括但不限于疾病與無病狀態(tài)的區(qū)別，如癌癥與正常(即非癌癥)的區(qū)別，特別是血管發(fā)生性癌癥與良性或非血管發(fā)生性癌癥的區(qū)別。
實際上，已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的許多生物標志物可以用于區(qū)別良性與惡性腫瘤，以及血管發(fā)生與非血管發(fā)生性腫瘤等。血小板對血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的選擇性攝取，而沒有血漿中這些蛋白的相應增加，提供了輔助診斷，特別是在臨床檢測到腫瘤前對癌癥的早期診斷的有用的測量方法。此外，發(fā)現(xiàn)血小板中多種生物標志物的多重測量，即，血小板譜分析，提供了患者中血管發(fā)生活性改變的非常靈敏的指示，并且提供了疾病的特異性鑒定?？梢杂醚“逄匦詸z測目前存在的診斷方法不能檢測到的顯微水平的人類癌癥。甚至血管發(fā)生蛋白的小來源，如靜息的非血管發(fā)生性腫瘤可以在臨床檢測到腫瘤本身之前可檢測地改變蛋白譜。在某些實施方案中，血小板血管發(fā)生譜比單一生物標志物范圍更廣，因為它可以檢測多種腫瘤類型和腫瘤大小。血小板血管發(fā)生譜的相對改變使得能夠在腫瘤發(fā)展過程中對腫瘤進行追蹤，所述發(fā)展過程從原位癌早期開始，即從臨床檢測到腫瘤前開始，并且使得能夠快速預后、早期治療和精確監(jiān)測疾病進展或消退(如用諸如血管發(fā)生抑制劑的無毒藥物治療后)。
血小板攝取很多已知的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白，如正調(diào)節(jié)劑，如VEGF-A、VEGF-C、bFGF、HGF、促血管生成素-1、PDGF、EGF、IGF-1、IGF BP-3、玻連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、乙酰肝素酶和鞘氨醇-1PO4，和/或負調(diào)節(jié)劑，如血小板反應蛋白、HGF的NK1/NK2/NK3片段、TGF-β-1、纖維蛋白原(制管張素)、高分子量激肽原(結構域5)、纖連蛋白(45kD片段)、EGF(片段)、α-2抗纖溶酶(片段)、β-血小板球蛋白、內(nèi)皮抑制素和BDNF(腦來源的神經(jīng)生長因子)，并且只要來源(如腫瘤)存在，則繼續(xù)螯合它們。不將本發(fā)明限制于螯合血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的任何特定生物機制或作用，認為血小板作為有效的轉(zhuǎn)運蛋白，將這些蛋白轉(zhuǎn)運到活化的內(nèi)皮部位，并且血小板中生物標志物的譜反映了腫瘤存在的開始和生長。
一方面，本發(fā)明提供了確定受試者中的血管發(fā)生狀況的方法，該方法包括(a)測量來自受試者的生物樣品中的至少一種血小板相關生物標志物；和(b)將該測量值與血管發(fā)生狀態(tài)進行關聯(lián)。
在一種實施方案中，測量了至少一種血小板相關生物標志物，所述測量是通過將生物標志物捕獲在SELDI探針的吸附劑上，并且通過激光解吸電離質(zhì)譜檢測捕獲的生物標志物。在某些實施方案中，吸附劑是陽離子交換吸附劑、陰離子交換吸附劑、金屬螯合物或疏水吸附劑。在其它實施方案中，吸附劑是生物特異性吸附劑。在另一種實施方案中，至少一種血小板相關生物標志物是通過免疫測定法測量的。
在另一種實施方案中，通過軟件分類算法進行關聯(lián)。在某些實施方案中，血管發(fā)生狀態(tài)是癌癥與正常(非癌癥)。在另一種實施方案中，血管發(fā)生狀態(tài)是良性腫瘤與惡性腫瘤。在另一種實施方案中，血管發(fā)生狀態(tài)是血管發(fā)生性腫瘤與非血管發(fā)生性腫瘤，即靜息腫瘤。在另一種實施方案中，血管發(fā)生狀態(tài)是特定類型的癌癥，包括乳腺癌、肝癌、肺癌、成血管細胞瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、腦癌、成神經(jīng)細胞瘤、結腸癌、癌、肉瘤、白細胞、淋巴瘤和肌瘤。
在另一種實施方案中，該方法進一步包括(c)根據(jù)血管發(fā)生狀態(tài)控制受試者治療。如果該測量與癌癥相關，則控制受試者治療包括給受試者施用例如化療劑、血管發(fā)生治療、放療和/或手術。
在另一實施方案中，該方法進一步包括(d)在受試者控制后測量至少一種血小板相關生物標志物，以評估治療的有效性。
另一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其中包含(a)固體支持物，其包含至少一種與其附著的捕獲試劑，其中捕獲試劑結合至少一種血小板相關生物標志物；和(b)采用固體支持物檢測至少一種生物標志物的說明書。在另一種優(yōu)選實施方案中，至少一種血小板相關生物標志物選自以下生物標志物VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、金屬蛋白酶的組織抑制劑、載脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金屬蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管張素和血小板反應蛋白，及其組合。
在一種實施方案中，試劑盒提供了用固體支持物檢測生物標志物的說明書，所述生物標志物選自以下生物標志物VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、金屬蛋白酶的組織抑制劑、載脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金屬蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管張素和血小板反應蛋白，及其組合。
在另一種實施方案中，包含捕獲試劑的固體支持物是SELDI探針。在某些實施方案中，吸附劑是陽離子交換吸附劑、陰離子交換吸附劑、金屬螯合物或疏水吸附劑。在某些優(yōu)選的實施方案中，捕獲試劑是陽離子交換吸附劑。在其它實施方案中，試劑盒還包含(c)陰離子交換色譜吸附劑，如季胺吸附劑(如BioSepra Q Ceramic HyperDF吸附劑珠)。在其它實施方案中，試劑盒還包含(c)含有至少一種表1和表2的血小板相關生物標志物的容器。
另一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其中包含(a)固體支持物，其包含至少一種與其附著的捕獲試劑，其中捕獲試劑結合至少一種血小板相關生物標志物；和(b)包含至少一種生物標志物的容器。
在一種實施方案中，試劑盒提供了用固體支持物檢測生物標志物的說明書，所述生物標志物選自以下生物標志物VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、金屬蛋白酶的組織抑制劑、載脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金屬蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管張素和血小板反應蛋白。在另一種實施方案中，試劑盒提供了用固體支持物檢測每一種以下生物標志物，或額外檢測以下每一種生物標志物的說明書VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、金屬蛋白酶的組織抑制劑、載脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金屬蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管張素和血小板反應蛋白。
另一方面，本發(fā)明提供了軟件產(chǎn)品，該軟件產(chǎn)品包含(a)存取歸于樣品的數(shù)據(jù)的代碼，該數(shù)據(jù)包含生物樣品中至少一種血小板相關生物標志物的測量值；和(b)執(zhí)行分類算法的代碼，該算法將樣品的血管發(fā)生疾病狀態(tài)分類為測量值的函數(shù)。
在一種實施方案中，該分類算法將樣品的血管發(fā)生狀態(tài)分類為選自下組的生物標志物的測量值的函數(shù)VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、金屬蛋白酶的組織抑制劑、載脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金屬蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管張素和血小板反應蛋白。在另一種實施方案中，該分類算法將樣品的血管發(fā)生狀態(tài)分類為以下每一種生物標志物的測量值的函數(shù)VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、金屬蛋白酶的組織抑制劑、載脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金屬蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管張素和血小板反應蛋白。
在其它方面，本發(fā)明提供了選自表1和表2所列血小板相關生物標志物的純化的生物分子，此外，提供了包含檢測表1和表2所列生物標志物的方法。
如果計算出不同組的生物標志物的平均值或中值表達水平具有顯著統(tǒng)計學差異，與一種表型狀態(tài)相比，生物標志物不同地存在于取自另一種表型狀態(tài)(如患病)的受試者的樣品中。統(tǒng)計學顯著性的常用檢驗包括，但不限于t檢驗、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和讓步比。單獨或組合的生物標志物提供了受試者屬于一種表型狀態(tài)或另一種表型狀態(tài)的相對風險。因此，它們可用作疾病(診斷學)、藥物的治療效果(治療診斷學)和藥物毒性的標志物。
發(fā)現(xiàn)血小板是癌癥和特征在于血管發(fā)生(包括抗血管發(fā)生)活性差異的其它狀況的生物標志物的出乎意料好的來源。具體地，血小板來源的生物標志物表明非常早期的疾病狀態(tài)改變，并且不僅區(qū)分癌癥和非癌癥，還能區(qū)分良性腫瘤和惡性腫瘤。因此，本發(fā)明提供了多種臨床狀況，如癌癥、關節(jié)炎和妊娠的早期診斷途徑。可以用本發(fā)明區(qū)分不同的臨床狀況，因為所述每一種狀況可能導致不同生物標志物或多個生物標志物簇的改變。因此，特定臨床狀況的生物標志物表達模式可能是疾病或代謝狀態(tài)的指紋或譜。因此，本發(fā)明提供了用于檢測和確定生物標志物的表達水平的試劑盒、方法和裝置，所述生物標志物表明疾病狀態(tài)或與血管發(fā)生活性改變相關的代謝活性改變。
此外，本發(fā)明提供了血小板譜標準或記錄的建立。例如，通過分析來自患有已知癌癥的個體的血小板樣品，可以建立標準譜或記錄。該記錄可以用作與測試樣品進行比較的對照?？梢詮难“遄V獲益的疾病狀態(tài)的實例包括但不限于乳腺癌、肝癌、肺癌、成血管細胞瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、腦癌、成神經(jīng)細胞瘤、結腸癌、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤和肌瘤。
本發(fā)明檢測腫瘤生長變化的能力描述于例如此處提供的附圖和表。用于獲得附圖和表中所示數(shù)據(jù)的方法在實施例中詳細描述。簡言之，給小鼠植入靜息或血管發(fā)生性腫瘤，使該腫瘤生長預定的時間段。也研究了沒有植入腫瘤的對照動物。從這些小鼠獲得血小板，勻漿，按照實施例的描述進行處理，用SELDI質(zhì)譜和本領域技術人員實施的其它方法進行分析。采用該方法，鑒定了血小板來源的生物標志物，所述標志物可以在非常早期表明疾病狀態(tài)的改變，并且不僅可以區(qū)分癌癥與非癌癥，也可以區(qū)分良性腫瘤和惡性腫瘤。例如，生物標志物PF4的表達在來自患有腫瘤的小鼠的血小板中增強。出乎意料地，PF4表達在具有靜息(非血管發(fā)生性)腫瘤的小鼠中的表達是最高的。附圖和表1和2舉例說明了對于生物標志物CTAPIII的相似結果，其二聚體的質(zhì)量是大約16.2。
注意建立適于檢測的生物標志物僅僅需要生物標志物的分子量，但也可以使用觀察到的峰的形狀和強度以及其它參數(shù)。例如，如果生物標志物的活性已知，則可以使用生物標志物的抗體，酶測定可以用于對生物標志物進行檢測和定量。
生物標志物 本發(fā)明提供了在具有特征在于血管發(fā)生或抗血管發(fā)生活性的狀況，特別是癌癥與正常(非癌癥)或良性腫瘤與惡性腫瘤的受試者的血小板中差別存在的基于多肽的生物標志物。生物標志物是通過質(zhì)譜確定的質(zhì)荷比、通過它們在飛行時間質(zhì)譜中的譜峰形狀和通過它們與吸附表面的結合特征而表征的。這些特征提供了確定被檢測的特定生物分子是否是本發(fā)明的生物標志物的方法。這些特征代表生物分子的固有特征，并且不以區(qū)別生物分子的方式產(chǎn)生限制。一方面，本發(fā)明提供了分離形式的這些生物標志物。
本發(fā)明的血小板相關生物標志物是采用來自CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont，CA)的ProteinChip陣列(″Ciphergen″)，用SELDI技術發(fā)現(xiàn)的。從屬于以下三種表型狀態(tài)之一的鼠受試者收集血小板樣品正常、良性腫瘤、惡性腫瘤。用脲緩沖液提取血小板，然后直接加入陰離子交換、陽離子交換或IMAC銅SELDI生物芯片中進行分析，或在陰離子交換珠上分級分離，然后加入陽離子交換SELDI生物芯片中進行分析。通過在Ciphergen PBSII質(zhì)譜儀上進行飛行時間質(zhì)譜產(chǎn)生樣品中多肽的譜。通過Ciphergen Biosystems公司的裝有Biomarker Wizard and Biomarker Pattern軟件的Ciphergen ExpressTM數(shù)據(jù)管理軟件分析由此獲得的譜。對每一組的質(zhì)譜進行散點圖分析。用Mann-Whitney檢驗分析比較三個不同的組，選擇在兩組之間有顯著差異(p＜0.0001)的蛋白。這些方法在實施例部分有更詳細的描述。
可以通過質(zhì)譜法測定的質(zhì)荷比表征本發(fā)明的生物標志物。每個生物標志物的質(zhì)荷比(“M”值)也可以標為“標志物”。因此，例如M8206的測量質(zhì)荷比是8206。從Ciphergen Biosystems公司的PBSII質(zhì)譜儀上產(chǎn)生的質(zhì)譜確定質(zhì)荷比。該儀器具有約+/-1000m/dm的質(zhì)量準確度，m是質(zhì)量，dm是0.5峰高度時的質(zhì)譜峰寬度。用BiomarkerWizardTM軟件(Ciphergen Biosystems，Inc.)確定生物標志物的質(zhì)荷比。Biomarker Wizard簇集通過PBSII確定的所分析的所有質(zhì)譜的相同峰的質(zhì)荷比，取簇中的最大和最小質(zhì)荷比，除以2，從而給生物標志物賦予質(zhì)荷比。因此，提供的質(zhì)量反應了這些規(guī)格。
可以通過在飛行時間質(zhì)譜中的質(zhì)譜峰的形狀進一步表征本發(fā)明的生物標志物。附圖中示出了顯示代表生物標志物的峰的質(zhì)譜。
可以通過在色譜表面的結合特性進一步表征本發(fā)明的生物標志物。例如，在pH6時結合級分III(pH5洗滌)中的標志物，但被pH5時的洗滌洗脫。大多數(shù)生物標志物在pH5時用50mM乙酸鈉洗滌后結合于陽離子交換吸附劑(如Ciphergen WCX ProteinChip陣列)，并且很多結合于IMAC生物芯片。
