本發(fā)明涉及一種乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢測，尤其是涉及anti-epcam在乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢測試劑及試劑盒方面的應(yīng)用，屬于生物檢測試劑領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在歐美及我國許多大中城市都占女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位。腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是乳腺癌重要的預(yù)后因素之一，同時(shí)在很大程度上決定著乳腺癌輔助治療的決策。目前臨床上對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的評估均需要有創(chuàng)手術(shù)或操作來進(jìn)行的，包括腋窩淋巴結(jié)清掃和腋窩前哨淋巴結(jié)活檢等。對于淋巴結(jié)沒有轉(zhuǎn)移的早期乳腺癌患者，這些有創(chuàng)評估方式會(huì)帶來上肢水腫、功能障礙等諸多并發(fā)癥，發(fā)生率在20％-30％之間。隨著社會(huì)對乳腺癌的重視以及乳腺癌篩查的推廣，早期乳腺癌診斷比例越來越高。如果能在術(shù)前進(jìn)行無創(chuàng)的腋窩淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移情況評估，可以使腋窩陰性的患者避免行腋窩手術(shù)，大大降低術(shù)后并發(fā)癥的的發(fā)生。但是目前臨床上的各無創(chuàng)的項(xiàng)影像學(xué)檢查都是以形態(tài)學(xué)改變?yōu)樵\斷依據(jù)的，因此都不能夠精確、準(zhǔn)確的判斷淋巴結(jié)內(nèi)是否存在少量腫瘤細(xì)胞。因此這些無創(chuàng)檢查都不能作為乳腺癌淋巴結(jié)評估的標(biāo)準(zhǔn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種能夠快速準(zhǔn)確檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的診斷試劑。

在眾多的腫瘤特異性表達(dá)抗原中，本發(fā)明人篩選得到一種抗原epcam(epithelialcelladhesionmolecule，上皮細(xì)胞粘附分子)。epcam是一種跨膜糖蛋白，也是腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)志物，在多種上皮惡性腫瘤中高表達(dá)，通過上調(diào)c-myc、cyclina/e等基因的表達(dá)，直接刺激細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在生理情況下，epcam不同程度低表達(dá)除鱗狀上皮細(xì)胞之外所有的正常上皮細(xì)胞中，且多位于細(xì)胞間緊密連接處，在結(jié)締組織及造血系統(tǒng)來源的細(xì)胞、腦組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞中缺乏明顯的epcam的表達(dá)。病例情況下，epcam幾乎表達(dá)于所有的腺癌中，包括結(jié)直腸腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝細(xì)胞癌和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。

本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，用可以在體外檢測的信號(近紅外熒光)對anti-epcam進(jìn)行標(biāo)記，利用抗原抗體反應(yīng)實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物與腫瘤的特異性結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)對乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的快速檢測。

因此，本發(fā)明的再一目的在于提供抗上皮細(xì)胞粘附分子抗體(anti-epcam)在用于制備檢測乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

在用本發(fā)明所述anti-epcam進(jìn)行乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行檢測時(shí)，優(yōu)選的是，將所述anti-epcam預(yù)先通過熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，所用的熒光染料可以是選自cy系列熒光染料、異硫氰酸熒光素、四甲基異硫氰酸羅丹明、tritc及2乙基羅丹明，優(yōu)選cy系列熒光染料如cy7熒光染料，如cy7標(biāo)記的epcam單克隆抗體(anti-epcam/cy7)。

進(jìn)行乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行檢測時(shí)，所述的乳腺癌類型優(yōu)選的是乳腺癌選自上皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)陽性，但在淋巴結(jié)中上皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)陰性的乳腺癌。

在進(jìn)行乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行檢測時(shí)，可以是對乳腺癌患者上切除的淋巴結(jié)進(jìn)行檢測，也可以將本發(fā)明將本發(fā)明所述標(biāo)記的anti-epcam注射在腫瘤患者附近的乳腺間質(zhì)內(nèi)，通過腫瘤周圍的淋巴組織引流至腋窩淋巴結(jié)，依據(jù)淋巴結(jié)內(nèi)殘留熒光顯影判斷淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移情況，通過腫瘤靶向顯像，實(shí)現(xiàn)淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移情況的無創(chuàng)評估。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用vx2細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，證實(shí)anti-epcam/cy7與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合。

在本發(fā)明的再一實(shí)施例中，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中排除了anti-epcam/cy7非特異性結(jié)合，在健康新西蘭兔中注射anti-epcam/cy7，30小時(shí)候淋巴結(jié)中未見熒光顯影，熒光消失。

