本發(fā)明涉及食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種食品中磺胺嘧啶的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

磺胺嘧啶，又名n-2-嘧啶基-4-氨基苯磺酰胺，其結(jié)構(gòu)為：

磺胺嘧啶是使用量最大的磺胺類藥物之一，抗菌作用強，作為獸藥中的抗菌藥，常被摻雜到詞料中，用于治療動物的感染性疾病?；前粪奏さ牟缓侠硎褂?，使其成為殘留問題最嚴重的獸藥。人們長期使用含有此類藥物的動物源性食品，會使得機體內(nèi)的正常菌體產(chǎn)生耐藥性或者引起人們中毒、過敏反應(yīng)，甚至引起癌癥的發(fā)生?；前粪奏さ臍埩袅恳呀?jīng)受到各國重視。因此，國內(nèi)外對磺胺類藥物在肉類及乳制品中的允許殘留量限制為100μg/kg，其中日本要求的最高殘限制量更為嚴格，單個磺胺類藥物殘留限制量為20μg/kg，最大殘留總量不得超過100μg/kg。

目前，檢測磺胺嘧啶的方法有高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金法。其中，液相色譜分析法缺乏高靈敏的檢測器，儀器操作繁瑣，前處理復(fù)雜，耗時。酶聯(lián)免疫方法，采用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記物，其酶標記物易失活，顯色底物見光易分解，靈敏度低，對結(jié)構(gòu)類似的化合物具有一定的交叉反應(yīng)，造成測試結(jié)果不準確。

cn1766631a（2006.05）采用酶聯(lián)免疫法對動物組織、蜂蜜、尿液和牛奶進行了磺胺類藥物進行檢測，其試劑盒是以競爭性酶聯(lián)反應(yīng)為檢測原理，以磺胺類藥物抗原或抗體包被酶標板，反應(yīng)后通過顯色測od值來判定結(jié)果，容易造成測試結(jié)果不準確，并且其靈敏度低，操作過程繁瑣。

cn1807601a（2006.08）采用膠體金法檢測組織、蜂蜜、牛奶和雞蛋樣品中磺胺嘧啶的殘留量，其試劑盒最后檢測結(jié)果是以肉眼可見的顏色進行表征，誤差較大，并且操作繁瑣，流程較多，更易出現(xiàn)誤差，造成測試結(jié)果不準確。而本公司開發(fā)的一種磺胺嘧啶化學(xué)發(fā)光試劑盒，采用吖啶酯作為標記物，具有檢測穩(wěn)定、測量快速、靈敏度高的優(yōu)點。

化學(xué)發(fā)光方法較其他方法的優(yōu)點在于檢測的簡單性。

該體系采用磁分離體系，吖啶酯標記的化學(xué)發(fā)光技術(shù)進行檢測的優(yōu)點是：吖啶酯作為發(fā)光劑不需催化劑的存在，在有過氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光；吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗體結(jié)合位點，可提高系統(tǒng)整體靈敏度，反應(yīng)迅速；背景低、信噪比高，是一類有效的化學(xué)發(fā)光標記物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定、檢測速度快、具有較高靈敏度和特異性的免疫磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測方法，為食品中檢測磺胺嘧啶提供便利。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

在反應(yīng)杯中加入一定量的待測樣本，然后加入磁顆粒偶聯(lián)懸浮液和吖啶酯標記物，混勻，于37℃孵育數(shù)分鐘，最后分離、洗滌，加入化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液a和激發(fā)液b，測定相應(yīng)的發(fā)光強度，對照磺胺嘧啶檢測標準曲線，獲得待測樣中的磺胺嘧啶的濃度。