已經(jīng)確定了本發(fā)明的某些生物標志物的身份。該確定的方法描述于實施例部分。對于確定了身份的生物標志物，可以通過本領域公知的其它方法確定生物標志物的存在，所述方法包括但不限于光度和免疫檢測。
可以通過質(zhì)荷比、結合特性和質(zhì)譜形狀表征用本發(fā)明可以檢測的生物標志物，而不需要預先知道它們的特定身份。但是，如果需要，可以通過例如確定多肽的氨基酸序列而鑒定身份未確定的生物標志物。例如，可以通過用一些酶，如胰蛋白酶或V8蛋白酶進行肽作圖而鑒定蛋白標志物，并且用消化片段的分子量來檢索數(shù)據(jù)庫，得到與作圖中使用的蛋白酶產(chǎn)生的消化片段的分子量匹配的序列?；蛘撸梢杂么?lián)質(zhì)譜(MS)技術對蛋白生物標志物進行測序。在該方法中，通過例如凝膠電泳分離蛋白。切下含有生物標志物的條帶，使蛋白接受蛋白酶消化。通過串聯(lián)MS的第一個質(zhì)譜儀分離各個蛋白片段。該片段然后進行碰撞誘導的冷卻。這使得肽片段化，產(chǎn)生多肽梯。然后可以通過串聯(lián)MS的第二質(zhì)譜儀分析多肽梯。多肽梯成員的質(zhì)譜中的差異鑒定了序列中的氨基酸。可以以此方式對完整肽進行測序，或序列片段可以進行數(shù)據(jù)庫搜索以找到身份候選物。
修飾形式的血小板相關生物標志物的用途 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白通常在樣品中以多種不同形式存在，其特征在于質(zhì)量差異是可檢測的。這些形式可以由翻譯前和翻譯后修飾中的任意一種或這兩者一起導致。翻譯前修飾的形式包括等位基因變體、剪接變體和RNA編輯形式。翻譯后修飾的形式包括由蛋白水解裂解(如親本蛋白的片段)、糖基化、磷酸化、脂化、氧化、甲基化、胱氨?；⒒腔鸵阴；玫降男问健０囟ǖ鞍准捌渌行揎椥问降牡鞍椎募显诖朔Q作“蛋白簇”。特定蛋白的所有修飾形式的集合，排除該特定蛋白本身，在此稱作“修飾的蛋白簇”。本發(fā)明的任何生物標志物的修飾形式本身也可以用作生物標志物。在某些情況下，修飾形式在診斷中可以比此處描述的特定形式表現(xiàn)出更好的區(qū)分能力。
最初可以通過能夠檢測和區(qū)分生物標志物的修飾形式的任何方法檢測生物標志物的修飾形式。初始檢測的優(yōu)選方法包括首先用例如生物特異性捕獲試劑捕獲生物標志物及其修飾形式，然后通過質(zhì)譜檢測捕獲的蛋白。更具體地，用生物特異性捕獲試劑，如識別生物標志物及其修飾形式的抗體、適體或Affibodies捕獲蛋白。該方法也導致捕獲了結合于蛋白或通過其它方式由抗體識別并且本身可以是生物標志物的蛋白相互作用物。優(yōu)選地，生物特異性捕獲試劑結合于固相。然后，可以通過SELDI質(zhì)譜或通過從捕獲試劑上洗脫蛋白，并且通過常規(guī)MALDI或通過SELDI檢測洗脫的蛋白，從而可以檢測捕獲的蛋白。質(zhì)譜的使用是特別吸引人的，因為它可以基于質(zhì)量對蛋白的修飾進行區(qū)分和定量，而無須進行標記。
優(yōu)選地，生物特異性捕獲試劑結合于固相，如珠子、板、膜或芯片。將諸如抗體的生物分子偶聯(lián)于固相的方法是本領域公知的。它們可以利用例如雙功能連接劑，或可以用在接觸時結合分子的反應基團如環(huán)氧化物或咪唑?qū)滔噙M行衍生化?？梢栽谙嗤恢没旌厢槍Σ煌械鞍椎纳锾禺愋圆东@試劑，或它們可以在不同的物理或可尋址的位置附著于固相。例如，可以給多個柱子加載衍生化的珠子，每個柱子能夠捕獲單一蛋白簇?；蛘?，可以用針對多個蛋白簇的捕獲試劑衍生化的不同珠子裝填單個柱子，從而在單一位置捕獲所有分析物。因此，可以用基于抗體衍生化的珠子的技術，如Luminex(Austin，TX)的xMAP技術檢測蛋白簇。但是，為了區(qū)分，生物特異性捕獲試劑必須特異性針對簇的成員。
在另一種實施方案中，可以在相同位置或物理不同的可尋址位置用針對蛋白簇的捕獲試劑對生物芯片的表面進行衍生化。在不同可尋址位置捕獲不同簇的一個優(yōu)點是分析變得更簡單。
鑒定蛋白的修飾形式，并且與目的臨床參數(shù)進行關聯(lián)后，可以將修飾形式用作本發(fā)明任何方法的生物標志物。此時，可以通過任何特異性檢測方法實現(xiàn)修飾形式的檢測，所述方法包括親和捕獲，然后進行質(zhì)譜，或特異性針對修飾形式的常規(guī)免疫測定。免疫測定需要生物特異性捕獲試劑，如抗體，以捕獲分析物。此外，如測定必須設計為特異性區(qū)分蛋白和蛋白的修飾形式，這可以通過以下方式實現(xiàn)，例如，采用夾心測定，其中一種抗體捕獲一種以上的形式，并且第二種區(qū)別標記的抗體特異性結合多種形式，并且提供其區(qū)別檢測。可以通過用生物分子免疫動物而制備抗體。本發(fā)明涉及常規(guī)免疫測定，包括，例如，包括ELISA或基于熒光的免疫測定的夾心免疫測定，以及其它酶免疫測定。
血小板相關生物標志物的檢測 可以通過任何合適的方法檢測本發(fā)明的生物標志物?？梢杂糜诖颂幍臋z測范例包括光學法、電化學法(電壓測定和電流測定技術)、原子能顯微鏡和射頻法，如多極共振光譜。除了顯微術(共焦和非共焦)外，光學法的實例包括檢測熒光、發(fā)光、化學發(fā)光、吸光度、反射率、透光率和雙折射或折射指數(shù)(如表面等離子共振、橢圓光度法、共振鏡法、光柵耦合器波導法或干涉測量法)。
在用要求保擴的方法檢測前，可以對生物標志物進行分級分離，以便由其分離可以干擾檢測的血液成分。分級分離可以包含血小板與其它血液成分的分離、血小板成分的亞細胞分級分離和/或需要的生物標志物與血小板中的其它生物分子的分級分離，所述分離采用諸如色譜、親和純化、一維和二維作圖的技術，和本領域技術人員公知的其它純化方法。在一種實施方案中，通過生物芯片分析樣品。生物芯片通常包含固體基質(zhì)，并且通常具有平坦表面，其上附著了捕獲試劑(也稱作吸附劑或親和試劑)。通常，生物芯片的表面包含多個可尋址的位置，每個位置上結合了捕獲試劑。
蛋白生物芯片是適于捕獲多肽的生物芯片。本領域描述了很多蛋白生物芯片。這些包括，例如，由Ciphergen Biosystems公司(Fremont，CA)，Packard BioScience公司(Meriden CT)，Zyomyx(Hayward，CA)，Phylos(Lexington，MA)和Biacore(Uppsala，Sweden)生產(chǎn)的蛋白生物芯片。所述蛋白生物芯片的實例描述于以下專利或公開的專利申請中美國專利No.6,225,047；PCT國際公開No.WO99/51773；美國專利No.6,329,209；PCT國際申請No.WO00/56934；和美國專利No.5,242,828。
通過質(zhì)譜法檢測 可以通過質(zhì)譜法檢測本發(fā)明的生物標志物，質(zhì)譜法是采用質(zhì)譜儀檢測氣相離子的方法。質(zhì)譜儀的實例是飛行時間、磁區(qū)、四極濾光器、離子收集器、離子回旋共振、靜電區(qū)分析儀和這些的混合。
在進一步優(yōu)選的方法中，質(zhì)譜儀是激光解吸/電離質(zhì)譜儀。在激光解吸/電離質(zhì)譜法中，將分析物置于質(zhì)譜探針(一種適配裝置)的表面上，以便接合將質(zhì)譜儀的探針界面，并且給分析物施加電離能，以進行電離，并且導入質(zhì)譜儀中。激光解吸質(zhì)譜儀利用典型地來自紫外激光，但也可以來自紅外激光的激光能，將分析物從表面解吸，以便使其揮發(fā)和電離，使它們能夠用于質(zhì)譜儀的離子光學。
SELDI 用于本發(fā)明的一種優(yōu)選的質(zhì)譜技術是“表面增強激光解吸和電離”或“SELDI”，該技術描述于例如Hutchens和Yip的美國專利No.5,719,060和No.6,225,047。這是指一種解吸/電離氣相離子譜(如質(zhì)譜)的方法，其中將分析物(此處是一種或多種生物標志物)捕獲在SELDI質(zhì)譜探針的表面。存在幾種形式的SELDI。
一種形式的SELDI稱作“親和捕獲質(zhì)譜”。其也稱作“表面增強親和捕獲”或″SEAC″。這種形式涉及使用在探針表面具有捕獲分析物的材料，該捕獲是通過材料和分析物之間的非共價親和相互作用(吸附)。該材料在不同場合也稱作“吸附劑”、“捕獲試劑”、“親和試劑”或“親和部分”。該探針也可以稱作“親和捕獲探針”，并且具有“吸附表面”。捕獲試劑可以是任何能夠結合分析物的材料。捕獲試劑可以直接附著于選擇性表面的基質(zhì)，或基質(zhì)可以具有攜帶能夠結合捕獲試劑的反應部分的反應表面，所述結合是通過例如形成共價或配位共價鍵的反應。環(huán)氧化物和carbodiimidizole是有用的反應部分，以共價結合多肽捕獲試劑，如抗體或細胞受體。次氮基乙酸和亞氨基乙酸是有用的反應部分，它們的功能是作為螯合劑結合金屬離子，所述金屬離子與含有組氨酸的肽非共價相互作用。吸附劑通常分類為色譜吸附劑和生物特異性吸附劑。
“色譜吸附劑”是指通常用于色譜中的吸附材料。色譜吸附劑包括，例如，離子交換材料、金屬螯合劑(如次氮基乙酸或亞氨基乙酸)、固定的金屬螯合物、疏水相互作用吸附劑、親水相互作用吸附劑、染料、簡單生物分子(如核苷酸、氨基酸、簡單糖和脂肪酸)和混合模式的吸附劑(如疏水吸引/靜電排斥吸附劑)。
“生物特異性吸附劑”是指包含生物分子的吸附劑，所述生物分子如核酸分子(如適體)、多肽、多糖、脂質(zhì)、甾體類或這些物質(zhì)(如糖蛋白、脂蛋白、糖脂、核酸(如DNA)-蛋白綴合物)的綴合物。在某些情況下，生物特異性吸附劑可以是大分子結構，如多蛋白復合物、生物膜或病毒。生物特異性吸附劑的實例是抗體、受體蛋白和核酸。生物特異性吸附劑通常對靶分析物比對色譜吸附劑具有更高的特異性。用于SELDI的吸附劑的進一步的實例可以參見美國專利No.6,225,047?！吧镞x擇性吸附劑”是指以至少10-8M的親和力結合分析物的吸附劑。
由Ciphergen Biosystems公司生產(chǎn)的蛋白生物芯片包含在可尋址的位置上附著了色譜或生物特異性吸附劑的表面。CiphergenProteinChip陣列包含NP20(親水)；H4和H50(疏水)；SAX-2、Q-10和LSAX-30(陰離子交換)；WCX-2、CM-10和LWCX-30(陽離子交換)；IMAC-3、IMAC-30和MAC 40(金屬螯合物)；和PS-10，PS-20(具有carboimidizole、環(huán)氧化物的反應表面)和PG-20(通過carboimidizole偶聯(lián)的蛋白G)。疏水ProteinChip陣列具有異丙基或壬基苯氧基聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯官能團。陰離子交換ProteinChip芯片具有季銨官能團。陽離子交換ProteinChip陣列具有羧酸酯官能團。固定的金屬螯合物ProteinChip陣列具有次氮基乙酸官能團，其通過螯合吸附過渡金屬離子，如銅、鎳、鋅和鎵。預活化的ProteinChip陣列具有可以與蛋白上用于共價結合的基團反應的carboimidizole或環(huán)氧化物基團。
所述生物芯片進一步描述于美國專利No.6,579,719(Hutchens和Yip，″Retentate Chromatography，″2003年6月17日)；PCT國際公開No.WO00/66265(Rich et al.，″Probes for a Gas PhaseIon Spectrometer，″2000年11月9日)；美國專利No.6,555,813(Beecheret al.，″Sample Holder with Hydrophobic Coating for Gas Phase MassSpectrometer，″2003年4月29日)；美國專利申請No.U.S.20030032043Al(Pohl and Papanu，″Latex Based Adsorbent Chip，″2002年7月16日)；和PCT國際公開No.WO03/040700(Urn et al.，″Hydrophobic Surface Chip，″2003年5月15日)；美國專利申請No.US2003/0218130Al(Boschetti et al.，″Biochips With Surfaces Coated WithPolysaccharide-Based Hydrogels，2003年4月14日)和美國專利申請No.60/448,467，名稱是″Photocrosslinked Hydrogel Surface Coatings″(Huang et al.，2003年2月21日提交)。
概言之，具有吸附表面的探針與樣品接觸足夠的時間，使得可能存在于樣品中的生物標志物能夠結合吸附劑。溫育期后，洗滌基質(zhì)，以除去未結合的材料?？梢允褂萌魏魏线m的洗滌溶液，優(yōu)選使用水溶液?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)洗滌的嚴格性操作分子保持結合的程度。洗滌溶液的洗脫特征可以依賴于例如pH、離子強度、疏水性、離液程度、去污劑強度和溫度。除非探針具有SEAC和SEND這兩種特性(如此處的描述)，然后將能量吸附分子施加到具有結合的生物標志物的基質(zhì)。
在氣相離子質(zhì)譜儀如飛行時間質(zhì)譜儀中檢測與基質(zhì)結合的生物標志物。通過諸如激光的電離源對生物標志物進行電離，通過離子光學組裝收集產(chǎn)生的離子，然后質(zhì)量分析儀分散并且分析通過的離子。然后，檢測器將檢測到的離子的信息翻譯為質(zhì)荷比。生物標志物的檢測通常涉及檢測信號強度。這樣，可以確定生物標志物的數(shù)量和質(zhì)量。
另一種形式的SELDI是表面增強凈解吸(SEND)，其涉及使用包含與探針表面(″SEND探針″)化學結合的能量吸收分子。短語“能量吸收分子”(EAM)表示能夠從激光解吸/電離源吸收能量，隨后導致與其接觸的分析物分子解吸和電離的分子。EAM類別包括用于MALDI的分子，通常稱作“基質(zhì)”，其實例是肉桂酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基-羥基-肉桂酸(CHCA)和二羥基苯甲酸、阿魏酸和羥乙酰苯衍生物。在某些實施方案中，將能量吸收分子摻入線性或交聯(lián)的聚合物，如聚甲基丙烯酸酯。例如，組合物可以是a-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸和丙烯酸酯的共聚物。在另一種實施方案中，組合物是a-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸、丙烯酸酯和3-(三乙氧基)甲硅烷基丙基甲基丙烯酸酯的共聚物。在另一種實施方案中，組合物是a-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸和十八烷基甲基丙烯酸酯的共聚物(″C18SEND″)。SEND進一步描述于美國專利No.6,124,137和PCT國際公開WO03/64594(Kitagawa，″Monomers And Polymers Having EnergyAbsorbing Moieties Of Use In Desorption/Ionization Of Analytes，″2003年8月7日)。
SEAC/SEND是SELDI的一種形式，其中捕獲試劑和能量吸收分子均附著于存在樣品的表面。因此，SEAC/SEND探針使得能夠通過親和捕獲和電離/解吸而捕獲分析物，而不需要施加外部基質(zhì)。C18SEND生物芯片是SEAC/SEND的一種形式，包含作為捕獲試劑起作用的C18部分和作為能量吸收部分起作用的CHCA部分。
SELDI的另一種形式稱作表面增強的光不穩(wěn)定性附著和釋放(SEPAR)，其涉及使用具有附著于可以共價結合分析物的表面的部分的探針，然后通過在暴露于光，如激光后打斷該部分中的光不穩(wěn)定性鍵而釋放分析物(參見美國專利No.5,719,060)。SEPAR和SELDI的其它形式適于根據(jù)本發(fā)明檢測生物標志物譜。