本發(fā)明在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了anti-epcam/cy7能夠與腋窩淋巴結(jié)內(nèi)的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，在動(dòng)物模型上實(shí)現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移情況的無創(chuàng)評估。具體步驟如下：使用vx2細(xì)胞接種于新西蘭白兔乳房內(nèi)，飼養(yǎng)4周后建立乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。以vx2模型兔為實(shí)驗(yàn)組，正常新西蘭兔為對照組，應(yīng)用anti-epcam/cy7作為靶向成像探針檢測腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并與病理結(jié)果進(jìn)行對照。結(jié)果表明體外熒光成像無創(chuàng)評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性為100％(13/13)，假陰性率0％(0/13)；特異性為90.0％(9/10)，假陽性率為10.0％(1/10)。證實(shí)利用熒光標(biāo)記腫瘤特異性抗體可用于乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的無創(chuàng)檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明anti-epcam/cy7在體外與腫瘤細(xì)胞及淋巴組織顯影圖，其中a為vx2腫瘤細(xì)胞顯影，b為淋巴結(jié)組織不顯影。

圖2為本發(fā)明anti-epcam/cy7在健康及荷瘤兔上的腋窩淋巴結(jié)顯影情況，其中is表示注射部位，a-c依此為正常新西蘭兔2、24、30小時(shí)后的淋巴結(jié)顯影，d-f依此為荷瘤模型兔2、24、30小時(shí)后的淋巴結(jié)顯影；

具體實(shí)施方式

材料：熒光標(biāo)記腫瘤特異性抗體anti-epcam/cy7：10umol/l購自上海瑞齊生物制劑有限公司；

vx2荷瘤兔購自武漢科技大學(xué)介入實(shí)驗(yàn)室；

新西蘭白兔：購自北京永欣康泰科技發(fā)展有限公司。

實(shí)施例1anti-epcam/cy7與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組vx2細(xì)胞進(jìn)行anti-epcam預(yù)處理，對照組淋巴組織進(jìn)行igg預(yù)處理，徹底洗脫后加入anti-epcam/cy7進(jìn)行細(xì)胞熒光免疫實(shí)驗(yàn)。圖1結(jié)果證實(shí)anti-epcam/cy7能夠與vx2腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，而正常淋巴結(jié)組織沒有非特異性結(jié)合。

實(shí)施例2乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢測

乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立：無菌切除vx2荷瘤兔后腿腫瘤，剔除腫瘤包膜并切細(xì)塊，組織塊在無菌不銹鋼網(wǎng)上研磨和過篩，收集組織懸液，無菌生理鹽水沖洗三遍，5ml注射器抽取備用。將組織懸液注射于試驗(yàn)用12只實(shí)驗(yàn)組新西蘭白兔胸前第二對乳墊，每個(gè)注射部位0.5ml。種植后檢測腫瘤生長，4周后全部種植瘤成活，平均直徑1.5cm。

腋窩淋巴結(jié)體外熒光成像：將10umol/l、0.1mlanti-epcam/cy7分別皮內(nèi)注射至12只荷瘤模型兔及12只對照正常新西蘭兔第二對乳房，局部按摩。關(guān)閉手術(shù)燈，使用體外熒光成像儀進(jìn)行近紅外熒光成像，連續(xù)觀察至注射后30小時(shí)并記錄腋窩淋巴結(jié)顯影情況。圖2結(jié)果表明，正常新西蘭圖的淋巴結(jié)熒光顯影在24h后變得極為微弱，30小時(shí)候基本消失，而荷瘤模型兔30h后仍然顯示清晰的熒光顯影。

病理檢查：將全部淋巴結(jié)體外熒光顯影情況進(jìn)行記錄，然后逐一切除分別標(biāo)記后送病理檢查。

結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組12只模型兔24側(cè)腋窩淋巴結(jié)，23側(cè)成功顯影，1側(cè)顯影失敗，顯影成功率為95.8％(23/24)。實(shí)驗(yàn)組顯影成功的23側(cè)腋窩淋巴結(jié)，其中13側(cè)淋巴結(jié)熒光檢測為陽性，9側(cè)淋巴結(jié)熒光檢測為陰性，與病理檢測結(jié)果一致。一側(cè)淋巴結(jié)熒光檢測為陽性，病理檢測為陰性，為假陽性結(jié)果。熒光單抗用于檢測腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的病理符合率為95.6％(22/23)。