本發(fā)明中的化學(xué)發(fā)光標記物為吖啶酯，如nsp-dmae-nhs、nsp-sa-nhs等。

本發(fā)明中的吖啶酯標記物包含：吖啶酯標記的是磺胺嘧啶抗原或抗體，其中吖啶酯溶液的濃度范圍為2-85mmol/l，其優(yōu)選濃度為6.5mmol/l。

本發(fā)明中緩沖液是ph4.5-6.5，濃度為0.1mol/l，經(jīng)過0.22μm濾器過濾的mes緩沖液。

本發(fā)明中所述的磺胺嘧啶系列校準品濃度分別為：0μg/l、0.02μg/l、0.12μg/l、0.72μg/l、4.32μg/l、26.0μg/l，其緩沖液是含有0.5-5.0%bsa和0.1-0.5%pc300的tris-hcl。

本發(fā)明中的化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液a為：h2o2和hno3的混合液，其中h2o2的質(zhì)量分數(shù)為0.05-5%mol/l，hno3濃度為0.05-2.5mol/l。

本發(fā)明中的化學(xué)發(fā)光激發(fā)液b為：tritonx-100和naoh的混合液，其中tritonx-100的濃度為0.05-2.0mol/l，naoh的濃度為0.05-1.0mol/l。

本發(fā)明中的清洗液為：ph7.0-9.0、濃度為5.0-50.0mmol/l的tris-hcl溶液，其中含濃度為0.05-0.50mol/l的nacl及0.01-0.25%tween-20。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明的試劑盒穩(wěn)定、檢測快、靈敏度高和特異性好。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明中的技術(shù)方案進行清楚、詳細的闡述。實例中實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

實施例1：試劑盒1的組建及其具體組分的制備

1.試劑盒的組建

一種磺胺嘧啶的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，使其含有下列組分：

吖啶酯標記的磺胺嘧啶抗原；

羧基磁珠偶聯(lián)磺胺嘧啶抗體；

化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液a和化學(xué)發(fā)光激發(fā)液b；

磺胺嘧啶系列標準品溶液，標準品濃度分別為：0μg/l、0.02μg/l、0.12μg/l、0.72μg/l、4.32μg/l、26.0μg/l，其緩沖液是含有0.5-5.0%bsa和0.1-0.5%pc300的tris-hcl；

清洗液，具體為ph7.2、濃度為25mmol/l的tris-hcl溶液，其中含濃度為0.15mol/l的nacl及0.05%tween-20。

2.磁珠偶聯(lián)抗體的制備

（1）取1mg羧基磁微粒于0.5ml離心管中，加入一定量0.1mol/l的mes緩沖液，渦旋混勻，置于磁力架上，靜置5min使磁微粒與液體分開，棄去上清液，洗滌3次，再加入一定量mes（ph值為6.0）緩沖液，渦旋。

（2）加入15μl（15μg）磺胺嘧啶抗體，渦旋，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)管，室溫孵育30min。

（3）加入10μl濃度為10mg/ml的偶聯(lián)試劑edc渦旋，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)管，室溫孵育2h。

（4）去上清液，加入一定量的清洗緩沖液（tbs+0.05%tween-20），洗滌3次。

（5）用含1%bsa的緩沖液進行封閉，反復(fù)封閉4次，每次10min。將該磁微粒混懸液置于2-8℃保存。

3.mes緩沖液的配制（0.1mol/l）

取19.52g的mes固體，溶于500ml的去離子水中，用1mol/l的naoh調(diào)節(jié)到ph為6.0；把調(diào)好的溶液轉(zhuǎn)移到1l的容量瓶中，定容。

4.偶聯(lián)試劑edc的配制（濃度為10mg/ml）

取1g的edc于50ml的燒杯中，加入預(yù)冷的mes緩沖液，攪拌，待其溶解轉(zhuǎn)移至100ml的容量瓶中，定容。

5.tbs-t緩沖液的配制（濃度為25mmol/l）

稱量3.05g的tris，8.775g的nacl至500ml的燒杯中，加入1ml的0.05%tween-20，磁力攪拌的條件下用6mol/l的hcl調(diào)節(jié)ph為7.2，移至1000ml的容量瓶中，定容。