其它質(zhì)譜法 在另一種質(zhì)譜法中，首先可以將生物標志物捕獲在具有結合生物標志物的色譜特性的色譜樹脂上。在本實例中，這可以包括多種方法。例如，可以將生物標志物捕獲在諸如CM Ceramic HyperD F樹脂的陽離子交換樹脂上，洗滌樹脂，洗脫生物標志物，并且通過MALDI檢測?；蛘?，可以在施加陽離子交換樹脂前在陰離子交換樹脂上對樣品分級分離，從而進行該方法。再或者，可以在陰離子交換樹脂上分級分離，并且通過MALDI直接檢測。在另一方法中，可以將生物標志物捕獲在含有結合生物標志物的抗體的免疫色譜樹脂上，洗滌樹脂以除去未結合的材料，從樹脂洗脫生物標志物，并且通過MALDI或通過SELDI檢測洗脫的標志物。
數(shù)據(jù)分析 通過飛行時間質(zhì)譜對分析物進行的分析產(chǎn)生了飛行時間譜。最終分析的飛行時間譜通常不代表來自對樣品的電離能量的單一脈沖的信號，而是代表來自多個脈沖的信號總和。這減少了噪音，并且增加了動態(tài)范圍。然后對該飛行時間數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理。在Ciphergen的ProteinChip軟件中，數(shù)據(jù)處理通常包括飛行時間到M/Z的轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生質(zhì)譜，扣除基線以除去儀器偏差，并且過濾高頻噪音，以減少高頻噪音。
可以用可程序化的數(shù)字計算機分析生物標志物的解吸和檢測產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。該計算機程序分析數(shù)據(jù)，以顯示檢測的生物標志物的數(shù)目，并任選顯示信號的強度和確定檢測的每種生物標志物的分子質(zhì)量。數(shù)據(jù)分析可以包括確定生物標志物的信號強度和除去偏離預定統(tǒng)計分布的數(shù)據(jù)的步驟。例如，可以通過計算相對于一些參照物的每個峰的高度，對觀察到的峰進行歸一化。參照物可以是由儀器和諸如能量吸收分子的化學物質(zhì)產(chǎn)生的背景噪音，其在標尺中設定為0。
計算機可以將得到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為多種展示形式?？梢哉故緲藴寿|(zhì)譜，但在一種有用的形式中，僅僅從質(zhì)譜展示中保留峰高度和質(zhì)量信息，產(chǎn)生更清晰的圖像并且使得能夠更容易觀察到分子量幾乎相同的生物標志物。在另一種有用的形式中，比較了兩個或多個質(zhì)譜，方便地加強了獨特的生物標志物和在樣品之間上調(diào)和下調(diào)的生物標志物。采用任何所述形式，可以容易地確定特定生物標志物是否存在于樣品中。
分析通常包括鑒定代表來自分析物的信號的質(zhì)譜中峰的鑒定?？梢匀庋圻x擇峰，但也可以使用軟件，其是Ciphergen的ProteinChip軟件包中的一部分，可以自動檢測峰。概言之，該軟件是通過鑒定信噪比高于選定的閾值的信號，并且標出在峰信號質(zhì)心處的峰質(zhì)量而起作用的。在一種有用的應用中，比較了很多質(zhì)譜，以鑒定出存在于質(zhì)譜的一些選定百分比中的相同峰。一種形式的該軟件簇集出現(xiàn)在確定質(zhì)量范圍中的多個質(zhì)譜中的所有峰，并且給所有接近質(zhì)量(M/Z)簇中點的峰賦予質(zhì)量(M/Z)。
用于分析數(shù)據(jù)的軟件可以包括將算法用于信號分析的代碼，所述分析確定了信號是否代表信號中相應于本發(fā)明的生物標志物的信號中的峰。該軟件也可以使關于觀察到的生物標志物峰的數(shù)據(jù)進入分類樹或ANN分析，以確定是否存在表明檢驗的特定臨床參數(shù)的狀態(tài)的生物標志物峰或生物標志物峰的組合。數(shù)據(jù)分析可以直接或間接從樣品的質(zhì)譜分析“鍵入”多個獲得的參數(shù)。這些參數(shù)包括但不限于一個或多個峰的存在與否、峰或一組峰的形狀、一個或多個峰的高度、一個或多個峰的高度的對數(shù)，和峰高度數(shù)據(jù)的其它算數(shù)操作。
血小板相關生物標志物的SELDI檢測的通用程序 如上文提到的，SELDI質(zhì)譜法是本發(fā)明考慮的用于檢測生物標志物的優(yōu)選程序。采用SELDI檢測生物標志物的通用程序優(yōu)選以含有進行分級分離的生物標志物的樣品開始，從而至少部分將目的生物標志物與樣品的其它成分分離。樣品的早期分級分離是優(yōu)選的，因為該方法通常改變本發(fā)明的靈敏度。預先分級分離的優(yōu)選方法包括使樣品與陰離子交換色譜材料如Q HyperD(BioSepra，SA)接觸。然后用pH9、pH7、pH5和pH4的緩沖液對結合的材料進行逐步pH洗脫，收集含有生物標志物的級分。
然后使要檢測的(優(yōu)選預先分級分離的)樣品與包含陽離子吸附劑(優(yōu)選WCX ProteinChip陣列(Ciphergen Biosystems，Inc.))或IMAC吸附劑(優(yōu)選IMAC3ProteinChip陣列(Ciphergen Biosystems，Inc.))的親和探針接觸。然后用緩沖液洗滌探針，保留了生物標志物而洗去了未結合分子。通過激光解吸/電離質(zhì)譜檢測生物標志物。
或者，如果可以得到識別生物標志物的抗體，如PF4和CTAPIII的情況下，可以構建生物特異性探針?？梢酝ㄟ^使抗體與官能化探針如預先活化的PSI0或PS20ProteinChip陣列(Ciphergen Biosystems，Inc.)的表面接觸而形成所述探針。一旦附著于探針的表面，然后可以將探針用于將生物標志物從樣品捕獲到探針表面。然后可以通過例如激光解吸/電離質(zhì)譜法檢測生物標志物。
通過免疫測定進行檢測 在另一實施方案中，可以通過免疫測定法測量本發(fā)明的生物標志物。免疫測定需要生物特異性捕獲試劑，如抗體，以捕獲生物標志物。可以通過本領域公知的方法，如通過用生物標志物免疫動物而制備抗體。可以基于結合特征從樣品分離生物標志物?；蛘撸绻阎嚯纳飿酥疚锏陌被嵝蛄?，可以合成多肽，并且用于通過本領域公知的方法制備抗體。
本發(fā)明涉及常規(guī)的免疫測定，包括，例如包括ELISA或基于熒光的免疫測定的夾心免疫測定，以及其它酶免疫測定。在基于SELDI的免疫測定中，將生物標志物的生物特異性捕獲試劑附著于MS探針，如預先活化的ProteinChip陣列的表面。然后通過該試劑將生物標志物特異性捕獲在生物芯片表面，通過質(zhì)譜法檢測捕獲的生物標志物。
將生物標志物表達的改變與血管發(fā)生狀態(tài)進行關聯(lián) 采用本發(fā)明，使得實施者能夠診斷個體中與血管發(fā)生活性增加相關的代謝狀態(tài)的改變。這是通過監(jiān)測由與要檢測的代謝狀態(tài)改變相關的血管發(fā)生活性導致的血小板相關生物標志物表達水平的改變而實現(xiàn)的。因此，本發(fā)明的優(yōu)選生物標志物與血管發(fā)生或血管靜止(angiostasis)相關，但合適的生物標志物的精確鑒定不是用這些生物標志物實施本發(fā)明的先決條件?？梢杂脝蝹€可檢測標志物或單獨或作為一組表現(xiàn)出表達水平改變的多個可檢測標志物以描述的方法進行本發(fā)明的實施，所述表達水平改變是反應于與諸如癌癥、感染、妊娠、組織損傷等生理改變相關的血管發(fā)生活性的改變。
可以通過多種途徑監(jiān)測生物標志物表達。例如，可以分析單一樣品中的生物標志物表達水平，隨后將該水平與對代表性對照群體取樣確定的對照閾值進行比較?；蛘呖梢詫碜栽谝粋€時程中從單一患者獲得的多個樣品進行比較，以確定生物標志物表達水平是增加還是減少。當評估治療影響生物標志物表達的疾病后患者的預后時，該方法特別有用。本領域技術人員可以理解其它生物標志物評估，他們可以在不進行過多實驗的前提下進行分析。
單標志物 對于本發(fā)明考慮了各個生物標志物的檢測，前提是所述生物標志物滿足上文指出的標準，特別是與要通過采用本發(fā)明檢測的疾病或代謝狀態(tài)改變相關?？梢詫我簧飿酥疚镉糜谠\斷測試，以評估受試者中的血管發(fā)生狀態(tài)，如，診斷影響患者中血管發(fā)生活性的癌癥的存在或諸如某些癌癥的病程中的改變?！把馨l(fā)生狀態(tài)”包括但不限于區(qū)分疾病與無病狀態(tài)，特別是血管發(fā)生性癌癥與非血管發(fā)生性靜息癌癥。此外，血管發(fā)生狀態(tài)可以包括多種類型的癌癥?；谠摖顟B(tài)，可以提示其它程序，包括其它診斷測試或治療程序或方案。
表1A和1B和表2中的每一種生物標志物和由本發(fā)明的方法鑒定的其它生物標志物均可用于輔助確定血管發(fā)生狀態(tài)。本發(fā)明的一些實施方案涉及例如測量血小板制劑中選定的生物標志物的表達水平。通過比較生物標志物的表達水平與早期確定的相同個體中的表達水平，本領域技術人員可以確定病程或疾病對治療的反應?；蛘?，可以將檢測到的生物標志物表達水平與例如通過研究展示合適已知表現(xiàn)的個體群而確定的一種或多種疾病狀態(tài)的閾值進行比較?？赡苓m于通過用本發(fā)明單獨檢測的診斷或治療目的的已知生物標志物的實例包括VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素、金屬蛋白酶的組織抑制劑、載脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金屬蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管張素和血小板反應蛋白。
將各個生物標志物用作血管發(fā)生活性改變的指示劑通常涉及檢測生物標志物，然后將確定的生物標志物表達水平與相關于特定疾病或代謝狀態(tài)改變的閾值水平進行關聯(lián)。例如，捕獲在SELDI生物芯片上，然后通過質(zhì)譜法檢測，其次，比較測量值與區(qū)分陽性血管發(fā)生狀態(tài)與陰性血管發(fā)生狀態(tài)的診斷量或截止值。診斷量代表高于或低于將受試者分類為具有特定血管發(fā)生狀況的測量到的生物標志物量。例如，如果與腫瘤形成過程中的正常量相比生物標志物被上調(diào)，則測量到的高于診斷截止值的量提供了癌癥的診斷?；蛘?，如果生物標志物在迅速發(fā)展的腫瘤治療過程中被下調(diào)，則測量到的低于診斷截止值提供了腫瘤消退或腫瘤變?yōu)殪o息狀態(tài)的診斷。
測量的生物標志物水平也可以用于促進特定類型癌癥的診斷，或區(qū)分不同類型的癌癥。例如，如果生物標志物或生物標志物的組合在某些癌癥類型中與其它標志物相比上調(diào)到特定水平，測量到的高于診斷截止值的生物標志物量提供了存在特定類型癌癥的指示。此外，可以用標志物的組合提供額外的診斷信息，如下文的描述。可以用此處描述的生物標志物和技術鑒定并且彼此區(qū)分的癌癥類型的一些實例包括乳腺癌、肝癌、肺癌、成血管細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、腦癌和結腸癌。也可以用此處描述的生物標志物和方法區(qū)分癌、肉瘤、淋巴瘤和肌瘤。此外，不同類型的癌癥表達不同的生物標志物模式，并且可以由此彼此區(qū)分。可以按照此處的描述確定每種癌癥類型的特征模式，如通過用學習算法分析每種癌癥類型的樣品，以產(chǎn)生可以基于癌癥類型對樣品分類的分類算法。
如本領域技術人員公知，通過調(diào)節(jié)用于測定中的特定診斷截止值，可以根據(jù)診斷者的偏好增強診斷測定的靈敏度或特異性。例如，可以通過測量來自具有不同血管發(fā)生狀態(tài)的受試者的統(tǒng)計學顯著數(shù)目的樣品中生物標志物的量，確定特定的診斷截止值，如此處這樣，并且畫出截止值，以適合診斷者需要的特異性和靈敏度水平。
標志物的組合 盡管單個標志物是有用的診斷性生物標志物，發(fā)現(xiàn)生物標志物的組合可以比單個生物標志物提供特定狀態(tài)的更有預測性的值。具體地，樣品中多個生物標志物的檢測可以增加測試靈敏度和/或特異性。在本發(fā)明的內(nèi)容中，在疾病或代謝狀態(tài)的改變的診斷中確定至少兩種，優(yōu)選3、4、5、6或7種，更優(yōu)選10、15或20種不同生物標志物的表達水平?？梢越M合使用的生物標志物的實例包括PF4、VEGF、PDGF、bFGF、PDECGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管張素、內(nèi)皮抑制素和血小板反應蛋白。本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案檢測包括bFGF的多種生物標志物和至少一種選自下組的其它生物標志物VEGF、PDGF、PDECGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、PF4、制管張素、內(nèi)皮抑制素和血小板反應蛋白。一種替代的優(yōu)選實施方案檢測包括PF4的多種生物標志物和至少一種選自下組的其它生物標志物VEGF、PDGF、bFGF、PDECGF、血管生成素、促血管生成素、制管張素、內(nèi)皮抑制素和血小板反應蛋白。
建立用于確定腫瘤狀態(tài)的分類算法 如上文的討論，可以人工或用計算機軟件自動進行檢測的生物標志物表達水平的分析?？梢赃M行單樣品分析，或可以進行多樣品分析，其中多個樣品種的每一種樣品都是在治療或評估過程中的合適時間取自進行接受研究的個體。分析的準確性是特別重要的，因為該測定可以用于在疾病或代謝狀態(tài)改變的治療中監(jiān)測進展，并且用于診斷疾病或代謝狀態(tài)改變。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，基于分類的表達水平控制患者治療，以便準確反應評估的患者的疾病或代謝狀態(tài)。
適用于本發(fā)明的很多不同分類策略是本領域公知的。優(yōu)選的策略隨著疾病進展的不同階段鑒定生物標志物的不同表達水平。例如，在腫瘤生長中，腫瘤可能經(jīng)過一系列從階段，從新形成到轉(zhuǎn)移。因此，合適的分類方案可以包括“迅速進展”，其特征在于腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移活性；靜息，其確定不生長或活躍轉(zhuǎn)移的腫瘤；消退，其確定腫瘤縮小，例如，化療后；和無腫瘤。
在一些實施方案中，用諸如“已知樣品”的樣品產(chǎn)生的譜(如質(zhì)譜或飛行時間譜)所得到的數(shù)據(jù)可以用于“訓練”分類模型。“已知樣品”是已經(jīng)預先分類的樣品。來源于所述譜，并且用于形成分類模型的數(shù)據(jù)可以稱作“訓練數(shù)據(jù)組”。一旦得到訓練，分類模型可以識別來自用已知樣品建立的譜的數(shù)據(jù)中的模式。然后可以用分類模型將未知樣品分類。這可以用于，例如，預測特定生物樣品是否與某些生物狀況(如患病與無病)相關。
用于形成分類模型的訓練中的數(shù)據(jù)組可以包含原始數(shù)據(jù)或預處理過的數(shù)據(jù)。在某些實施方案中，可以直接從飛行時間譜或質(zhì)譜直接獲得原始數(shù)據(jù)，然后可以任選按照上文所述進行“預處理”。
可以用任何合適的統(tǒng)計學分類(或?qū)W習)方法形成分類模型，所述方法試圖基于數(shù)據(jù)中存在的目標參數(shù)將數(shù)據(jù)體分類。分類方法可以是監(jiān)督的或非監(jiān)督的。監(jiān)督或非監(jiān)督的分類方法的實例描述于″Statistical Pattern RecognitionA Review″，IEEE Transactions onPattern Analysis and Machine Intelligence，Vol.22，No.1，January2000，在此引入其教導作為參考。
在監(jiān)督分類中，已知類目的含有訓練數(shù)據(jù)的實例進行學習機制，其學習確定每一已知類的一組或多組關系。然后可以將新數(shù)據(jù)用于學習機制，其然后用學習到的關系對新數(shù)據(jù)分類。監(jiān)督分類處理的實例包括線性回歸處理(如多重線性回歸(MLR)、部分最小方差(PLS)回歸和主要成分回歸(PCR))、二元判斷樹(如回歸分配方法，如CART-分類和回歸樹)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡，如回饋網(wǎng)絡、判別分析(如Bayesian分類器或Fischer分析)、對數(shù)分類器和支持載體分類器(支持載體機制)。
優(yōu)選的監(jiān)督分類法是回歸分配處理。回歸分配處理采用回歸分配樹對來源于已知樣品的譜進行分類。關于回歸分配處理的進一步的細節(jié)提供于Paulse等的美國專利申請No.20020138208A1“Methodfor analyzing mass spectra″。
在其它實施方案中，建立的分類模型可以用監(jiān)督學習法形成。未監(jiān)督的分類試圖基于訓練數(shù)據(jù)組中的相似性學習分類，而不對訓練數(shù)據(jù)組所來源的譜進行預分類。非監(jiān)督學習法包括簇分析。簇分析試圖將數(shù)據(jù)分為“簇”或組，其理想地應該具有彼此非常相似，但與其它簇的成員非常不相似的成員。然后用一些距離度量測量相似性，該度量測量數(shù)據(jù)項之間的距離，并且將彼此接近的數(shù)據(jù)項簇集在一起。簇集技術包括MacQueen的K-平均值算法和Kohonen的Self-Organizing Map算法。
用于對生物信息進行分類的學習算法描述于，例如PCT國際公開No.WO01/31580(Barnhill et al.，″Methods and devices foridentifying patterns in biological systems and methods of use thereof”)，美國專利申請No.2002 0193950A1(Gavin et al.；″Method or analyzingmass spectra″)，美國專利申請No.2003 0004402A1(Hitt et al.，″Processfor discriminating between biological states based on hidden patternsfrom biological data″)和美國專利申請No.2003 0055615A1(Zhang andZhang，″Systems and methods for processing biological expressiondata″)。
可以在任何合適的數(shù)字計算機上形成和使用分類模型。合適的數(shù)字計算機包括采用任何標準或特定操作系統(tǒng)，如Unix，WindowsTM或LinuxTM的小型、微型或大型計算機。使用的數(shù)字計算機可以與用于建立目的質(zhì)譜的質(zhì)譜儀物理上分開，或它可以與質(zhì)譜儀連接。
可以通過數(shù)字計算機執(zhí)行或使用的計算機代碼實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明實施方案的訓練數(shù)據(jù)組和分類模型。計算機代碼可以儲存于任何合適的計算機可讀介質(zhì)上，包括光盤、磁盤、記憶棒、磁帶等，并且可以用任何合適的計算機編程語言編寫，所述語言包括C、C++、visualbasic等。
上述學習算法可以用于開發(fā)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的生物標志物的分類算法，或用于發(fā)現(xiàn)確定血管發(fā)生狀態(tài)的新的生物標志物。隨后，分類算法通過提供單獨或組合使用的生物標志物的診斷值(如截止點)，形成了診斷測試的基礎。
管理患者的治療 在提供用于疾病狀態(tài)診斷和評估愈后的方法，試劑盒和裝置中，本發(fā)明可以用于提供管理患者的治療的工具。具體地，本發(fā)明可以用于對導致患者中血管發(fā)生活性改變的多種疾病進行診斷和評估其治療。所述狀況可以包括，例如，癌癥、妊娠、感染(如肝炎)、損傷和關節(jié)炎狀況。在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了確定血管發(fā)生狀態(tài)的方法，該方法進一步包括基于該狀態(tài)管理受試者的治療。所述管理包括在確定疾病狀態(tài)后醫(yī)生或臨床人員的行為。例如，如果醫(yī)生診斷出迅速進展的癌癥，則可能需要遵照某些治療方案，如化療或手術。或者，可以作出無腫瘤或靜息腫瘤的診斷，隨后進一步測試，以確定影響患者的具體疾病。
本發(fā)明特別有用的一方面是提供如上文所述可能威脅生命的狀況的早期檢測。早期診斷使得能夠早期治療該狀況，以促進恢復的愈后。例如，早期檢測癌癥，使得能夠進行更早和使虛弱減少的化療或在轉(zhuǎn)移前手術除去腫瘤。關節(jié)炎的早期檢測使得能夠在關節(jié)損傷發(fā)生前用藥物干預以控制炎癥，緩解疾病癥狀。
診斷后，用本發(fā)明檢測生物標志物，使得能夠評估采用的治療方案的有效性。例如，在癌癥中，檢測到靜息腫瘤治療后CTAPIII生物標志物的表達的減少，這與腫瘤表型改變?yōu)檠杆龠M展腫瘤相關。相反，檢測到CTAPIII隨后的增加，與腫瘤表型從迅速進展改變?yōu)殪o息或無腫瘤相關。
本發(fā)明的其它實施方案涉及將測定結果或診斷或這兩者傳達給例如技術人員、醫(yī)生或患者。在某些實施方案中，用計算機將測定結果或診斷或這兩者傳達給感興趣一方，如醫(yī)生及其患者。在某些實施方案中，在一個國家或管轄區(qū)進行測定或分析測定結果，該國家或管轄區(qū)不同于傳達結果或診斷的國家或管轄區(qū)。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，在獲得診斷后盡快將其傳達給受試者，所述診斷基于測試受試者中指示疾病或代謝狀態(tài)的生物標志物的存在與否。可以由治療受試者的醫(yī)生傳遞診斷結果?；蛘撸梢酝ㄟ^電子郵件發(fā)送給測試受試者，或通過電話傳達給受試者。可以用計算機，通過電子郵件或電話傳達診斷結果。在某些實施方案中，可以得到包含診斷測試結果的信息，并且用電話通訊領域技術人員公知的計算機硬件和軟件的組合自動送遞給受試者。針對保健領域的通訊系統(tǒng)的一個實例描述于美國專利No.6,283,761；但是，本發(fā)明不限于利用該特定通訊系統(tǒng)的方法。在本發(fā)明方法的某些實施方案中，可以在多個(如外國)管轄區(qū)進行所有或一些步驟，包括測定樣品、診斷疾病，和傳達測定結果或診斷結果。
診斷系統(tǒng) 本發(fā)明也涉及用于檢測生物標志物的診斷系統(tǒng)，所述生物標志物的表達反應于患者中血管發(fā)生活性的改變而改變。本發(fā)明的診斷系統(tǒng)優(yōu)選以單步操作，但不限于此。例如，一些實施方案包括多個吸附表面，其結合多種血小板相關生物標志物。優(yōu)選地，吸附劑是特異性吸附目的生物標志物的生物特異性吸附劑。本發(fā)明的診斷系統(tǒng)也具有檢測目的生物標志物的工具，其可以是質(zhì)譜儀。
例如，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案在燒結的玻璃料上接受血漿勻漿物。玻璃料與能夠支持液體的毛細流的吸水材料處于流體連通。吸水材料中含有試劑，包括特異性識別待檢測的生物標志物的可流動的生物特異性吸附劑。優(yōu)選地，可流動的生物特異性吸附劑包括可檢測標記，更優(yōu)選是可視標記。吸水材料更下游是識別待檢測生物標志物的固定的生物特異性吸附劑。
采用簡單裝置，如上文描述的裝置，可導入燒結的玻璃料的血漿勻漿物經(jīng)過過濾，不含細胞碎片。剩余的液體進入吸水材料，其通過毛細作用吸入液體，最終使液體沿其長度分布。在穿過吸水材料時，可流動的生物特異性吸附劑被溶解，并且結合于待檢測的生物標志物，形成復合物。隨著液體進一步通過吸水材料，復合物遇到并結合固定的生物特異性吸附劑。隨著復合物結合固定的生物特異性吸附劑，其在固定的生物特異性吸附劑附著于吸水材料的點濃縮，在此可以檢測它。在復合物結合后可以任選用洗滌緩沖液洗滌該裝置以除去最初的勻漿物中存在的可能是干擾性的材料。
本領域技術人員容易理解，存在一些變化的裝置形式，其以與此處描述的優(yōu)選裝置基本相同的方式工作。例如，該裝置可以采用與微量滴定板孔底偶聯(lián)的生物特異性試劑，以ELISA型方式工作。以此方式，將勻漿物加入孔。然后除去過量的勻漿物，用洗滌緩沖液洗滌孔。最后，加入標記的可移動抗體，檢測得到的復合物。
本領域技術人員容易理解，上述裝置的形式是公知的，其很多變化形式也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，相似的裝置描述于美國專利Nos5,409,664、6,146,589、4,960,691、5,260,193、5,202,268和5,766,961。
癌癥的生物標志物在篩選測定和癌癥治療方法中的用途 本發(fā)明的方法也具有其它應用。例如，可以用生物標志物篩選體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)生物標志物表達的化合物，所述化合物隨后可以用于治療或預防患者的癌癥，或治療或預防腫瘤從靜息腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)檠杆龠M展的腫瘤。在另一種實例，可以用生物標志物監(jiān)測對癌癥治療的反應。在另一實例中，可以將生物標志物用于遺傳研究，以確定患者是否具有發(fā)生癌癥的風險。
因此，例如，本發(fā)明的試劑盒可以包括具有疏水功能的固體基質(zhì)，如蛋白生物芯片(如Ciphergen H50 ProteinChip陣列，如ProteinChip陣列)和用于洗滌基質(zhì)的醋酸鈉緩沖液，以及提供在芯片上測量本發(fā)明的血小板相關生物標志物和用這些測量值診斷例如癌癥的方案的說明書。
最初可以通過鑒定與表1A和1B以及表2中列出的一種或多種生物標志物相互作用的化合物而篩選適于治療測試的化合物。例如，篩選可能包括重組表達表1A和1B以及表2中所列的標志物，純化標志物，和將生物標志物固定于基質(zhì)。然后可以使測試化合物與基質(zhì)接觸，通常在含水條件下接觸，并通過例如測量作為鹽濃度函數(shù)的洗脫速度測量測試化合物和生物標志物之間的相互作用。某些蛋白可以識別和裂解表1A和1B以及表2的一種或多種生物標志物，在此情況下可以通過在標準測定中監(jiān)測一種或多種生物標志物的消化而檢測蛋白，所述監(jiān)測例如是通過蛋白電泳。
在相關實施方案中，可以測量測試化合物抑制表1A和1B以及表2的一種或多種生物標志物的活性的能力。本領域技術人員可以理解，用于測量特定生物標志物活性的技術將根據(jù)生物標志物的功能和特性而改變。例如，可以測定生物標志物的酶活性，前提是能夠得到合適的底物，并且前提是底物濃度和反應產(chǎn)物的外觀是容易測量的?？赡艿闹委熜詼y試化合物抑制或增強特定生物標志物活性的能力可以通過測量測試化合物存在或不存在的條件下的催化速度而確定。也可以測量測試化合物干擾表中生物標志物之一的非酶促(如結構)功能或活性的能力。例如，可以在測試化合物存在或不存在的條件下通過質(zhì)譜監(jiān)測包含表中生物標志物之一的多蛋白復合物的自組裝?；蛘?，如果生物標志物是轉(zhuǎn)錄的非酶增強劑，可以通過測量測試化合物存在或不存在的條件下的體內(nèi)或體外生物標志物依賴性轉(zhuǎn)錄水平而鑒定干擾生物標志物增強轉(zhuǎn)錄的能力的測試化合物。
可以給患有癌癥或有發(fā)生癌癥的風險的患者施用能夠調(diào)節(jié)表中任意生物標志物活性的測試化合物。例如，如果特定生物標志物的體內(nèi)活性防止癌癥蛋白的積累，施用增加特定生物標志物活性的測試化合物可以減少患者發(fā)生癌癥的風險。相反，如果生物標志物活性的增加至少部分導致癌癥的發(fā)病，施用減少特定生物標志物活性的測試化合物可以減少患者發(fā)生癌癥的風險。
另一方面，本發(fā)明提供了鑒定用于治療諸如癌癥的病癥的化合物的方法，所述病癥與表中的血小板相關生物標志物的修飾形式的水平增加相關。例如，在一種實施方案中，可以篩選細胞提取物或表達文庫，得到催化全長生物標志物的裂解以形成截短形式的化合物。在所述篩選測定的一種實施方案中，可以通過將熒光團附著于生物標志物而檢測生物標志物的裂解，當生物標志物未裂解時該熒光團保持淬滅，但當生物標志物裂解時，該熒光團發(fā)出熒光。或者，可以施用經(jīng)過修飾使得某些氨基酸之間的酰胺鍵不可裂解的全長形式的生物標志物選擇性結合或“捕獲”在該位點體內(nèi)裂解全長生物標志物的細胞蛋白酶。篩選和鑒定蛋白酶及其靶的方法詳細記錄于科學文獻中，如Lopez-Ottin et al.(Nature Reviews，3509-519(2002))。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了治療與截短的生物標志物的水平增加相關的疾病如癌癥，或減少其進展的可能性的方法。例如，在鑒定了裂解表中的全長生物標志物一種或多種蛋白后，可以篩選組合文庫，得到抑制鑒定的蛋白的裂解活性的化合物。篩選所述化合物的化學文庫的方法是本領域公知的。參見，例如，Lopez-Otin et al.(2002)?；蛘撸梢曰谘“逑嚓P生物標志物的結構設計抑制性化合物。
在臨床水平，篩選測試化合物包括在受試者暴露于測試化合物之前和之后從測試受試者獲得樣品。可以測量和分析列于表中的一種或多種血小板相關生物標志物在樣品中的水平，以確定暴露于測試化合物后生物標志物的水平是否改變?？梢酝ㄟ^此處描述的質(zhì)譜法分析樣品，或者可以通過本領域技術人員公知的合適方法分析樣品。例如，可以采用放射或熒光標記的特異性結合于生物標志物的抗體，通過蛋白印跡直接測量表中列出的一種或多種生物標志物的水平。
實施例 循環(huán)血小板含有多種能夠修飾血管發(fā)生過程的調(diào)節(jié)劑。血小板附著于異常表面并且將其內(nèi)容物釋放在局部環(huán)境中的能力使得它們是局部血管發(fā)生因子送遞的高度需要的形式。在血管發(fā)生的生理狀況中，生長因子的這種嚴格局部釋放代表了傷口愈合或再生的高度靈活、安全和有效的系統(tǒng)；但是在病理狀況中，如在癌癥、慢性炎性病癥或血管異常中，它代表了生長的關鍵旁分泌放大環(huán)。
血小板具有許多針對該受控的、高度排序和局部反應性活動的機制i)血小板微粒(PMPs)在腫瘤進展中脫落腫瘤血管系統(tǒng)使得血小板活化是公知的，這主要是因為它的開口和高度不規(guī)則的內(nèi)皮細胞表面；含有VEGF、bFGF和其它生長因子的PMPs釋放到系統(tǒng)循環(huán)中，而沒有任何明顯的贅生物周圍的血栓形成事件。
ii)α-顆粒儲存能夠反應于局部刺激而釋放的生長因子和抑制劑血小板顆粒的內(nèi)容物依賴于宿主的局部環(huán)境，因此反應“腫瘤記錄”。
iii)一種以上的過程參與腫瘤進展和播散PMPs保持生長因子的低水平連續(xù)送遞，α-顆粒提供促血管發(fā)生信號的快速和局限的放大。
我們將血管發(fā)生生長因子的血小板譜和抑制劑稱作“血小板記錄(register)”。該血小板記錄可以用于診斷和治療目的。
我們的實驗目的是1.鑒定由血小板轉(zhuǎn)移的血管發(fā)生或腫瘤相關生長因子或抑制劑，即腫瘤譜。
2.鑒定血小板中的儲存系統(tǒng)，即，顆粒、致密顆?；蚰ゎw粒。
3.研究運輸這些化合物的機制(即確定顆粒釋放的刺激物)。
4.確定PMP是血小板活性的主要機制的臨床狀況和血小板聚集和脫顆粒對局部因子釋放是必須的狀況。
研究階段 第1階段分離來自不攜帶腫瘤的SCID和C57B1小鼠的血小板樣品，并且進行譜分析。
第2階段將來自不攜帶腫瘤的SCID小鼠的血小板分離成膜和細胞質(zhì)級分，并且將因子含量與全血小板提取物比較，以確定特定蛋白的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。
第3階段將攜帶腫瘤的SCID小鼠的蛋白譜與純腫瘤細胞提取物的蛋白譜進行比較，以便將轉(zhuǎn)運的生長因子和抑制劑進行關聯(lián)。