6.吖啶酯標記抗原的制備

（1）將一定量的磺胺嘧啶置于透析袋中，并將透析袋置于不小于1l的標記緩沖液中透析，期間緩沖液至少更換3次，最后一次透析過夜，標記緩沖液是ph9.5、濃度為0.1mol/l的na2co3-nahco3緩沖液。

（2）稱取1.7mg的吖啶酯nsp-dmae-nhs，溶于447μl無水二甲基甲酰胺dmf中，配成6.5mmol/l的nsp-dmae-nhsdmf溶液。

（3）將透析后的抗原溶液置于500μl離心管內(nèi)，加入一定量6.5mmol/l的nsp-dmae-nhsdmf溶液，吖啶酯與抗原的摩爾比值為10:1，加入200μl標記緩沖液，室溫反應(yīng)45min，加入10g/l賴氨酸100μl，繼續(xù)反應(yīng)15min，使標記反應(yīng)終止。

（4）標記物nsp-dmae-nhs-ag與游離nsp-dmae-nhs通過sephadexg-50柱（1×25cm）分離，用純化緩沖液ph6.3、濃度為0.1mol/l的pbs平衡并淋洗層析柱。

（5）分離過程中用色譜儀檢測蛋白峰，分別測量流出液的化學(xué)發(fā)光強度和280nm吸光度值。

（6）收集光度值高且吸光度大的洗脫液，加入1%bsa（體積）后分裝冰凍保存。

7.透析緩沖液的制備（ph為9.5、濃度為0.1mol/l的na2co3-nahco3）

a液（0.1mol/l，na2co3）：取10.62g的na2co3加蒸餾水至1l，

b液（0.1mol/l，nahco3）：取8.4g的nahco3加蒸餾水至1l，

取a液3ml，b液7ml混合，即a液：b液=3:7的比例混合。

8.化學(xué)發(fā)光激發(fā)液a、b的制備

（1）化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液a由h2o2和hno3組成。其中，h2o2質(zhì)量分數(shù)為1.5%，hno3濃度為0.1mol/l，用棕色瓶分裝成20ml/支，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）化學(xué)發(fā)光激發(fā)液b由tritonx-100和naoh的混合液組成。其中，tritonx-100濃度為0.1mol/l，naoh濃度為0.35mol/l，用棕色瓶分裝成20ml/支，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2：試劑盒2的組建及其組分的制備

1.試劑盒的組建

一種磺胺嘧啶的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，使其含有下列組分：

吖啶酯標記的磺胺嘧啶抗體；

羧基磁珠偶聯(lián)磺胺嘧啶抗原；

化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液a和化學(xué)發(fā)光激發(fā)液b；

磺胺嘧啶系列標準品溶液，標準品濃度分別為：0μg/l、0.02μg/l、0.12μg/l、0.72μg/l、4.32μg/l、26.0μg/l，其緩沖液是含有0.5-5.0%bsa和0.1-0.5%pc300的tris-hcl；

清洗液，具體為ph7.2、濃度為25mmol/l的tris-hcl溶液，其中含濃度為0.15mol/l的nacl及0.05%tween-20。

2.磁珠偶聯(lián)抗原的制備

（1）取1mg羧基磁微粒于0.5ml離心管中，加入一定量0.1mol/l的mes緩沖液，渦旋混勻，置于磁力架上，靜置5min使磁微粒與液體分開，棄去上清液，洗滌3次，再加入一定量mes（ph值為5.0）緩沖液，渦旋。

（2）加入18μl（18μg）的磺胺嘧啶抗原，渦旋，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)管，室溫孵育30min。

（3）加入10μl濃度為10mg/ml的偶聯(lián)試劑edc渦旋，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)管，室溫孵育2h。

（4）去上清液，加入200μl的清洗緩沖液（tbs+0.05%tween-20），洗滌3次。

（5）用含1%bsa的緩沖液進行封閉，反復(fù)封閉4次，每次10min。將該磁微?；鞈乙褐糜?-8℃保存。

3.吖啶酯標記抗體的制備

（1）將一定量的磺胺嘧啶抗體置于透析袋中，并將透析袋置于不小于1l的標記緩沖液中透析，期間緩沖液至少更換3次，最后一次透析過夜，標記緩沖液是ph值為10.1、濃度為0.1mol/l的na2co3-nahco3緩沖液。