第4階段將來自攜帶靜息(非血管發(fā)生性)腫瘤的SCID小鼠的血小板樣品與來自攜帶快速生長(血管發(fā)生性)腫瘤的SCID小鼠的血小板樣品與相同背景的年齡匹配的不攜帶腫瘤的小鼠進行比較。
第5階段將來自攜帶靜息(非血管發(fā)生性)腫瘤的SCID小鼠的血漿與來自攜帶快速生長(血管發(fā)生性)腫瘤的SCID小鼠的血漿與相同背景的年齡匹配的不攜帶腫瘤的小鼠進行比較(血漿用作連續(xù)釋放到循環(huán)中，即沒有血小板聚集和脫顆粒的因子的替代物)。
第6階段將來自攜帶靜息(非血管發(fā)生性)腫瘤的SCID小鼠的血清與來自攜帶快速生長(血管發(fā)生性)腫瘤的SCID小鼠的血清與相同背景的年齡匹配的不攜帶腫瘤的小鼠進行比較(血清用作在活化的血小板聚集和脫顆粒時釋放的因子的替代物)。
以前的報道提示了血小板包含并轉(zhuǎn)運蛋白，并且該蛋白沿著濃度梯度從血漿進入血小板。但是，我們的結果顯示，相對小的VEGF來源，如Matrigel團或顯微水平(0.5-1mm3)的腫瘤可以將它們的VEGF直接貢獻到血小板，而不升高VEGF的血漿水平。最重要的是，顯微水平的、臨床不能檢測的腫瘤的存在足以誘導攜帶人脂肪肉瘤的SCID小鼠的血小板挑選特異性血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑，并且將“靜息”蛋白譜改變?yōu)椤胺从衬[瘤的”譜。
我們進一步證實i)在腫瘤生長存在下螯合在血小板中蛋白主要是血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑，如VEGF、bFGF、PDGF、PF4、內(nèi)皮抑制素、制管張素和腫瘤抑制素；而不是最豐富的血漿蛋白，如白蛋白，和ii)血小板中的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的水平根據(jù)腫瘤或其它血管發(fā)生因子源的存在而改變。
我們假設當疏乎腫瘤標志物的血漿和血清水平時，在腫瘤發(fā)生早期，由致癌轉(zhuǎn)變導致的過量血管發(fā)生生長因子反映在血小板中。在此處提出研究中，我們證實了血小板在體內(nèi)和體外積累選定蛋白的能力，并且顯示用一種血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑選擇性替代另一種血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑。由于諸如生長因子、抑制劑、輔因子和細胞因子的多種調(diào)節(jié)劑參與腫瘤進展，我們采用了高通量SELDI-ToF MS(表面增強激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜)來分析純化的血小板和血漿的蛋白譜。該技術使得能夠在一個時間對大量臨床樣品進行質(zhì)譜分析，并且提供了用于比較完整血小板蛋白組的有效、高度可再現(xiàn)的途徑。
比較攜帶人類脂肪肉瘤的腫瘤異種移植物的年齡匹配的健康SCID小鼠同窩動物與假注射的不攜帶腫瘤的動物的血小板譜。與許多關于包含在血小板中的蛋白的報道一致(10-12)，我們發(fā)現(xiàn)血小板中共同存在內(nèi)皮增殖和遷移的至少21種正調(diào)節(jié)劑和內(nèi)皮增殖和遷移的至少15種負調(diào)節(jié)劑。對來自攜帶人類腫瘤異種移植物的小鼠的相應血漿樣品的分析證明在這些調(diào)節(jié)蛋白中沒有顯著差異。
該研究的新發(fā)現(xiàn)是腫瘤存在下血小板譜的定制。我們示出了數(shù)據(jù)，表明血小板具有檢測亞臨床腫瘤生長的能力，通過選擇性攝取血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑在腫瘤發(fā)生早期反應于腫瘤存在，螯合這些蛋白并且保護其在循環(huán)中免受降解，并且很可能促進這些蛋白轉(zhuǎn)運到腫瘤部位。血小板作用的這種定位可能增強腫瘤血管發(fā)生而避免許多宿主監(jiān)督控制，或，例如在腫瘤靜息的情況下，保持血管發(fā)生抑制劑的必要水平，以使腫瘤生長停滯。
血小板代表了運輸血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的非常精密的系統(tǒng)，并且它們的蛋白譜的臨床可行分析給我們提供了比目前更早診斷癌癥的能力。
方法 由新分離的血小板體外攝取內(nèi)皮抑制素 通過在200g將檸檬酸化的全血離心20分鐘，從健康人類志愿者的血液中分離富含血小板的血漿(PRP)。將富含血小板的血漿轉(zhuǎn)移到新的聚乙烯試管中，在室溫下在輕柔的搖桿上與濃度增加的人重組內(nèi)皮抑制素(EntreMed Inc.，Rockville，MD)一起溫育1小時。溫育后，在800g離心PRP，以沉淀血小板，保留上清液(含很少血小板的血漿[PPP])用于隨后通過ELIZA進行分析。然后將血小板輕柔重懸于含有1U/ml PGE2的Tyrodes緩沖液中，再次沉淀。以此方式重復洗滌兩次，然后通過用Triton X離心除去血小板的膜級分，裂解血小板以進行標準SDS-PAGE分析。用50mM Tris HCL，100-120mM NaCl，5mMEDTA，1％Igepal和蛋白酶抑制劑片(完全的TM混合物，BoehringerManheim，Indianopolis，IN)裂解血小板。用標準Bradford法(Bio-RadLaboratories Inc.，Hercules，CA)使蛋白濃度相等，然后將等量的內(nèi)皮抑制素蛋白標準物或血小板蛋白裂解物與樣品緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合，并且加載到12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)上之后，用7％的乳封閉混合物，與以下抗體一起溫育抗人內(nèi)皮抑制素(courtesy of Kashi Javaherian，Childrens Hospital，Boston)，抗人VEGF(1∶1000，Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA)，或抗人bFGF(1∶1000，Upstate USA Inc.，Charlottesville，VA)。然后用Super SignalWest Pico化學發(fā)光試劑盒(Pierce Biotechnology inc.，Rockford，IL)和放射自顯影術檢測陽性信號。
血小板對125I標記的VEGF的體內(nèi)攝取 根據(jù)以前建立的方法進行VEGF蛋白的碘化。簡言之，將用10μl磷酸鈉緩沖液(SPB，0.2M NaHPO4，pH7.2)預溫育的IodoBeads(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)與10μg不含載體的rmVEGF(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)和1mCu的125碘一起溫育。用150μl磷酸鈉緩沖液進一步稀釋樣品，通過含有PBS中的2％明膠的15ml的預平衡的NADTM5柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。然后收集15個250μl的級分。在Gamma 5000Beckman Iodine 125(Beckman Instruments，F(xiàn)ullerton，CA)上對每個級分的放射性進行定量，合并含有最大量125I標記的VEGF(共500μl)的兩個級分，用于實驗當天進行的Matrigel測定中。簡言之，在植入Matrigel團前一天將C57Bl/6小鼠的左脅腹去毛，以避免微弱的皮膚炎癥反應。實驗當天，500μl溶于緩沖液的125I-VEGF與500μl不含生長因子的Matrigel(B & D Biosciences，Bedford，MA)混合，并且將100μl該混合物皮下注射到每只小鼠的左脅腹。三天后用吸入麻醉法(1L氧氣中的2％異氟烷)麻醉小鼠，通過直接心臟穿刺將1ml全血直接吸入檸檬酸化的注射器(1％的檸檬酸鈉終濃度，1/10v/v)，而不打開胸腔。
以兩個離心步驟分離血小板第一個步驟是在200g，以分離富含血小板的血漿(PRP)，然后在800g離心，以產(chǎn)生血小板沉淀和含很少血小板的血漿級分(PPP)。在γ計數(shù)器上對每個血小板樣品的放射性進行定量。校正所得值的組織重量差異，并且表示為每克組織每分鐘的計數(shù)[cpm/g組織]。
腫瘤細胞和異種移植物模型 將在免疫缺陷小鼠中形成非血管發(fā)生性、顯微水平、靜息腫瘤或血管發(fā)生性快速生長腫瘤的非血管發(fā)生性和血管發(fā)生性人脂肪肉瘤(SW872)亞克隆的腫瘤異種移植物用作體內(nèi)實驗系統(tǒng)7。也將其它的人類腫瘤，包括乳腺癌、結腸癌、成膠質(zhì)細胞瘤和骨肉瘤亞克隆到非血管發(fā)生和血管發(fā)生性腫瘤細胞群。所有的人類非血管發(fā)生性腫瘤亞克隆在預定的時間都在體內(nèi)進行了向血管發(fā)生表型的轉(zhuǎn)變，所述預定時間對于脂肪肉瘤是133天的中值±2周，對于乳腺癌是80天。但是，僅僅在脂肪肉瘤中，血管發(fā)生轉(zhuǎn)變發(fā)生在100％的非血管發(fā)生性腫瘤中，此處用該腫瘤證明差異。脂肪肉瘤(SW872)腫瘤細胞系亞克隆均來自單細胞克隆4是非血管發(fā)生性的，并且在變成血管發(fā)生性并且進行迅速腫瘤擴展前保持在靜息和顯微水平的中值是大約133天。克隆9在植入時是血管發(fā)生性的，并且迅速擴展?？寺?和克隆9的體內(nèi)和體外腫瘤細胞增殖速度是相同的。但是，腫瘤細胞在體內(nèi)的凋亡速度在非血管發(fā)生性克隆4中是很高的，在血管發(fā)生性克隆9中是很低的(Folkman/Almog，提交用于發(fā)表)。
37℃下在潮濕的5％CO2溫育器中在含有5％熱滅活的胎牛血清(HyClone，Logan，UT)、1％抗生素(青霉素、鏈霉素)和0.29mg/mlL-谷氨酰胺的DMEM中培養(yǎng)所有細胞系。對于注射到小鼠中，在磷酸緩沖鹽水(PBS)(Sigma，St.Louis，MO)中漂洗80-90％匯合的腫瘤細胞，短暫胰蛋白酶消化，并且懸浮于無血清的DMEM中。在DMEM中洗滌細胞兩次，將它們的最終濃度調(diào)節(jié)到5×106個活細胞/200μl。
在來自Massachusetts General Hospital(MGH)，Boston，MA的六周齡雄性SCID小鼠脅腹部皮下注射來自單克隆的5×106個細胞(在0.2ml中)。所有實驗都是采用研究動物護理和使用委員會批準的方案，按照波士頓兒童醫(yī)院指南進行的。
血小板、血漿和腫瘤處理和蛋白譜分析 通過直接心臟穿刺到檸檬酸化的聚乙烯試管(1％的檸檬酸鈉終濃度，1/10v/v)從麻醉的小鼠收集血液，立即在200g離心。然后將上面的相，即PRP轉(zhuǎn)移到新試管，通過在800g進一步離心而分離血小板。用SELDI-TOF技術(Ciphergen，F(xiàn)reemont，California)獨立地分析分離的血小板沉淀(P)和含很少血小板的血漿(PPP)上清液。
在9M脲(U9)，2％CHAPS(3-[(3-氯酰氨基苯基)二甲基氨基]-1-丙磺酸酯)，50mM TrisHCl，pH9中處理來自每只小鼠的血小板沉淀；在4℃以10,000g離心1分鐘，按照下文對血小板提取物進行分級分離。對于每只小鼠，用40μlU9緩沖液(9M脲，2％CHAPS，50mMTrisHCl，pH9)使20μlPPP變性，通過在表達差異作圖(EDM)血清分級分離方案(Ciphergen，F(xiàn)remont，CA)后改良的陰離子交換色譜對純血漿提取物進行分級分離。在裝有DPCMicromix 5振蕩器的Beckman Biomek2000實驗室工作臺上的96孔過濾板上進行分級分離。將20μl血小板和腫瘤提取物的等分物和用100μl50mM Tris-HClpH9稀釋的60μl變性血漿轉(zhuǎn)移到過濾底96孔微量滴定板中，所述微量滴定板中預先加入了BioSepra Q CeramicHyperD F吸附珠，所述珠用50mM TrisHCl，pH9再水化，并且用50mM Tris-HCl，pH9預平衡。用多屏幕真空匯集管(Millipore，Bedford，MA)從過濾板除去所有液體。4℃下溫育30分鐘后，將流通液收集為級分I。用2×100μl以下緩沖液溫育過濾板，以產(chǎn)生以下級分1M脲，0.1％CHAPS，50mMNaCl，2.5％乙腈，50mM Tris-HCl(pH7.5，級分II)；1M脲，0.1％CHAPS，50mM NaCl，2.5％乙腈，50mM醋酸鈉(pH5.0，級分III)；1M脲，0.1％CHAPS，50mM NaCl，2.5％乙腈，50mM醋酸鈉(pH4.0，級分IV)；1M脲，0.1％CHAPS，500mM NaCl，2.5％乙腈，50mM檸檬酸鈉(pH3.0，級分V)和33.3％異丙醇/16.7％乙腈/8％甲酸(有機相，級分VI)。
用弱陽離子交換色譜蛋白陣列(WCX2 ProteinChipTM陣列；Ciphergen，F(xiàn)remont，CA)進行ProteinChip陣列上的表達差異作圖(EDM)，這是通過將樣品級分加載到96孔生物處理器上，并且用50mM醋酸鈉，0.1％辛基葡糖苷(Sigma，St.Louis，MO)，pH5.0平衡。將每個陣列點上在100μl相同緩沖液中的40μl陰離子交換色譜級分的進一步稀釋液溫育1小時。用100μl 50mM醋酸鈉，0.1％辛基葡糖苷pH5.0洗滌陣列點。用水漂洗后，在每個陣列點加入2×1μl芥子酸基質(zhì)溶液。
對于蛋白譜分析，將所有在各自的緩沖液中以1∶2.5稀釋的級分用于預平衡ProteinChip陣列。該步之后是用Protein BiologySystem II SELDI-ToF質(zhì)譜儀(Ciphergen，F(xiàn)remont，CA)讀數(shù)。用蛋白標準物(Ciphergen，F(xiàn)remont，CA)作為校準物，對讀數(shù)器進行每日外部校準。用ProteinChip軟件Biomarker Edition3.2.0版(Ciphergen，F(xiàn)remont，CA)處理譜?？鄢€后，通過總離子電流法對譜進行歸一化。用Biomark Wizard軟件(Ciphergen，F(xiàn)remont，CA)，在信噪比為3的條件下進行峰檢測。
通過在IgG旋轉(zhuǎn)柱上進行親和色譜和通過反相色譜進一步純化候選蛋白生物標志物。采用正常相(NP)ProteinChip陣列監(jiān)測每個步驟的純度。用5mM DTT pH9還原主級分，用50mM碘乙酰胺在暗處烷基化2小時。最終的分離是在16％Tricine SDS-PAGE凝膠上進行。用膠體藍染色試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)對凝膠進行染色。切下選定的蛋白帶，室溫下在劇烈振蕩下用200μl 50％甲醇/10％乙酸洗滌30分鐘，用100μl乙腈(ACN)脫水15分鐘，用70μl 50％甲酸、25％ACN、15％異丙醇和1.0％水提取2小時。通過在正常相ProteinChip陣列上分析2ul而在此證實提取物中的候選生物標志物。37℃下用20μl溶于50mM碳酸氫銨(pH8)的100ng/μl的修飾的胰蛋白酶(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)消化剩余的提取物3小時。在裝有Ciphergen PCI-1000ProteinChip界面的QSTAR質(zhì)譜儀上獲得單MS和MS/MS譜。在CHCA存在下，在NP20 ProteinChip陣列上分析1μl每種蛋白酶消化物的等分物。以單MS模式收集從0.9-3kDa的譜。觀察譜后，選擇特定離子，并且導入碰撞室以進行CID片段化。使CID譜數(shù)據(jù)進入數(shù)據(jù)庫采集工具Mascot(Matrix Sciences)以進行鑒定。
免疫熒光顯微鏡 從Becton Dickinson Biosciences獲得抗VEGF小鼠單克隆抗體，以5μg/ml使用。兔抗β1微管蛋白抗血清(由Brigham and Women′sHospital，Boston的Nicholas Cowan饋贈)以1∶1000的稀釋度使用。從Jackson Immuno Research Laboratories(West Grove，PA)購買具有最小跨物種反應性的Alexa 488抗兔和Alexa 568抗小鼠第二抗體。在裝有100X目鏡(NA 1.4)和100-W汞燈的Zeiss Axivert 200顯微鏡上分析細胞。用Orca II冷卻的帶電耦合裝置(CCD)照相機(Hamamatsu)采集圖像。在Metamorph軟件控制下進行電子柵和圖像采集。
通過加入3.7％的甲醛將靜息血小板在懸浮液中固定20分鐘。將血小板附著于放置在12孔微量滴定板的孔中的聚賴氨酸包被的蓋玻片上，并且在250g離心5分鐘。對于激動劑誘導的活化，將血小板以相同方式沉淀在蓋玻片上，加入1U/ml凝血酶5分鐘。在3.7％的甲醛中將活化的血小板固定20分鐘。在含有0.5％Triton X-100的Hank溶液中透化樣品，并且用PBS洗滌。在PBS+1％BSA中封閉標本過夜，室溫下在第一抗體中溫育2-3小時，洗滌，用合適的第二抗體處理1小時，在1％PBS中再次重復洗滌。以PBS+1％BSA中的1mg/ml使用第一抗體，以相同緩沖液中的1∶500稀釋度使用第二抗體。相同地處理了對照，但是省略了第一抗體。
結果 血小板在體外對血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白的活躍和選擇性攝取。
用濃度增加的人重組內(nèi)皮抑制素溫育的血小板以劑量依賴性方式攝取蛋白(圖1，上面的印跡)。半定量SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，隨著內(nèi)皮抑制素在血小板中的加載增加，它導致其它天然血小板蛋白如VEGF和bFGF的細胞質(zhì)重新分布(圖1，下面的兩個印跡)。由于血小板表面表達高水平的非特異性蛋白結合位點，通過在蛋白裂解前用Triton-X100離心除去血小板膜級分。為了發(fā)現(xiàn)血小板對蛋白的攝取過程是隨機現(xiàn)象還是螯合的內(nèi)在機制，我們隨后通過以預定的序貫方式加入指定蛋白而攻擊血小板。我們發(fā)現(xiàn)，用內(nèi)皮抑制素預先加載的血小板在加入測定時表現(xiàn)出受限制的VEGF攝取，導致內(nèi)皮抑制素的細胞質(zhì)水平的一些，但不是完全的減少。相反，內(nèi)皮抑制素能夠?qū)е骂A先加載的VEGF的更完全的再分布(圖2)。
血小板在體內(nèi)對血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白的活躍和選擇性攝取。
為了證明蛋白血小板加載的過程不是體外偽跡，并且為了證明它準確模擬體內(nèi)現(xiàn)象，我們將含有125I標記的VEGF的Matrigel團(每100μl Matrigel 50-600ng標記的VEGF)皮下植入小鼠中，然后125I-VEGF攝取到血小板中(圖12)。125I-VEGF以劑量依賴性方式優(yōu)先在血小板內(nèi)聚集，而血漿中不出現(xiàn)標記的細胞因子(圖29)。盡管鼠血小板的短半衰期大約是4-7天，但在最多達3周的時間中在血小板但沒有在血漿中檢測到125I-VEGF(數(shù)據(jù)未示出)。
在顯微水平的腫瘤存在下血小板在體內(nèi)對血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白的活躍和選擇性攝取。
為了確定由小鼠皮下組織中的顯微水平的腫瘤分泌的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白是否能夠被血小板攝取(類似于血小板從植入的Matrigel團攝取VEGF)，按照上文和以前報道的7所述使用人脂肪肉瘤(SW872)的亞克隆。因此，我們在腫瘤植入后32天使用表達差異作圖系統(tǒng)(Ciphergen，F(xiàn)remont，CA)表征和證實候選蛋白標志物。我們比較了注射了200μl無血清培養(yǎng)基(載體)或脂肪肉瘤細胞系的非血管發(fā)生或血管發(fā)生克隆的5×106個細胞的細胞懸浮液的5只小鼠的血小板和血漿蛋白組。為了比較獨立分析的表達圖，將實驗重復兩次。(圖30描述了凝膠觀形式中血小板血管發(fā)生蛋白組的典型分析，以及峰強度的各個統(tǒng)計學分析)。VEGF、bFGF、PDGF、內(nèi)皮抑制素、制管張素、腫瘤抑制素和血管發(fā)生的其它調(diào)節(jié)劑在來自攜帶非血管發(fā)生性、靜息的、顯微大小的脂肪肉瘤的小鼠的血小板中顯著增加(圖30)。血小板相關蛋白以選擇性和可定量的方式攝取，明確表明血小板裂解物中VEGF、bFGF、PDGF和血小板因子4的濃度增加，但相應血漿中沒有增加。只要存在腫瘤，血小板保持高濃度的螯合的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白血小板。盡管在第32天時血管發(fā)生性脂肪肉瘤(約1cm3)比非血管發(fā)生性靜息脂肪肉瘤(＜1mm3)大約100倍，攜帶非血管發(fā)生性腫瘤的小鼠的血小板含有相似地增加水平的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白。此時，來自任意腫瘤類型的血漿都不含這些蛋白。但是在大約30天中，隨著血管發(fā)生性腫瘤進展性生長到大約2cm3，血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白也開始出現(xiàn)在血漿級分中。相反，這些蛋白從不出現(xiàn)在攜帶非血管發(fā)生性顯微水平腫瘤的血漿中。
用ANOVA檢驗平均峰強度+/-SE，得到組間差異。對VEGF、bFGF和PDGF的峰強度值的分析發(fā)現(xiàn)無腫瘤和攜帶脂肪肉瘤的動物之間這些蛋白的血小板濃度的顯著差異。此外，來自攜帶非血管發(fā)生性脂肪肉瘤的小鼠的血小板含有比在來自攜帶人類乳腺癌的小鼠的血小板中積累的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白高水平的不同血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白。
血小板中的VEGF分布 在該研究開始時，不知道與血小板相關的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白是在血小板的膜上平均分布，還是在血小板體的細胞質(zhì)中分布，還是它們組織在特定顆粒儲存體中。為了區(qū)別這些可能性并建立VEGF的亞細胞定位，我們在用微管蛋白和VEGF的抗體染色的固定和透化的靜息血小板上使用了雙標記免疫熒光顯微鏡。如所預期的，微管蛋白在靜息血小板中的邊緣微管帶中濃集，該結構限定了血小板外周。但是，抗VEGF抗體一致地標記了在血小板細胞質(zhì)中分布的具點的、小泡樣結構(圖7，A-C)。共焦顯微鏡圖像的4μm切片的連續(xù)堆積發(fā)現(xiàn)了血小板細胞質(zhì)內(nèi)的具點模式，并且支持免疫活性材料的顆粒性質(zhì)。
我們對從凝血酶活化的血小板釋放的分析表明，通過用內(nèi)皮抑制素(圖28)或用諸如ADP的溫和激活劑(圖4)加載血小板，VEGF不釋放到血漿中。凝血酶(而不是ADP)能夠釋放一些，但不是全部的血小板相關VEGF(圖4，上圖)。這兩種激活劑(凝血酶或ADP)都不能釋放bFGF。因此我們假設，在激動劑誘導的血小板活化過程中，血小板相關的生長因子是重新分布的，但繼續(xù)保留在血小板中。為了檢驗該概念，我們用熒光標記的毒傘素和VEGF雙染色了活化的血小板。通過板足和絲足的形成明確顯示了預期的血小板形狀改變。VEGF保持可見的，其是作為活化的伸展的血小板中的具點形式，與甚至在激動劑誘導的活化后其保持與血小板締合的概念一致(圖7，F(xiàn))。血小板活化后，VEGF優(yōu)先沿著絲足并且沿著板足外周重新分布。
討論 這些結果表明，循環(huán)血小板攝取小鼠中的人腫瘤產(chǎn)生的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白。這些條件下攝取的蛋白與正常血小板中包含的大約30種血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白，即bFGF、VEGF、內(nèi)皮抑制素、制管張素等基本相同。我們將該選定的蛋白組命名為“血小板血管發(fā)生蛋白組”以強調(diào)生理條件下反應蛋白濃度的穩(wěn)定性。在正常條件下，該蛋白組的成員似乎改變非常小。但是，在攜帶腫瘤的小鼠中，腫瘤誘導的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白的攝取顯著改變血小板血管發(fā)生蛋白組，并且只要宿主中存在存活的腫瘤，螯合的腫瘤來源的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白(即VEGF或bFGF等)的增加的濃度保持升高。
循環(huán)血小板可以攝取和螯合從小腫瘤團塊，即，小于1mm3的癌釋放的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白。這相當于重量超過20,000毫克的宿主小鼠中小于1毫克的腫瘤團塊。這種大小的腫瘤至少目前不能臨床檢測。實驗上，它可以用生物發(fā)光進行鑒定，即，用植入前用綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染或感染了熒光素酶的腫瘤細胞進行鑒定。這些腫瘤是從皮下或原位植入的克隆的非血管發(fā)生性人類癌細胞產(chǎn)生的，并且可以在立體照相放大時手術暴露。它們在數(shù)月或一年以上的時間中保持靜息和無害，直到在可預測的時間，它們的可預測的百分比轉(zhuǎn)變?yōu)檠馨l(fā)生表型，并且開始以與它們的血管發(fā)生對應物相似的速度生長。非血管發(fā)生性腫瘤從不自發(fā)代謝，但其中的腫瘤細胞在注射到尾靜脈中時將在肺中形成顯微水平的良性靜息轉(zhuǎn)移灶。相反，在血管發(fā)生轉(zhuǎn)變后，自發(fā)轉(zhuǎn)移不是非常見的(20)。這些非血管發(fā)生性靜息腫瘤中的腫瘤細胞進行高速增殖，其由高速凋亡平衡，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致，即與血管發(fā)生對應物相比，非血管發(fā)生克隆中的內(nèi)皮抑制素水平增加(圖30)。以前描述過由于阻斷血管發(fā)生而導致的腫瘤靜息(21，22)。
由非血管發(fā)生性顯微水平的腫瘤分泌的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白螯合在血小板中，不出現(xiàn)在血漿中，并且只要腫瘤存在，就持續(xù)加入血小板血管發(fā)生蛋白組中的蛋白基線水平。當非血管發(fā)生性腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)檠馨l(fā)生性表型并且開始擴展其腫瘤團塊時，由腫瘤分泌的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白也可以出現(xiàn)在血漿中。
腫瘤來源的血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白的血小板螯合涉及一個過程，通過該過程，這些蛋白被循環(huán)血小板內(nèi)化，并且通過仍然有待闡明的機制重新分布到血小板內(nèi)的不同區(qū)室。血小板儲存區(qū)室由α-顆粒、致密顆粒和溶酶體組成，其中α-顆粒形成最大的區(qū)室。很多血小板蛋白在巨核細胞中合成，其它明顯存在于外周。諸如PF4和血小板反應蛋白的血小板特異性蛋白由包括巨核細胞的很多細胞合成，并且以400倍的濃度在血小板中濃集。其它如因子V、血小板反應蛋白或P-選擇蛋白由非巨核細胞合成，并且由血小板攝取。最明確的血小板非選擇性蛋白是纖維蛋白原，其由肝細胞合成，并且由血小板α-顆粒攝取(14-16)。血小板儲存區(qū)室的顯著靈活性使我們確信血小板參與腫瘤的擴增和維持。我們發(fā)現(xiàn)，大濃度的VEGF、bFGF或內(nèi)皮抑制素可以被血小板攝取、內(nèi)化和濃集。新的血小板暴露于濃度增加的內(nèi)皮抑制素，替代來自它們的細胞質(zhì)儲存的內(nèi)皮生長因子，如bFGF和VEGF(圖1)，表明這些蛋白的流體的、高度可接受的運輸。
蛋白的血小板攝取的調(diào)節(jié)存在至少兩種可能性。血小板的儲存區(qū)室可能能力有限，并且必須替代蛋白以容納新蛋白的攝取，或更可能地，由特定的血小板調(diào)節(jié)的對因子的親和力控制攝取。后一模型將更符合以下發(fā)現(xiàn)，即血小板的順序加載導致選擇性攝取，并表示所有蛋白都以相等的效力被替代。盡管內(nèi)皮抑制素在預先加載了VEGF的血小板中攝取是完全的、不受阻礙的(圖2的第1道)，并且導致預先加載的VEGF的重新分布(圖2的第2道)，相反的實驗導致了預先加載的內(nèi)皮抑制素的不完全的重新分布。
一個重要的發(fā)現(xiàn)是攜帶腫瘤的小鼠的血漿中血管發(fā)生調(diào)節(jié)蛋白的相對缺乏。這種最常見的臨床分析物表明血管發(fā)生蛋白的最小差異或無差異。這表明，與通常的觀點相反，血小板可能不進行生長調(diào)節(jié)劑不受控制地釋放到循環(huán)中的脫顆粒過程，而是在腫瘤或傷口部位在嚴格控制下釋放這些調(diào)節(jié)劑。這與我們用VEGF和bFGF ELISA對從活化的血小板的釋放速度的體外分析一致，其中在激動劑誘導的血小板活化中釋放了最小量的VEGF，bFGF則完全沒有釋放(圖28)。
如果如此，我們預測顯著量的VEGF將在活化后保持定位在活化的血小板。采用利用了抗固定和透化的靜息血小板的微管蛋白和VEGF的抗體和活化的血小板的毒傘素和VEGF的雙標記免疫熒光顯微術，我們檢驗了VEGF的細胞內(nèi)定位?？筕EGF一致地標記了靜息血小板的細胞質(zhì)中具點的、小泡樣結構，表明免疫活性材料的顆粒性質(zhì)。在活化的血小板的雙標記免疫熒光上，VEGF沿著絲足和沿著板足的外周重新分布(圖7)，與甚至在激動劑誘導的活化后其保持與血小板締合的概念一致。通過板足和絲足的形成明確顯示了預期的血小板形狀改變，并且通過熒光毒傘素顯現(xiàn)。這種重新分布的模式指出了VEGF在血小板的邊緣，以便隨組織直接交換這些蛋白的可能性，并且可以解釋組織蛋白酶在腫瘤中的導入。還不清楚哪些特異性蛋白酶可以作用于從腫瘤相關血小板聚集物釋放血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑。
我們已經(jīng)證明了血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的血小板攝取過程是高度特異性的，反映了腫瘤狀態(tài)，即靜息與臨床擴展，并且在臨床可檢測的腫瘤之前就充分存在。我們認為，系統(tǒng)循環(huán)中的這種新的區(qū)室優(yōu)于血管發(fā)生標志物的血漿和血清分析，并且提供了用于非常早期癌癥診斷的穩(wěn)定、靈敏和可靠方法?！把“逖馨l(fā)生蛋白組”可以用作腫瘤血管發(fā)生轉(zhuǎn)變的早期記錄，非常類似脂質(zhì)譜用于鑒定具有動脈粥樣硬化和心肌梗塞的風險的患者。這種預測的生物標志物可以篩選具有發(fā)生癌癥的風險的患者。與其它生物標志物一起使用(23)，我們可以在臨床癥狀前診斷癌癥復發(fā)年，或改進患有BRCA癌癥基因突變和發(fā)生乳腺癌的高風險的女性的監(jiān)測。