（2）稱取1.7mg的吖啶酯nsp-dmae-nhs，溶于447μl無水二甲基甲酰胺dmf中，配成6.5mmol/l的nsp-dmae-nhsdmf溶液。

（3）將透析后的抗體溶液置于500μl離心管內(nèi)，加入一定量6.5mmol/l的nsp-dmae-nhsdmf溶液，吖啶酯與抗體的摩爾比值為7.4:1，加入200μl標記緩沖液，室溫下反應(yīng)45min，加入10g/l賴氨酸100μl，繼續(xù)反應(yīng)15min，使標記反應(yīng)終止。

（4）標記物nsp-dmae-nhs-ab與游離nsp-dmae-nhs通過sephadexg-50柱（1×25cm）分離，用純化緩沖液ph值為6.3、濃度為0.1mol/l的pbs平衡并淋洗層析柱。

（5）分離過程中用色譜儀檢測蛋白峰，分別測量流出液的化學(xué)發(fā)光強度和280nm吸光度值。

（6）收集光度值高且吸光度大的洗脫液，加入1%bsa（體積）后分裝冰凍保存。

實施例3：試劑盒的檢測

1.樣本前處理

（1）牛奶檢測樣本溶液的獲得：取新鮮牛奶150μl于500μl離心管中，4℃離心10min（3000r/min），棄去上層脂肪。移取離心后的牛奶樣本25μl于干凈的玻璃試管中，加入950μl濃度為0.02mol/l的磷酸鹽緩沖液進行稀釋。

（2）取蜂蜜1g加入25ml離心管中，加入2ml0.5mol/l鹽酸溶液，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解，于55-75℃的熱水中溫?zé)釘?shù)分鐘，加入5ml濃度為0.2mol/l的氫氧化鈉，調(diào)節(jié)ph值范圍為4.0-6.0，振蕩混勻。加入8ml乙酸乙酯，上下翻轉(zhuǎn)振蕩5min后，離心10min（3000r/min）。取上層有機溶劑5ml與干凈的玻璃管中，于空氣中吹干，滴加0.5ml濃度為0.02mol/l磷酸鹽緩沖液，混勻，待檢。

2.反應(yīng)過程

（1）將待測樣本100μl、偶聯(lián)磁微?；鞈乙?50μl、吖啶酯標記物150μl，依次加入反應(yīng)管中，振蕩混勻，37℃孵育15min。

（2）分離、洗滌5次。

（3）將洗滌后的反應(yīng)容器充分振蕩使磁微粒分散均勻。

（4）加入100μl化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液a，1s后加入100μl化學(xué)發(fā)光激發(fā)液b，測量其相對發(fā)光強度，樣本中磺胺嘧啶的含量與其發(fā)光強度成一定比例關(guān)系。

實施例4：試劑盒的性能指標

（1）試劑盒的靈敏度

對零標準溶液進行20次重復(fù)測試，取零標準溶液測定的平均值加上3倍的標準偏差，即為本試劑盒的靈敏度。本試劑盒對磺胺嘧啶的靈敏度為0.030μg/l。

（2）試劑盒的特異性

與磺胺嘧啶結(jié)構(gòu)或功能相似的競爭藥物：磺胺二甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺喹惡琳。按試劑盒步驟操作，分別加入：磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺喹惡琳，制作抑制曲線，根據(jù)線性方程計算各藥物的50%抑制濃度。交叉反應(yīng)率即為抗體對磺胺嘧啶的ic50與抗體對磺胺嘧啶競爭物的ic50之比的百分數(shù)。結(jié)果顯示：試劑盒對磺胺嘧啶具有較高的特異性，對與磺胺嘧啶結(jié)構(gòu)或者功能相似的競爭藥物均無交叉反應(yīng)。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。