最近對相對無毒的血管發(fā)生抑制劑的開發(fā)可以給我們提供“處理生物標志物”而不“看見”腫瘤的機會，也就是說，治療具有無病癌癥的患者的機會(24)。在美國和27個其它國家已經(jīng)批準了一些血管發(fā)生抑制劑，其它的也已經(jīng)處于晚期臨床試驗。醫(yī)學實踐(其中血液或尿指導治療，而不需要解剖定位)中的類似性包括治療懷疑的感染或用降脂藥劑防止將來的心肌梗塞。
此處報道的結構揭示了新的血小板生物，其可以用于了解很多血管發(fā)生依賴性疾病的再現(xiàn)、發(fā)生、修復，和理解所述疾病。
在腫瘤或創(chuàng)傷對內(nèi)皮細胞，即血管襯進行分布后，循環(huán)血小板在該位點定位、擴增和持續(xù)到促凝反應。血管損傷部位的血小板附著和聚集不僅僅臨時栓塞受損的血管，也將隨后的促凝事件定位到損傷部位，并且防止凝血的系統(tǒng)活化。令人感興趣的是，我們發(fā)現(xiàn)一些定位作用在腫瘤部位對血管發(fā)生刺激物進行定位、擴增和持續(xù)。
血小板儲存區(qū)室由α-顆粒、致密顆粒和溶酶體組成，其中α-顆粒形成最大的區(qū)室。儲存的蛋白在巨核細胞中合成(血小板特異性蛋白如PF4和血小板反應蛋白)，由包括巨核細胞的很多細胞合成，并且以最多400倍的濃度在血小板中濃集(血小板選擇性蛋白，如因子V、血小板反應蛋白或P選擇蛋白)，或由其它細胞合成，并且由血小板攝取(血小板非選擇性蛋白如纖維蛋白原(14-16))。后一區(qū)室的顯著靈活性使我們確信在臨床出現(xiàn)癌癥前，血小板可能在腫瘤進展早期參與腫瘤的擴增和維持。
我們首先通過用血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑離體“加載”血小板檢驗了該假設，并且發(fā)現(xiàn)大濃度的VEGF、bFGF或內(nèi)皮抑制素可以攝取、內(nèi)化和濃集在血小板中。僅僅通過SDS-PAGE測定在高于生理水平的內(nèi)皮抑制素中暴露1小時的新血小板的細胞質(zhì)部分，我們發(fā)現(xiàn)隨著血小板中內(nèi)皮抑制素濃度增加，諸如bFGF和VEGF的內(nèi)源生長因子水平減少(圖1)。我們進行了努力，消除以下可能性，即血小板裂解物中內(nèi)皮抑制素水平的增加是由于通過排出膜蛋白而對血小板表面進行的非特異性結合。我們假定了調(diào)節(jié)這些蛋白的血小板攝取存在至少兩種可能性。血小板的儲存區(qū)室可能具有有限的能力，必須替代一些蛋白，以便新蛋白被攝取，或者通過一些特異性血小板調(diào)節(jié)的親和力控制攝取。后者，即更具有選擇性的機制，似乎是更有可能的過程，因為用蛋白對血小板的序貫加載似乎不受蛋白濃度梯度的影響，并且因為并不是所有蛋白都以相同效力替代。例如，與內(nèi)皮抑制素加載對照相比，內(nèi)皮抑制素在預先加載了VEGF的血小板中的攝取不僅是完全的、不受阻礙的(圖2的第1道)，并且導致預先加載的VEGF的完全替代(圖2的第2道)。相反的實驗，即，VEGF在預先加載了內(nèi)皮抑制素的血小板中的加載與對照相比也增強，但導致預先加載的內(nèi)皮抑制素的較不完全的替代。
我們?nèi)缓罄^續(xù)證明體內(nèi)模型中血小板對生長因子的選擇性攝取。我們將125I標記的富含VEGF的不含生長因子的Matrigel團植入健康的未處理的免疫活性小鼠，并且比較125I在高度血管化的器官如腎、脾和肝中的分布，已知這些器官組成型表達VEGF，其分布在血液中。如圖3所示，碘化的VEGF以比其在血漿中濃度過量多倍的濃度在血小板中濃集。這表明血小板實際上可以通過送遞血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑局部增強血管發(fā)生。這種送遞在諸如創(chuàng)傷和組織修復的生理狀況(其中完整的反饋機制迅速滅活功能性血管發(fā)生)和在腫瘤發(fā)生(其中在轉(zhuǎn)化后，促血管發(fā)生刺激物持續(xù)存在)很可能是不同的。
為了在不采用預先察覺或已知的生物系統(tǒng)的條件下分析很多參與血管發(fā)生的起始和維持的因子，我們采用了蛋白組方法。與時間上恒定的基因組相反，細胞特異性蛋白表達依賴于細胞內(nèi)和細胞外參數(shù)，并且保持顯著反應性和可變性。在血小板的情況下，我們需要使用高通量蛋白組分析如SELDI-ToF，所述血小板除了從巨核細胞中基因的可變剪接得到的復雜蛋白產(chǎn)物和血小板天然蛋白的翻譯后修飾外，其內(nèi)容物也反應于組織需要而改變。該技術迅速代替了常規(guī)的二維電泳和隨后的基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜(MALDI-MS)的組合(17；18)，因為它允許準確和可再現(xiàn)地分析實驗組內(nèi)和之間的血小板蛋白組。我們采用了確立的人脂肪肉瘤SW-872的非血管發(fā)生性(靜息)和血管發(fā)生性變體的模型(18)，其中血管發(fā)生驅(qū)動力的增加與從靜息的逃離相關。隨后，我們比較了注射了200μl無血清培養(yǎng)基(載體)或脂肪肉瘤細胞系的靜息或血管發(fā)生克隆的5×106個細胞的細胞懸浮液的5只小鼠的血小板和血漿蛋白組。非血管發(fā)生變體保持靜息80-100天，此時100％的腫瘤開始以與血管發(fā)生對應物相似的速度生長。比較了32天時的血小板和血漿蛋白譜，此時靜息腫瘤平均0.8-1mm3，它們的血管發(fā)生性對應物是18-30mm3。從該分析得到了兩個重要發(fā)現(xiàn)。首先，血漿樣品，即臨床監(jiān)測中最常測定的體液沒有發(fā)現(xiàn)血管發(fā)生蛋白譜中的任何顯著差異。令人感興趣的是，發(fā)現(xiàn)許多血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑在攜帶腫瘤的小鼠的血小板中差異表達。令人感興趣的是，圖21中選定蛋白表達圖的實例明確證明了這些因子在攜帶小的靜息腫瘤的小鼠血小板中相似的上調(diào)程度。這可能最初看起來是組成型的，但如果重新考慮我們以前推定的假設，即血小板增強局部血管發(fā)生，則可能提示血小板對靜息腫瘤分泌的相對小量蛋白的螯合可能隨后受到保護，避免血漿絲氨酸蛋白酶的降解，并且促進有效送遞到腫瘤生長部位。假注射對照、非血管發(fā)生性和血管發(fā)生性腫瘤的表達峰強度的統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)生長因子的血漿和血小板水平之間以及假注射動物和攜帶腫瘤的動物的血小板之間存在顯著差異。盡管靜息克隆中VEGF和bFGF的增加從未達到統(tǒng)計學顯著性，這一發(fā)現(xiàn)在三個獨立實驗中是一致的，并且早在腫瘤植入后19天就變得明顯(圖23C)。
如果血漿不作為血小板攜帶的調(diào)節(jié)劑分泌的中間相，可能需要推斷替代的機制。我們采用了VEGF的實例，即腫瘤發(fā)生的一種最重要的引發(fā)劑，并且在血小板活化之前、過程中和之后用免疫熒光檢測其細胞內(nèi)分布。在靜息血小板中，大多數(shù)VEGF定位于血小板的細胞內(nèi)、細胞質(zhì)部分(圖6，左下圖片)，沿著細胞膜移動到VEGF的環(huán)形排列(圖6，參見右下圖片的插圖)，然后沿著活化血小板的偽足(圖6，右下圖片)?；罨T導的血小板胞吐作用的模式更加表明血小板的細胞內(nèi)容物與組織的直接交換，而不是常規(guī)采用的血小板的細胞內(nèi)容物“釋放”到循環(huán)中。
此外，血小板相關血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑似乎受到“保護”而避免降解，因為它們在循環(huán)中比它們的血漿或血小板對應物持續(xù)更長時間。例如，即使在數(shù)分鐘內(nèi)就測量到了報道的VEGF的循環(huán)半衰期，由血小板從植入的Matrigel中挑選的125I標記的VEGF在循環(huán)中持續(xù)存在數(shù)日(數(shù)據(jù)未示出)。這可以解釋為什么在我們的大多數(shù)尋找在血清或血漿水平濃集的早期診斷或治療反應標志物的臨床試驗中迄今沒有產(chǎn)生任何顯著進展。甚至這些循環(huán)因子在愈后中的使用似乎限于鑒定具有大腫瘤體積并因此愈后很差的患者亞組。
基于我們的研究，我們提出(1)血小板直接攝取血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑，而各個蛋白的血漿水平?jīng)]有相應增加；(2)血小板保護這些調(diào)節(jié)劑免受絲氨酸蛋白酶的降解，導致它們的循環(huán)半衰期延長；和(3)血小板可以將這些生長因子送遞到活化的內(nèi)皮(腫瘤)部位，而不需要升高這些蛋白的血漿水平。這可以代表諸如傷口愈合的生理狀況下生長因子送遞的非常有效的機制，并且對嚴重應激或創(chuàng)傷過程中缺乏這些細胞因子的副作用提供解釋。以相同的方式，這種機制也可以提供具有在宿主中“寄生”并且避免用目前可獲得的臨床工具(19)進行的早期檢測的能力的腫瘤。
我們的數(shù)據(jù)表明，血小板能夠在癌癥發(fā)生的非常早期和靜息過程中“檢測”血管發(fā)生調(diào)節(jié)性蛋白要求，并且它們能夠通過選擇性“攝取”血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑而“應答”該要求。很可能這是血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑保持“受保護”而免受血漿蛋白酶降解的機制，因此可以以增加的濃度“送遞”到腫瘤部位。
結論 目前正在理解血小板送遞生長因子的靈活性和特異性，這可能是因為它們被認為是導致物而不是效應物。我們已經(jīng)證明血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑攝取到血小板中的過程是高度特異性的，反應了腫瘤狀態(tài)(即靜息與臨床擴展)，并且在臨床可檢測的腫瘤之前發(fā)生。系統(tǒng)循環(huán)中的這種新的區(qū)室(其中的生長因子受到保護而免受降解)的鑒定提供了用于早期癌癥診斷的穩(wěn)定、靈敏和可靠方法。此外，作為腫瘤發(fā)生的早期“記錄”的血小板的鑒定提示，它們應該被用于腫瘤生長的早期檢測。
令人感興趣的是，內(nèi)皮細胞生長的調(diào)節(jié)劑和/或血管發(fā)生的促進劑代表了由血小板運輸?shù)拇蠖鄶?shù)蛋白，該血小板中有限數(shù)目的其它蛋白被差異表達。
F4是第一種被發(fā)現(xiàn)并測序的趨化因子，其是血小板特異性的，并且僅僅在巨核細胞中合成。PF4并不像經(jīng)典趨化因子那樣起作用。與原型CXC趨化因子IL-8不同，它(1)不誘導白細胞趨化；(2)不導致溶酶體顆粒的脫顆粒；(3)通過IFA-1然后是MAC-1促進的IL-8附著導致更強的對內(nèi)皮的附著；和(4)是TNF-α存在下繼發(fā)顆粒胞吐作用的選擇性誘導劑(IL-8不具有的作用)(Brant et al，2000)。中性粒細胞反應于PF-4對內(nèi)皮的牢固粘附可以是在血液湍流存在下維持細胞-細胞接觸的系統(tǒng)，并且牢固粘附后胞吐作用的誘導可以使血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑避免被沖洗掉。
當三肽ELR存在于第一個CXC結構域之前時，CXCR趨化因子總體上是促血管發(fā)生的，但當該基序不存在時，是抗血管發(fā)生的(Strieter R，Polverini JBC 1995)。令人感興趣的是，全長四聚體(ELR陰性的)PF-4的施用抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移(Sharpe et al.，J Nat Can Inst1990 & Kolber et al.，J Nat Can Instit，1995)，其抗血管發(fā)生作用主要是由于干擾FGF-2和VEGF與其各自受體結合的能力(Perollet et al.，Blood 913289-3299，1998 & Gengrinovitch et al.，JBC 270，15059-15065，1995)。
最差異表達的蛋白之一是結締組織活化肽(CTAPIII，也稱作低親和力PF4)。CTAPIII、中性粒細胞活化肽-2(NAP-2)和β-血小板反應蛋白都通過蛋白水解產(chǎn)生自血小板堿性蛋白，其在攜帶靜息和血管發(fā)生性脂肪肉瘤的小鼠中的血小板中以高濃度存在。在人類脂肪肉瘤的靜息和血管發(fā)生性克隆中對該血小板相關乙酰肝素酶的水平增加的鑒定，支持了血小板乙酰肝素酶在癌癥的早期局部侵入以及維持腫瘤生長和轉(zhuǎn)移播散中的重要作用。
硫酸乙酰肝素，即CTAPIII的靶，是細胞外基質(zhì)和脈管系統(tǒng)基底層的一種重要成分，其作為轉(zhuǎn)移和炎性細胞向外侵入的屏障。令人感興趣的是，CTAPIII在pH5-7時起最佳作用(5.8時具有峰值最佳活性)，這使其成為在相對酸性的腫瘤環(huán)境中高度適合的乙酰肝素酶。
采用血小板的SELDI-ToF質(zhì)譜，我們發(fā)現(xiàn)可以用血小板的新特性檢測目前存在的診斷方法不能檢測到的顯微水平的腫瘤。血小板血管發(fā)生譜比單一生物標志物范圍更廣，因為它可以檢測多種腫瘤類型和腫瘤大小。血小板血管發(fā)生譜的相對改變使得能夠在腫瘤發(fā)展中對其運輸，所述發(fā)展從原位癌早期開始。
引入在此引用的參考文獻作為參考。
表1A血管發(fā)生的刺激劑

表1B血管發(fā)生的抑制劑

表2其它生物標志物


參考文獻1.Pinedo，H.M.，Verheul，H.M.，D’Amato，R.J.，and Folkman，J.1998.Involvementof platelets in tumour angiogenesis？Lancet 3521775-1777.
2.Banks，R.E.，F(xiàn)orbes，M.A.，Kinsey，S.E.，Stanley，A.，Ingham，E.，Walters，C.，andSelby，P.J.1998.Release of the angiogenic cytokine vascular endothelialgrowth factor(VEGF)from plateletssignificance for VEGF measurementsand cancer biology.Br.J.Cancer 77956-964.
3.Kim，H.K.，Song，K.S.，Park，Y.S.，Kang，Y.H.；Lee，Y.J.，Lee，K.R.，Kim，H.K.，Ryu，K.W.，Bae，J.M.，and Kim，S.2003.Elevated levels of circulating plateletmicroparticles，VEGF，IL-6 and RANTES in patients with gastric cancerpossible role of a metastasis predictor.Eur.J.Cancer 39184-191.
4.Karpatkin，S.2002.Tumor Growth and Metastasis.In Platelets.MichelsonA.D.，editor.Academic Press/Elsevier Sciences(USA).Amsterdam.491-502.
5.Matsuyama，W.，Hashiguchi，T.，Mizoguchi，A.，Iwami，F(xiàn).，Kawabata，M.，Arimura，K.，and Osame，M.2000.Serum levels of vascular endothelial growthfactor dependent on the stage progression of lung cancer.Chest 118948-951.
6.Poon，R.T.，Lau，C.P.，Cheung，S.T.，Yu，W.C.，and Fan，S.T.2003.Quantitativecorrelation of serum levels and tumor expression of vascular endothelialgrowth factor in patients with hepatocellular carcinoma.Cancer Res.633121-3126.
7.Hlatky，L.，Hahnfeldt，P.，and Folkman，J.2002.Clinical application ofantiangiogenic therapymicrovessel density，what it does and doesn’t tell us.JNatl.Cancer Inst.94883-893.
8.Karayiannakis，A.J.，Bolanaki，H.，Syrigos，K.N.，Asimakopoulos，B.，Polychronidis，A.，Anagnostoulis，S.，and Simopoulos，C.2003.Serum vascularendothelial growth factor levels in pancreatic cancer patients correlate withadvanced and metastatic disease and poor prognosis.Cancer Lett.194119-124.
9.Kim，T.K.，and Burgess，D.J.2002.Pharmacokinetic characterization of 14C-vasoular endothelial growth factor controlled release microspheres using a ratmodel.J Pharm.Pharmacol.54897-905.
10.Folkman，J.2003.Angiogenesis and proteins of the hemostatic system.J.Thromb.Haemost.11681-1682.
11.Ma，L.，Elliott，S.N.，Cirino，G.，Buret，A.，Ignarro，L.J.，and Wallace，J.L.2001.Platelets modulate gastric ulcer healingrole of endostatin and vascularendothelial growth factor release.Proc.Natl.Acad.sci.U.S.A986470-6475.
12.Nielsen，H.J.，Werther，K.，Mynster，T.，and Brunner，N.1999.Soluble vascularendothelial growth factor in various blood transfusion components.Transfusion 391078-1083.
13.Achilles，E.G.，F(xiàn)ernandez，A.，Allred，E.N.，Kisker，O.，Udagawa，T.，Beecken，W.D.，F(xiàn)lynn，E.，and Folkman，J.2001.Heterogeneity of angiogenicactivity in a human liposarcomaa proposed mechanism for″no take″ofhuman tumors in mice.J Natl.Cancer Inst.931075-1081.
14.Harrison，P.，Wilboum，B.，Debili，N.，Vainchenker，W.，Breton-Gorius，J.，Lawrie，A.S.，Masse，J.M.，Savidge，G.F.，and Ctamer，E.M.1989.Uptake ofplasma fibrinogen into the alpha granules of human megakaryocytes andplatelets.J Clin.Invest 84；1320-1324.
15.Handagama，P.，Scarborough，R.M.，Shuman，M.A.，and Bainton，D.F.1993.Endocytosis of fibrinogen into megakaryocyte and platelet alpha-granules ismediated by alpha IIb beta 3(glycoprotein IIb-IIIa).Blood 82135-138.
16.Handagama，P.J.，George，J.N.，Shuman，M.A.，McEver，R.P.，and Bainton，D.F.1987.Incorporation of a circulating protein into megakaryocyte and plateletgranules.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 84861-865.
17.Marcus，K.，Immler，D.，Sternberger，J.，and Meyer，H.E.2000.Identification ofplatelet proteins separated by two-dimensional gel electrophoresis andanalyzed by matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-massspectrometry and detection of tyrosine-phosphorylated proteins.Electrophoresis 212622-2636.
18.O’Neill，E.E.，Brock，C.J.，von Kriegsheim，A.F.，Pearce，A.C.，Dwek，R.A.，Watson，S.P.，and Hebestreit，H.F.2002.Towards complete analysis of theplateiet proteome.Proteomics.2288-305.
19.Broll，R.，Erdmann，H.，Duchrow，M.，Oevermann，E.，Schwandner，O.，Markert，U.，Bruch，H.P.，and Windhovel，U.2001.Vascular endothelial growthfactor(VEGF)-a valuable serum tumour marker in patients with colorectalcancer？Eur.J Surg.Oncol.2737-42.
20.Udagawa，T.，F(xiàn)emandez，A.，Achilles，E.G.，F(xiàn)olkman，J.，& D’Amato，R.J.Persistence of microscopic human cancers in micealterations in theangiogenic balance accompanies loss of tumor dormancy.FASEB.J 16，1361-1370(2002).
21.Gimbrone，M.A.，Jr.，Leapman，S.B.，Cotran，R.S.，& Folkman，J.Tumordormancy in vivo by prevention of neovascularization.J Exp.Med 136，261-276(1972).
22.Holmgren，L.，Oreilly，M.S.，& Folkman，J.Dormancy ofmicrometastasesbalanced proliferation and apoptosis in the presence ofangiogenesis suppression[see comments].Nat.Med.1，149-153(1995).
23.Roy，R.，Wewer，U.M.，Zurakowski，D.，Pories，S.E.，& Moses，M.A.ADAM 12 cleaves extracellular matrix proteins and correlates with cancerstatus and stage.J Biol.Chem.279，51323-51330(2004).
24.Folkman，J.& Kalluri，R.Cancer without disease.Nature 427，787(2004). 引入在此引用的參考文獻作為參考。
權利要求
1.檢測個體中的血管發(fā)生疾病或病癥的方法，包括以下步驟a.在第一時間點從所述個體分離血小板；b.分析所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；c.在第二時間點從所述個體分離血小板，所述第二時間點在所述第一時間點之后；d.分析來自所述第二時間點的所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；和e.將來自第一時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平與來自第二時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平進行比較，其中來自所述第二時間點的血小板中所述至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平增加或來自所述第二時間點的血小板中至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平減少，表示存在血管發(fā)生疾病或病癥。
2.檢測個體中的癌癥的方法，包括以下步驟a.在第一時間點從所述個體分離血小板；b.分析所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；c.在第二時間點從所述個體分離血小板，所述第二時間點在所述第一時間點之后；d.分析來自所述第二時間點的所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；和e.將來自第一時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平與來自第二時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平進行比較，其中來自所述第二時間點的血小板中所述至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平增加或來自所述第二時間點的血小板中至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平減少，表示存在癌癥。
3.治療患有血管發(fā)生疾病或病癥的個體的方法，包括以下步驟a.在第一時間點從所述個體分離血小板；b.分析所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；c.在第二時間點從所述個體分離血小板，所述第二時間點在所述第一時間點之后；d.分析來自所述第二時間點的所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；e.將來自第一時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平與來自第二時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平進行比較，其中來自所述第二時間點的血小板中所述至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平增加或來自所述第二時間點的血小板中至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平減少，表示存在血管發(fā)生疾病或病癥；和f.給表明具有血管發(fā)生疾病或病癥的個體施用治療。
4.權利要求3的方法，進一步包括(g)在第三時間點從所述個體分離血小板，所述第三時間點在所述第二時間點之后并且在治療開始之后；(h)分析來自所述第三時間點的所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；和(i)將來自第二時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平與來自所述第三時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平進行比較，其中與所述第二時間點的水平相比，來自所述第三時間點的血小板中所述至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平減少或來自所述第三時間點的血小板中至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平增加，表示治療有效。
5.權利要求1、2或3的方法，其中所述血小板分離自血液樣品。
6.權利要求1、2或3的方法，其中血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑選自VEGF-A(VPC)、VEGF-C、bFGF、HGF、促血管生成素-1、PDGF、EGF、IGF-1、IGF BP-3、BDNF、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、玻連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、乙酰肝素酶和鞘氨醇-1 PO4。
7.權利要求1、2或3的方法，其中血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑選自PF-4、血小板反應蛋白-1和2、HGF的NK1、NK2、NK3片段、TGF-β-1、纖維蛋白原(制管張素)、纖維蛋白原激活劑抑制劑1、α-2抗纖溶酶及其片段、α-2巨球蛋白、金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMPs)、β-血小板球蛋白、內(nèi)皮抑制素、腫瘤抑制素和可溶性VEGFR2。
8.權利要求1、2或3的方法，其中用選自下組的方法分析血小板中至少一種血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的存在蛋白陣列、ELISA、蛋白印跡、表面增強激光解吸電離譜(SELDI)和質(zhì)譜法。
9.權利要求1、2或3的方法，其中個體具有對癌癥的遺傳傾向。
10.權利要求9的方法，其中對癌癥的遺傳傾向是腫瘤阻抑基因的突變。
11.權利要求10的方法，其中腫瘤阻抑基因選自BRCAl、BRCA2、p53、p10、LKBl、MSH2和WTl。
12.權利要求1、2或3的方法，其中個體以前進行過癌癥或血管發(fā)生疾病或病癥的治療。
13.權利要求1、2或3的方法，其中個體被認為是健康、無病個體。
14.權利要求1、2或3的方法，其中所述第二時間點是所述第一時間點后至少1個月。
15.權利要求1、2或3的方法，其中所述第二時間點是所述第一時間點后至少2個月。
16.權利要求1、2或3的方法，其中所述第二時間點是所述第一時間點后至少6個月。
17.權利要求1、2或3的方法，其中所述第二時間點是所述第一時間點后至少10個月。
18.權利要求1、2或3的方法，其中所述第二時間點是所述第一時間點后至少1年。l9.權利要求1、2或3的方法，其中癌癥選自胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系統(tǒng)癌和膀胱癌。
20.權利要求3的方法，其中所述治療選自血管發(fā)生抑制劑、放療、化療和手術治療。
21.權利要求20的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑選自制管張素、Bevacizumab(Avastin)、美替克侖、Canstatin、Caplostatin、Combretastatin、內(nèi)皮抑制素、NM-3、血小板反應蛋白、腫瘤抑制素、2-甲氧基雌二醇、Vitaxin、ZD1839(Iressa)、ZD6474、OSI774(Tarceva)、CI1033、PKI1666、IMC225(Erbitux)、PTK787、SU6668、SU11248、Herceptin和IFN-α、CELEBREX(塞來昔布)、THALOMID(沙立度胺)和IFN-α。
22.權利要求2和3的方法，其中所述血管發(fā)生疾病或病癥選自視網(wǎng)膜病、糖尿病視網(wǎng)膜病、黃斑變性、再狹窄、炎性疾病、關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎、牛皮癬、克隆氏病、良性腫瘤、血管瘤、神經(jīng)纖維瘤和肉芽腫。
23.檢測個體中的血管發(fā)生疾病或病癥的方法，包括以下步驟a.從個體分離血小板；b.分析所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；和e.將來自個體的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平與來自標準物的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平進行比較，其中與標準物相比，來自個體的血小板中所述至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平增加或來自個體的血小板中所述至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平減少，表示存在血管發(fā)生疾病或病癥。
24.權利要求23的方法，進一步包括給表明具有血管發(fā)生疾病或病癥的個體施用治療。
25.權利要求23的方法，其中血管發(fā)生疾病或病癥選自胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系統(tǒng)癌、膀胱癌、視網(wǎng)膜病、糖尿病視網(wǎng)膜病、黃斑變性、再狹窄、炎性疾病、關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎、牛皮癬、克隆氏病、良性腫瘤、血管瘤、神經(jīng)纖維瘤和肉芽腫。
26.確定抗血管發(fā)生治療在個體中有效的可能性的方法，包括a.在第一時間點從個體分離血小板；b.分析所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；c.給所述個體施用抗血管發(fā)生治療；d.在第二時間點從所述個體分離血小板，所述第二時間點在所述第一時間點之后并且在治療開始之后；e.分析來自所述第二時間點的所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；和f.將來自第一時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平與來自所述第二時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平進行比較，其中來自所述第二時間點的血小板中所述至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平減少或來自所述第二時間點的血小板中至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平增加，表示治療有效。
27.確定測試治療在調(diào)節(jié)血小板血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平中的有效性的方法，包括a.在第一時間點從宿主分離血小板；b.分析所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；c.給所述宿主施用測試治療；d.在第二時間點從所述宿主分離血小板，所述第二時間點在所述第一時間點之后并且在測試治療開始之后；e.分析來自所述第二時間點的所述血小板，得到至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑或至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平；和f.將來自第一時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平與來自所述第二時間點的所述血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平進行比較，其中來自所述第二時間點的血小板中所述至少一種血管發(fā)生正調(diào)節(jié)劑的水平減少或來自所述第二時間點的血小板中至少一種血管發(fā)生負調(diào)節(jié)劑的水平增加，表明測試治療在調(diào)節(jié)血小板血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑水平中的有效性。
28.權利要求27的方法，進一步包括確定哪些血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑受到了調(diào)節(jié)。
29.建立血管發(fā)生疾病或病癥的血小板記錄或血小板譜的方法，包括a.從兩組個體分離血小板，一組患有已知的血管發(fā)生疾病或病癥(血管發(fā)生組)，第二組沒有血管發(fā)生疾病或病癥(對照組)；b.分析來自血管發(fā)生組和對照組的所述血小板，得到血小板相關生物標志物的水平；c.計算每組中每種血小板相關生物標志物的平均水平；d.評估每組中的生物標志物以確定差異；和e.建立特定血管發(fā)生疾病或病癥的血小板記錄，其中該記錄是在血管發(fā)生組與對照組中差異表達的生物標志物列表。
30.權利要求28的方法，其中血管發(fā)生疾病或病癥選自胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系統(tǒng)癌、膀胱癌、視網(wǎng)膜病、糖尿病視網(wǎng)膜病、黃斑變性、再狹窄、炎性疾病、關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎、牛皮癬、克隆氏病、良性腫瘤、血管瘤、神經(jīng)纖維瘤和肉芽腫。
31.檢測個體中的血管發(fā)生疾病或病癥的方法，包括以下步驟a.在第一時間點從所述個體分離血小板；b.分析所述血小板，得到至少一種血小板相關生物標志物的水平；c.在第二時間點從所述個體分離血小板，所述第二時間點在所述第一時間點之后；d.分析來自所述第二時間點的血小板，得到至少一種血小板相關生物標志物的水平；和e.將來自第一時間點的所述血小板相關生物標志物水平與來自第二時間點的所述血小板相關生物標志物水平進行比較，其中來自所述第二時間點的血小板中所述血小板生物標志物的水平增加或減少，表示存在血管發(fā)生疾病或病癥。
32.權利要求31的方法，進一步包括給表明具有血管發(fā)生疾病或病癥的個體施用治療。
33.權利要求31的方法，其中血管發(fā)生疾病或病癥選自胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系統(tǒng)癌、膀胱癌、視網(wǎng)膜病、糖尿病視網(wǎng)膜病、黃斑變性、再狹窄、炎性疾病、關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎、牛皮癬、克隆氏病、良性腫瘤、血管瘤、神經(jīng)纖維瘤和肉芽腫。
34.監(jiān)測進行治療的患有血管發(fā)生疾病或病癥的個體中治療的有效性的方法，包括a.在第一時間點從正在進行血管發(fā)生疾病或病癥治療的個體分離血小板；b.分析所述血小板，得到至少一種血小板相關生物標志物的水平；c.在第二時間點從所述個體分離血小板，所述第二時間點在所述第一時間點之后；d.分析來自所述第二時間點的所述血小板，得到至少一種血小板相關生物標志物的水平；和e.將來自第一時間點的所述血小板相關生物標志物水平與來自第二時間點的所述血小板相關生物標志物水平進行比較，其中來自所述第二時間點的血小板中所述血小板生物標志物的水平增加或減少，表示治療有效。
全文摘要
本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，血小板能螯合血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑，并且防止它們降解。因此，通過分析血小板中的血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑，目前可以檢測血管發(fā)生活性，甚至在早期階段也可以檢測。通過監(jiān)測血管發(fā)生活性的改變，可以預測癌癥或其它血管發(fā)生疾病或病癥的存在。
文檔編號C12Q1/00GK1977049SQ200580021307
公開日2007年6月6日 申請日期2005年4月26日 優(yōu)先權日2004年4月26日
發(fā)明者J·福爾克曼, G·克萊門特 申請人:兒童醫(yī)療中心有限公司